研究蛋白质与DNA相互作用

1、 、凝胶阻滞试验 1. 试验原理 乂叫作DNAff移率变动试验(DNA mobility shift assay ),在凝胶电泳中， 由于电场的作用，裸露的DN醐正电极移动的距离与其分子量的对数成反比。 如 果此时DN的子与某种蛋白质结合，那么，由于分子量增大，它在凝胶中的迁移 作用便会受到阻滞，在特定电压和时间内朝正电极移动的距离也就相应缩短了。 2. 主要步骤及内容 首先是用放射性同位素标记待检测的 DN段(亦称探针DNA)然后同细胞蛋白 质提取物一道温育，于是便有可能形成 DNA蛋白质复合物。将它加样到非变性 的聚丙烯酰胺凝胶中，在控制使蛋白质仍与DNA呆持结合状态的条件下进行电泳 别离

2、。应用放射自显影技术显现具放射性标记的 DN燎带位置。如果细胞蛋白质 提取物中不存在可同放射性标记的探针 DNA吉合的蛋白质，那么所有放射性标记 都将集中出现在凝胶的底部，反之,将会形成 DNA蛋白质复合物，由于凝胶阻 滞的缘故，其特有的放射性标记的探针 DN软带就将滞后出现在较靠近凝胶顶部 的位置。 凝胶阻滞试验不仅可以用来鉴定在特殊类型细胞的提取物中，是否存在着能 够同某一特定DNM段结合的蛋白质分子(比方特异的转录因子等)，而且还可以 用来研究发生此种结合作用之精确的 DNAff列的特异性。 其方法是在DNA蛋白质结合反响体系中，参加超量的非标记的竞争 DNA(competitor DN

3、A)如果它与同位素标记的探针 DNA吉合的是同一种蛋白质， 那么由于竞争DNM探针DNAffi比是极大超量的，这样绝大局部蛋白质都会被其 竞争结合掉而使探针DN砒处于自由的状态，所以在电泳凝胶的放射自显影图片 上就不会出现阻滞的条带。相反地，如果反响中参加的竞争DNM不能够同探针 DN砒争结合同一种蛋白质，于是探针DNAM仍然与特定蛋白质结合形成复合物， 结果在电泳凝胶的放射自显影图片上就会呈现阻滞的条带。 在凝胶阻滞试验中使用竞争DNA可以间接地说明在体内发生的 DNAW蛋白 质之间的相互作用。例如，使用一种具有转录因子结合位点的竞争 DNA我 们就可以判断通过特定的凝胶阻滞试验所检测到的蛋

4、白质，是否就是届于此类转 录因子，抑或是与之相关的其它因子。同样地，假设我们在竞争DNAk的转 录因子结合位点处，事先引入一个或少数几个碱基突变， 通过凝胶阻滞试验亦可 有效地评估出这些突 变对竞争 DNA勺性能及其与转录因子结合作用的影响。 二、 DNasel足迹试验(DNasel footFIrinting assay) DNasel 足迹试验是一种测 定DN阁合蛋白在DNAk的准确结合位点的技术。 首先是对包含一定顺式作用元件的双链 DN础行单链标记，然后用DNasel水解 单链标记的双链DNA产生不同长度的片断，DNA吉合蛋白与其特异序列结合处 由于空间位阻，DNaseI对这局部DNM

5、能切割，即被DNaseI保护。DNaseI水解 产物经尿素变性，PAGEb离及放射性显影后，形成以相差一个核苜酸为梯度的 一系列DN燎带，在此显影图中相应于DNA吉合蛋白的位置上由于DNA吉合蛋白 的保护作用而形成了空白区域。如果在电泳时结合DNA学测序，那么可准确判断 出结合区的精确序列。 三、 甲基化十扰试验 根据DM毗使G残基甲基化，而六氢毗噬乂能够特异切割甲基化的 G残基这 一原理而设计。具体操作是，先用 DM咂理DNA并控制反响条件，使之到达平 均每条DN的子只有一个残基被甲基化；而后将这些局部甲基化的DNA体同含 有DNA吉合蛋白的适当细胞提取物一道温育，并做凝胶阻滞试验。经电泳别

6、离后， 从凝胶中切除具有结合蛋白的 DN燎带和没有结合蛋白的DN软带，并用六氢毗 噬处理之。于是，甲基化的残基被切割，不具甲基化的残基不被切割。显而易见， 如果因一个G残基的甲基化作用阻止了蛋白质同 DNA勺结合，那么六氢毗噬对这 个甲基化G残基的切割作用，就只能在没有同蛋白质结合的 DN的子中观察到。 相反地，如果一个特殊的G残基在DN心蛋白质的结合中不起作用，那么六氢毗 噬对这个G残基的切割作用，那么在同蛋白质结合的DN的子中及不同蛋白质结合 的DNM子中均可观察到。 四、 酵母单杂交技术 酵母单杂技术是1993年由Li et al 从酵母双杂交技术开展而来的其根本 原理为：真核生物基因的

