R语言主成份分析细胞因子组群异常在强直性脊柱炎活动度评价中的临床意义

1、R语言主成分分析细胞因子组群异常在强直性脊柱炎疾病活动度评估中的临床意义摘要目的：探讨R语言分析强直性脊柱炎(AS)患者血清细胞因子组群表达水 平与疾病活动度的相关性，为病情评估提供新方法。方法：纳入确诊AS患者70 例，根据ASDASF分分组：缓解期/低疾病活动度组32例，中高疾病活动度组 38例；采用流式细胞术检测其血清中细胞因子白介素-2 (Interleukin-2, IL-2 ),白介素-4 (Interleukin-4, IL-4 ),白介素-6 (Interleukin-6, IL-6 )，白介素-10(Interleukin-10, IL-10)，白介素-17A (Interl

2、eukin-17A, IL-17A ),月中瘤坏死因 子-a (Tumor necrosis factor-a ,TNFo), 丫-干扰素(Interferon- 丫，IFN-丫)的表达水 平，分析两组之间细胞因子水平差异性，并对七种细胞因子进行主成分分析。结 果：与缓解期/低疾病活动度组相比，中高疾病活动度组患者血清中IL-2 , IL-4 , IL-6 , IL-10 , IL-17A, TNF- a, IFN- 丫表达水平均有升高，差异有统计学意义(P均<0.05),对七种细胞因子组群进行 R语言的主成分分析，区分 AS患者缓 解期/低疾病活动度和中高疾病活动度的灵敏度为 100%

3、特异性为56.25%。结论： 在 AS患者中，血清细胞因子 IL-2 , IL-4 , IL-6 , IL-10 , IL-17A, TNF-a 和 IFN- 丫的表达水平与患者疾病活动度密切相关，利用基于 R语言的主成分分析对AS 进行活动度区分，具有高灵敏度的优势。关键词：强直性脊柱炎，细胞闪子,疾病活动度，R语言Abstract Objective: To evaluate the clinical significance of the serum levels of cytokines in ankylosing spondylitis (AS) patients by using

4、R language. To explore the correlation between serum cytokine levels and diseaseactivity in AS patients, thus providing a new method for disease assessment.Methods: 70 AS patients were enrolled in this study. They were divided into 2 groups according to the ASDAS score, relief or low disease activit

5、y stage group (32) and moderate or high active stage group (38). The expression of IL-2 , IL-4 , IL-6 , IL-10 , IL-17A, TNF- a and IFN 丫 were detected in these two groups and the differences of cytokines between the two groups were analyzed. Moreover, the Principal Component Analysis was carried out

6、 on the seven cytokines. Results: The expression levels of IL-2 , IL-4 , IL-6 , IL-10 , IL-17A,TNF- a and IFN 丫 were significantly higher in the patients with moderate or high active stage than the healthy controls and the relief stage (P< 0.05). Todistinguish the two group,the sensitivity and sp

7、ecificity of R language" PrincipalComponent Analysis in the seven cytokines was 100% and 56.25%, respectively.Conclusions: Serum levels of IL-2, IL-4 , IL-6 , IL-10 , IL-17A,TNF-民 and IFI-Jy areclosely related to the stage of AS .The R language' s Principal Component Analysis inthe seven cy

8、tokines of AS patients shows a good sensitivity .Keyword: Ankylosing Spondylitis, cytokines,disease stage,R language强直性脊柱炎(ankylosing spondylitis,AS)是一种以中轴关节受累为特点的 慢性炎症性疾病，好发于青壮年男性，其特征性病理变化为附着点炎，早期常累 及鼾骼关节，晚期可出现脊柱强直、畸形，具有较高的致残率、致畸率 1,给患 者和社会带来多方面的沉重负担，已成为国内外研究的重点。国内外研究报道， 与Th1,Th2和Th17相关的细胞因子(如：IL-6

9、 , IL-10等)在自身免疫疾病发 生发展中具有至关重要的作用2,但目前关于细胞因子组群在 AS疾病活动度中 评估的相关研究较少。由于目前实验室检测的细胞因子种类较多，临床医生对于细胞因子结果在 AS患者中具体意义的解读存在一定的困难，且单一细胞因子水 平不能特异反映疾病活动度及指导临床治疗，AS的炎症病理机制是多种细胞、多信号通路参与的网络调控过程，寻求能反映炎症过程的炎症因子复合组群指标 具有重要的理论价值和临床意义。本研究采用流式细胞术检测AS患者血清中细胞因子 IL-2 , IL-4 , IL-6 , IL-10, IL-17A, TNF-a和 IFN-丫的变化情况，采用 R 语言对

