调节性T细胞Treg及其流式检测

1、调节性 T细胞Treg及其流式检测方法1、Treg细胞概述高效免疫抑制剂的发现及其联合应用使临床器官移植的急性排斥反响大大 降低,移植物的存活时间明显延长；器官移植成为挽救终末期器官功能衰竭患者 生命的重要有效途径。但是免疫抑制剂具有明显的蠹副作用如对重要脏器的损伤、降低抗肿瘤及抗感染免疫力等及对治疗慢性排斥反响效果较差等问题，均 限制了免疫抑制剂的长期应用。因此，相关生命科学工作者尝试通过诱导移植免 疫耐受途径来防止免疫抑制剂的长期应用及克服移植免疫排斥反响。在上个世纪九十年代中期，由 Sakaguchi等首先证实了天然 CD4 CD25 调节 性 T 细胞regulatory T cell

2、 ,Treg为一类具有免疫抑制作用的 T细胞，约占 外周 CD4+T!田胞的 510%该类细胞以“主动的方式参与免疫应答/免疫耐 受的调控，不仅参与自身免疫耐受调节，而且在肿瘤免疫和移植免疫中也具有重 要的作用。2、Treg细胞的来源研究证实，天然的 CD4 +CD25+Tre卵胞来源于胸腺，小鼠出生后第 3 天切 除胸腺，外周缺乏 CD4+ CD25+Tregffl胞，产生抗自身抗体并出现自身免疫性胃 炎等自身免疫性疾病。而在第 0 天和第 7天切除胸腺，并不表现自身免疫性疾病。 这说明出生 3d内是胸腺产生 CD4+CD25+Treg田胞的关键时期，这时切除胸腺引 起自身反响性 CD4+T

3、!田胞的过度增殖。但是，出生第 0 天胸腺产生的自身反响性 CD4+TS胞缺乏，出生第 7 天胸腺已经产生了足够的 CD4+CD25+Treg田胞，所以 这时切除胸腺，小鼠不出现自身免疫性疾病。Papiernik 等证实，CD4+CD25+Treg 细胞产生于胸腺，然后迁移到外周发挥作用，CD4+CD 25 匈腺细胞与外周的CD4+CD25+Tre细胞一样，表现对经由 TCR 的抗原刺激呈低反响性，并且显示抑 制其他 T细胞增殖的能力。CD4+CD25+ Tre#田胞的产生需要 TCR 与胸腺皮质上 皮细胞的MHC II 类分子间的高亲和力作用， MHC II 类分子缺陷的小鼠缺乏 CD4+C

4、D25+Tre细胞。CD4+CD25+T 胞除了在胸腺产生以外，还可以在未成熟的 树突状细胞、IL-10、IFN-a、TGF-beta或者低剂量抗原诱导下由外周 CD4+CD25- 细胞转变而来，该类细胞称为诱导的 CD4+CD25+Tre细胞。3、Treg细胞的常用的分子标记CD25 Treg细胞调节机体免疫系统平衡，增加免疫耐受。研究说明，多种 T细胞分子抗原参与 Treg 细胞的特异性功能效应。传统鉴定 Treg 细胞主要是通过 CD 斯日 CD25标记。但随着研究的进一步深入，觉察只通过 CD4+CD25+阳性来 定义的 Treg细胞并不完全准确FOXP3 FOX(forkhead b

5、ox)是脊椎动物义头样 转录因子的总称，是一个具有多种功能的转录因子大家族， 通常和细胞生长发育 的调控有关。FOX 家族成员都有一个义头样结构域，能与 DNA 吉合。FOXP3!义 头样转录因子家族中的成员，2001年由 Brunkow等首次报道。研究发现，它的 表达及 功能与调节性 T 细胞(regulatoryT cells,TR 细胞)密切相关。如果 FOXP3 基因发生突变，将影响 TR细胞的发育成熟，导致 IPEX 综 合 征 (immune dysregulation , polyendocrinop -athy , enteropathy , X linkedsyndrome)