7、转录起始需转录因子参与。转录因子通常由一个 DNA 特异性结合功能域和一个或多个其他调控蛋白相互作用的激活功能域组成即 DNA结合结构域(DNA-binding domain BDg日转录激活结构域(activationdomain AD).用于酵母单杂交系统的酵母 GAL4蛋白是一种典型的录因子。GAL4勺DNA 结合结构域靠近毯基端含有几个锌指结构，可激活酵母半乳糖苜酶的上游激活位 点(UAS),而转录激活结构域可与RN麻合酶或转录因子TFIID相互作用提高 RNA聚合酶的活 性。在这一过程中 DNA结合结构域和转录激活结构域可完全独 立地发挥作用。据此我们可将GAL4的DNA吉合结构域置

8、换为文库蛋白编码基因， 只要其表达的蛋白能与目的基因相互作用同样可通过转录激活结构域激活 RNA 聚合酶启动下游报告基因的转录。 其根本操作过程为：(1)设计含目的基因(称为 诱饵)和下游报告基因的质粒并将其转入酵母中；(2)将文库蛋白的编码基因片段 与GAL4#录激活域融合表达的cDN应库质粒转化入同一酵母中；(3)假设文库蛋 白与目的基因相互作用可通过报告基因的表达将文库蛋白的编码基因筛选出来 . 在这里作为诱饵的目的基因就是启动子 DNA片段，文库基因所编码的蛋白就是 启动子基因结合蛋白.酵母单杂交技术广泛用DNAt蛋白相互作用的研究。 五、噬菌体展示技术 噬菌体展示技术是一种基因表达产

9、物和亲选择相结合的技术。 根本原理及操 作过程为：以改构的噬菌体为载体把待选基因片段定向插入噬菌体外壳蛋白基因 区，如在噬菌pIII和p VIII衣壳蛋白基因区的N端插入外源基因，形成的融 合蛋白，表达在噬菌的外表不影响噬菌体的生活周期及天然构型， 且易被相应的 抗体或受体分子识别。外源蛋白或多肽表达于噬菌体的外表与固定或固相支持物 结合通过适当的淘洗，洗去非特异性结合的噬菌体(即亲和富集法)选出目的噬菌 体而编码基因作为病蠹基因组的一局部可通过分泌型噬菌体的单链 DNA测序得 知.在这一过程中外源基因是编码启动子 DNA结合蛋白的文库基因而固定或固 相支持物分子那么为启动子DN隔段.噬菌体展

10、示技术是一种经济高效的研究生 物大分子相互作用的技术如构建噬菌体随机多肽文库可用来筛选包括抗体小分 子细胞外表受体等多种分子。Cicchini et al 用噬菌体展示技术筛选出肝富有 的转录因子HNF1a启动子结合蛋白.与蛋白相互作用的研究。 六、核酸适体技术 核酸适体(aptamer)指的是经过一种新的体外筛选技术 - 指数富集配体系统 进化(systematic evo lution of ligands by exponential enrichment , SELEX) 从随机单链寡聚核苜酸文库中得到的能特异结合蛋白质或其他小分子物质的单 链寡聚核苜酸，可以是 RNA也可以是DNA长

11、度一般为2560个核苜酸。SELEX 的筛选流程首先是利用现有的分子生物学技术人工合成一个含有 10141015个 单链寡核苜酸序列的随机文库，序列长度往往在 2535个核苜酸之间，单链的 随机寡 核苜酸序列容易形成可与蛋白质等配体特异性共价结合的二级结构， 在这 一高亲和力特异性结合的根底之上配体蛋白质同随机文库相互作用， 选择性别离 出核酸适体后，然后通过PC或RT-PCR等技术进行扩增。次一级文库再与配体 蛋白质相互作用，反复屡次循环，即可获得与配体蛋白质特异性高亲和力结合的 核酸适体。核酸适体与配体间的亲合力解离常数在皮摩和纳摩之间常要强于抗 原抗体之间的亲合力。核酸适体所结合的靶分子

12、范围非常广泛，除蛋白质之外， 还能作用于酶、生长因子、抗体、基因调节因子、细胞黏附分子、植物凝集素、 完整的病蠹颗粒、病原菌等。适体从 20世纪90年代初出现以后，就得到了科 研工作者的广泛关注，适体的研究工作得到了快速的开展。 SELE漩选技术和核 酸适体的高亲和性在蛋白质/核酸相互作用的研究中发挥了重要的作用。 七、 体内足迹实验： 体内足迹试验原理与甲基化试验根本相同， 其实质是体外甲基化试验的变种。 在 体内足迹试验中，是用有限数量的DNW理完整的游离细胞，并使其渗透到细胞 内的浓度恰好导致天然染色体 DNA中G残基发生甲基化。而后从这些细胞中提取 DNA并参加六氢毗噬作体外消化。结果