10、缓解期/低疾病活动度组和中高疾病活动度组两组病人进行主成分分析， 探讨此七种细胞因子组群对疾病活动度的影响，以期了解其在AS病情活动度评估中的临床意义，并总结采用 R语言主成分分析七种细胞因子组群在 AS中的临 床意义。1资料与方法1.1 一般资料 纳入2016年3月至2017年12月就诊于浙江省人民医院风湿免疫科的确诊AS患者共70例，男性51例，女性19例，平均年龄39.57 ±14.93 （岁）。所有病例均符合1984年ACR虽直性脊柱炎分类诊断标准和中医诊断为痹证肾虚瘀阻型，并根据AS疾病活动度评分（ASDAS将病人分为缓解期/低疾病 活动度组和中高疾病活动度组（ASDAS1

11、.3为稳定期，1.3<ASDAS2.1为低疾 病活动度，ASDAS2.1为中高疾病活动度），并排除同时患有感染性疾病或月中瘤 等相关性疾病。其中缓解期/低疾病活动度组32例，男性21例，女性11例，平 均年龄39.50 ±15.46 （岁）；中高疾病活动度组38例，男性30例，女性8例， 平均年龄39.63 ±14.67 （岁），年龄之间无差异。1.2 细胞因子样本制备所有受检者清晨空腹坐位肘静脉血采集 2ml,采用分离胶促凝管，1500r/min 离心5分钟，分离血清检测细胞因子备用。1.3 试剂与方法 BDTM Cytometric Bead Array（CBA）

12、Human Th1/Th2/Th17 Cytokine Kit购自美国B必司，严格按照说明书操作。实验仪器采用美国Beckman Coulter公司的Navios流式细胞仪检测细胞因子。1.4 统计学处理 采用SPSS21.0统计学软件对所得数据计算分析，计量资料用均 值土标准差表示，采用非参数检验分析处理，P<0.05表示有统计学差异，并用R version 3.4.4对两组分组中的七种细胞因子进行主成分分析，计算其灵敏度和 特异性。2结果2.1 AS患者中高疾病活动度组血清中 IL-2, IL-4, IL-6, IL-10, IL-17A, TNF-a 和IFN-丫含量均高于缓解期/

13、低疾病活动度组，差异有显著统计学意义（P=0.000、 0.006、0.005、0.000、0.000、0.000、0.000）（表 1） , AS患者流式结果图如 小意图1。表1 AS患者缓解期/低疾病活动度组与 中高疾病活动度组七种细胞因子表达水平比较AS患者缓解期/低 AS患者中高疾病活P值疾病活动度患者组动度患者组/单位/ 单位（ng/l ）（ng/l ）IL-20.86 ±0.932.74 ±5.020.000*1Q11 世FL2 INTB FL2 INT IL6 INTIO3IL 2JL YIL 10卜L2 INTINF alphaIFN-gammaIM7AIL

14、-41.26 ±0.612.30 ±4.040.006*IL-65.00 ±8.926.44 ±5.730.005*IL-101.15 ±0.962.52 ±1.120.000*IL-17A2.03 ±2.5212.59 ±25.290.000*TNF-a1.22 ±0.974.41 ±9.020.000*IFN- 丫1.35 ±1.533.19 ±0.720.000*图1 AS患者流式结果示意图（A为缓解期/低疾病活动度患者，B为中高疾病活动度患者）2.2 又tAS患者缓解

15、期/低疾病活动度组和中高疾病活动度组采用 R语言进行主成分分析（图2 ）U.VOPC 11 (5e 74%)D. M图2 AS患者两组病人主成分分析结果（low为缓解期/低疾病活动度组，high为中高疾病活动度组）2.3 对缓解期/低疾病活动度组所提取的两主成分 PC1 PC2采用95明信区问， 当满足PC1下限且PC2小限即PC1<-0.5472且PC2<-0.2200时为R语言主成分 分析细胞因子结果缓解期/低疾病活动度，否则为R语言主成分分析细胞因子结 果中高疾病活动度；对两组ASDAS?分分组按R语言主成分分析细胞因子结果分 组，结果如表2表2 AS患者ASDA分组缓解期/

16、低疾病活动度组与中高疾病活动度组采用R语言主成分分析细胞因子结果分组ASDA分组中高疾病活动度 缓解期/低疾病活组（例）动度组（例）141832R语言主成分分析 中高疾病活动度38细胞因子结果分组（例）组缓解期/低疾病活 0动度组（例）合计（例）38灵敏度=真阳性/总例数*100%=38/38*100%=100% 特异性=真阴性/总例数*100%=18/32*100%=56.25%3.讨论AS是一种与人类白细胞相关抗原 B27（ HLA-B27）相关的炎症性脊柱关节病， 主要侵犯既骼关节和脊柱，也可以累及外周关节；本病在中医学属于“痹证”范 畴，常见证型为肾虚瘀阻型，症见腰既部酸痛或隐痛，遇寒