6、 。 FOXP3 主要表达于胸腺、脾脏和淋巴结等淋巴器官和组织。在小鼠特异性表达 于 CD4+CD25+T 胞，而不表达于 CD8+TS 胞。在人类 FOXP%仅可表达于CD4+CD25+T 胞，还可表达于 CD8+CD28-T 田胞。但在 CD4+TM 胞中的表达明显 高于 CD8+HH 胞。目前，Foxp3(forkhead box P3 , Scurfin)是目前公认的 Treg 细胞的最敏感的标志。CD127 最近发现通过表达 CD4 CD25 和传导信号 FoxP3 来定义调节性 T 细胞时，在一类特殊的细胞群体时会出现问题。我们发现IL-7受体(CD127 在外周血 CD4+T勺一

7、个业群中会下调表达。我们证实这些细胞 FoxP3 阳性，且这 群细胞包括那些 CD2 弱马阳性或阴性群体。联合使用 CD4 CD25W CD127 可得到 高纯度的调节性 T细胞，比以前的通过其他标志物来区分方法显著提高。这些 细胞在功能抑制实验中可发挥高度抑制功能。实际上，通过 CD砌 CD127S达来区分的细胞 数量(包括 CD25+CD4+ CD25-CD4+三倍于通过 CD4+CD25h 区分 的调节性T细胞业群。 最后， 我们使用 CD127定量检测I型糖尿病病人调节性 T细胞， 发现CD127W作为人调节性 T细胞的标志物。4、FOXP毓式检测方法美国 eBioscience公司是

8、最早拥有 FOXP 毓式检测抗体的公司之一，公司通 过不断改良和优化，建立了一套完美的针对FOXP3K 式检测特殊的试剂和方案。(1) 实验材料实验设备1)流式上样管2)混匀振荡器3)离心机4)移液器、Tips5)流式细胞仪所需试剂1)细胞外表染色的荧光标记的单抗试剂(CD4CD2 眦 CD8 等)2)FOXP 欲光标记抗体3)溶血素：(eBioscience目录号 00-4333)用于裂解红细胞淋巴细胞别离液：假设样品为人的全血，建议先用别离液别离出单个核细胞后再做 后续检测5)固定剂和破膜剂： (eBioscienceFOXP 龄测专用试剂， 目录号为 00-5521或 00-5523;在

9、 FOXP疑色前，将其中的 Fixation/Perme -abilization Concentrate 和Fixation/Permeabilization Diluent 以 1: 3 的比例混合，配 制好的溶液保存时间不要超过一天)6)其他试剂：Flow Cytometry Staining Buffer (00-4222)或 PBS Permeabil -izationBuffer (Cat.No 00-8333 )等(2)实验操作步骤注：对于不同的 FOXP3S隆号抗体，在操作上可能存在着一些细微的差异。具体实验时，请参考相应的抗体说明书上的操作步骤。此操作以人 Foxp3 (cl

10、onePCH101, cat. XX-4776). 为例。1)在每个流式上样管中参加 100ul 准备好的细胞悬:液，细胞数约为 1x106个。2)按照细胞外表抗原染色方法标记外表抗原(如 CD4 CD8 CD25)。3)用预冷的 Flow Cytometry Staining Buffer或预冷的 PBS洗涤细胞。4)旋涡震荡重悬细胞后参加 1ml 的固定/破膜工作液(Fixation/Permeabilization ),并再次旋涡混匀。5)避光 4C 孵育 30-60 分钟。6)参加 2ml Permeabilization Buffer (Cat.No 00-8333 )工作液离心洗涤细胞并弃去上活液。7)重复第 5步操作洗涤细胞。8)可选参加稀释好的 2% (2ul )的正常大鼠血活(用 Permeabilization Buffer工作液进行稀释)100ul,在避光 4C 孵育 15分钟9)封闭液无需洗去，直接参加稀释好的荧光标记FOXP3%体(用Permeabilization Buffer工作液进行稀释)20ul ,避光 4C 孵育至少 30 分钟。建议进行预实验摸索出抗体的最适浓度。10)参加 2ml Permeabilization B