13、情况就如同体外足迹试验一样，能与某 中特殊蛋白质因子结合的DNAg段，其上的G残疾就不会被DNM基化，因而就 不会被六氢毗噬所切割。因此，同对照的体外裸露 DNAf形成的序列梯度比拟， 就会发现由完整的活细胞染色质 DN戒成的序列梯度中，缺少了 G残基没有被切 割的相应条带。 经体内足迹实验从染色体总DNA中获得的任何一种特异DNA勺数量都是很少 的。因此，有必要通过PCFK术从染色质总DNA中扩增特异的靶DNA以获得足 够数量的DNA羊品，供体内足迹试验使用。 八免疫沉淀技术 八、 染色体免疫沉淀技术 它们都有一定的局限性，缺乏以充分反映生理条件下 DNAt蛋白质相互作用 的真实情况。因为高

14、等生物的基因组DN府日DNAk的结合蛋白共同组成染色质结 构,用以上所提到的方法分析得到的某段 DN心蛋白质的相互作用的结果,在体 内那么很可能由于染色质高级结构的存在， 而使DN心蛋白质难以接近。因此，在 生理状态下，这段DN4艮可能并不与其相对应的因子相结合， 是没有功能的，反 之亦然。另外，染色质结构本身是动态的， DNAW非组蛋白在生理状态下的相互 作用通常是瞬时的，以上方法难以捕捉到发生在染色质上的基因表达调控的瞬时 事件。而染色质免疫沉淀技术那么可以找出在生理条件下某个 DN酬合蛋白与DNA 序列的结合位点，从而反映体内基因表达调控的真实情况。 1、 技术介绍 在生理状态下把细胞内

15、的DNM蛋白质交联在一起，超声波将染色质打碎后，用 所要研究的目的蛋白特异性的抗体沉淀这种交联复合体。 只有与目的蛋白结合的 DNA段才能够被沉淀下来。 2、 主要步骤及内容 2.1细胞的甲醛固定 甲醛是一种高分辨率的可逆的交联剂，能有效的使蛋白质-蛋白质，蛋白质-DNA、 蛋白质-RNA交联。在甲醛的作用下 DNA基上的氨基或业氨基和蛋白质上的氨 基及赖氨酸、精氨酸、组氨酸、色氨酸的侧链氨基与另外的 DNAffi蛋白质上的氨 基或业氨基交联在一起，在几分钟内形成生物复合体，防止细胞内组分的重新分 布。交联所用的甲醛终浓度约为1%而交联时间需要预实验来确定。可以参加 甘氨酸来终止交联反响。 2

16、.2超声波断裂染色质 甲醛交联后的染色质对限制酶和 Dnasel高度抵抗，因此通常使用机械剪切力使 得染色质断裂。打断后的染色质片段的平均长度应该在 500-1000bp左右可以 用琼脂糖凝胶电泳来鉴定。 2.3氯化饨等密度离心纯化交联的染色质 氯化饨等密度离心可以除去未交联的蛋白质、 DN/W RNA羊品中参加0.5%的 十二烷基肌氨酸钠，通常在4000rpm离心72h。离心后，在离心管的密度梯度顶 部可以见到Sarkosyl-脂类-蛋白的聚集物。用连接到蠕动泵的0.25mm毛细管从 梯度的底局部部收集染色质组分，在 4C透析过夜。 2.4染色质免疫沉淀和免疫沉淀复合体的纯化 用目的蛋白特异

17、性的抗体进行染色质免疫沉淀。 抗体的量要进行优化，$防止 非特异的结合。用 ProteinA/G-Agarose/Sepharose 回收免疫沉淀复合体。经过 洗涤除去非特异结合的染色质后，用 1%SDS+NaH由兑免疫沉淀复合体。 2.5交联反响的逆转和DNA勺纯化 在免疫沉淀复合体中参加不含 Dnase的Rnase, 65C保温6h使交联逆转。经 酚氯仿 抽提-乙醇沉淀纯化DNA纯化的DNAR少，可用色谱定量。 2.6染色质免疫沉淀的DNA勺分析和蛋白质在DNAk结合位点的鉴定 染色质免疫沉淀的DNA勺分析方法有许多种。如果目的蛋白的靶序列是的或 者疑心某个序列是目的蛋白的靶序列，可以采用

18、狭缝杂交和 PCF析；如果目的 蛋白的靶序列未知或者高通量的研究目的蛋白在基因组上的分布情况 ，找出反式 作用因子的结合位点，可以采用Southern杂交、ChIP克隆和DNA5片方法。 2.6.1验证目的蛋白与DNAIE序列的特异性结合 通过狭缝杂交Slot-blot 实验用靶序列特异性探针与染色质免疫沉淀的 DN狄交来验证目的蛋白与DNA巴序列的特异性结合。其相对富集率可以通过比 较探针与特异性和非特异性抗体即未免疫的IgG所免疫沉淀的M5A勺杂交信号 而测定。还可以根据靶序列设计引物，用定量或半定量PCR勺方法，比拟特异性 和非特异性免疫抗体所沉淀的 DNA勺PCFT物的量；或者比拟根据靶序列设计的 引物和远离靶序列设计的引物的 PCB物的量。比值越大，那么说明靶M5A序列与 目的蛋白相结合的可能性越大。 2.6.2研究未知蛋白质的DN阁合位点 如果目的蛋白的靶序列未知或者高通量的研究目的蛋白在基因组上的分布情 况，那么可用Southern杂交法。用