17、加重，腰背僵直，屈 伸不利，或腰酸腿软，肌肉萎缩，畏寒、怕风，舌质淡或紫、苔薄，脉弦细。有 研究表明，AS患者中存在多种细胞因子的异常表达，其异常表达与 AS患者疾病 的发生发展密切相关3-5 ;另外，既往中医“证”的研究提示，不同的中医证型 可能存在细胞因子等物质基础的差异6,为了减少数据的离散性，本次研究选取 临床常见的肾虚瘀阻型作为研究对象。R是一个有着强大统计分析及作图功能的软件系统，其使用的程序语言是S语言中的分支一一R语言，其具有操作简单、浮点运算和作图功能强大等特点口， 主成分分析是一种降维方法，可用2-3个主成分特征，反映原来所有指标的主要 特征。本研究采用R语言的主成分分析将

18、Th1/Th2/Th17细胞因子中的七种因子 转化为贡献率最高的两个主成分 PC1和PC2两个因素，有助于临床医生对于这七 种细胞因子组群的解读。机体在炎症状态下会产生多种细胞因子进行调节，包括IL-6、IL-10等。我们发现，在中高疾病活动度组患者血清中IL-2,IL-4 , IL-6,IL-10,IL-17A,TNF- a和IFN- 丫七种细胞因子水平均高于缓解期/低疾病活动度组，差异有统计学意 义。高静、梅杨等8-9研究发现,IL-4、 IL-6、 IL-17A、TNF-a和IFN-丫在活动 期患者血清中高于非活动期患者，这与本研究相一致，但是其研究表明，IL-2与IL-10在两者中无明

19、显差异，这与本研究不相符，我们分析原因，可能由于 检测方法和曲线拟合精度的差异，还需要通过更多病例验证。虽然本研究表明， 在中高疾病活动度组患者血清中 IL-2,IL-4 , IL-6,IL-10,IL-17A,TNF- a和IFN- 丫七种细胞因子水平均高于缓解期/低疾病活动度组，但我们前期的研究发现， 在与疾病活动度相关的炎症因子血沉和 C反应蛋白的相关性分析中，只有IL-4 , IL-6和IL-10与其相关，说明单个细胞因子在强直性脊柱炎活动度中的评价存 在不确定性，不能特异反映疾病活动度。综上所述，在AS患者体内，Th1/Th2/Th17 所产生的细胞因子并不是单个单独的发挥作用，而是

20、作为一个相互关联的整体在 体内发挥作用。因此，我们在基于R语言的主成分分析中发现，PC1+PC2=76.86%, 两者贡献率为76.86%,如图2所示，根据PC1与PC2两主成分基本将ASDA新 分的两组不同疾病活动度组区分开。从图2可以看出，如若对缓解期/低疾病活动度组所提取的两主成分PC1 PC2进行区间定义，即能将其与中高疾病活动度 组基本区分开。因此，我们对该组所提取的两主成分PC1 PC2采用95%S信区问，当满足PC1<F>且PC2<F>即PC1<-0.5472且PC2<-0.2200时为R语言主 成分分析细胞因子结果缓解期/低疾病活动度组，否则

21、为 R语言主成分分析细胞 因子结果中高疾病活动度组，并对所提取出的两主成分进行分析（如表 2）,与 ASDA分组比较，灵敏度为100% 特异性为56.25%目前，临床上多采用ASDAS寸AS患者疾病活动度进行分组，因其综合了主 观评价及实验室指标（血沉、C-反应蛋白），与BASDAHL,相对更客观的反映 患者的病情活动度 的。本研究采用流式细胞术检测 Th1/Th2/Th17细胞因子结合 R语言对AS患者疾病活动度进行分析，与 ASDA呼目比，既排除了主观因素，又 从实验室指标出发，更能客观的反应患者疾病活动度， 且与ASDA分组对比，有 很好的灵敏度（100% ,以及一定的特异性（56.25

22、%）。从结果可以看出，此方 法实现了高灵敏度区分 AS疾病活动度，但在特异性方面存在一定的偏差，我们 分析其原因：一、本次研究样本量有限，后期我们将增加样本量进一步研究； 二、 由于根据ASDAST分对AS患者活动度区分有一定的主观性，后期我们将跟踪假 阳性的这一部分患者，观察其后期疾病活动度的转归。本研究采用流式细胞术同时检测七种细胞因子，与传统ELISA相比，具有快捷，准确，所需样本小等特点，更适用于临床应用；根据本次研究，流式细胞术 检测细胞因子结合R语言在AS患者疾病活动度分组中有良好的临床意义，为临 床AS患者疾病活动程度的评判提供理论依据。我们设想，在进一步验证的基础 上，细胞因子

23、组群是否能作为单独的指标或者综合评判指标中的一个组成部分用 于评价AS参考文献1叶俏，杜瑛媛，顾旭东等，强直性脊柱炎患者血清白介素1屋2、6及月中瘤坏死因子-a测定的意义J.中华物理医学与康复杂志，2008,30 (3): 162-164.2 J.T.Wen,D.H.Zhang,P.F.Fang,et al.Role of Th1/Th2 cytokines in the diagnosis and prognostic evaluation of ankylosing spondylitisJ.Genetics and Molecular Research.2017,16(1).3陈国阳，陈淑增，苏密龙等，强直性脊柱炎患者血清细胞因子初步探讨C, 临床辅助检查