临床分子生物学检验0001

1、临床分子生物学检验绪论1.20 世纪 50 年代，Waston 和 Crick 提出了 DNA 双螺旋结构，标志着现代分子生物学的兴起。2.从广义上来讲，应用到临床的分子标志物包括 基因组DNA各种RNA蛋白质和各种代谢物， 目前，临床分子生物学检验的靶标主要以核酸(DNM RNA 为主。第一章：核酸与分子标志物1 .分子标志物：可以反映机体生理、病理状态的 核酸、蛋白质、代谢产物等生物分子，是生物标 志物的一种类型。核酸分子标志物是分子生物学检验的主要内容，包括基因突变、DN够态性、基因组DNAt段、 RNAF 口循环核酸等多种形式。2 .DNA的组成：是一种高分子化合物，其基本单 位是脱氧

2、核甘酸，每个核甘酸由磷酸、脱氧核糖 和含氮碱基3部分组成。3 . DNAW RNA勺区别：2位脱氢。4 .DNA的结构：DNK级结构：各种核甘酸单体沿多核甘酸链排列的顺序，表明该DN粉子的 化学构成。DNA1级结构：双螺旋结构，DNA 双螺旋的直径为2nm,一圈螺旋含10个碱基对， 每一圈螺距为3.4nm,每个碱基的旋转角度为36 度。维持DNA吉构稳定的力量主要是碱基对之间 的堆积力，碱基对之间的氢键也起着重要的作 用。DN级结构：DNAZ螺旋进一步盘曲形 成的更加复杂的结构。5 .核小体的形成（真核生物染色体包装过程）： 在核小体中，DNA盘绕组蛋白八聚体核心，使DNA 缩短为原来的1/7

3、; 6个核小体形成螺丝管，缩 短为1/6 ;核小体彼此相连成串珠状染色质细丝， 螺旋化形成染色质纤维，进一步折叠成染色单 体。6 .DNA双螺旋结构的变异：右手螺旋A-DNAC-DNA D-DNA E-DNA H-DNA L-DNA P-DNA 左手螺旋Z-DNA7 .RNA主要分为三类：tRNA、rRNA mRNAE有一 些小型 RNA反义 RNA微小 RNAmicroRNA,miRNA 是一类内源性的具有调控功能的非编码 RNA）8 .真核mRNAf原核mRNA勺区别（简答题） 原核mRN结构简单，为多顺反子，编码序列之 间有间隔序列，原核生物mRN触没有修饰碱基。 真核生物mRN的单顺反

4、子结构，成熟的mRNQ 5'端有帽子结构，3'端有polyA尾巴。9 .原核生物主要的rRNA （占细胞总RNA80%）有 三种:5S、三S、23S；真核生物有四种5S、5.8S、18S 和 28S rRNA10 .基因：能编码有功能的蛋白质多肽链或合成RNA所必需的全部核酸序列，是核酸分子的功能单位。11 .顺式调节：一个基因的调控区和结构基因位 于同一 DNA分子的相邻部位，其作用是参与基因表达的调控。12 .启动子：一段位于结构基因5,端的上游的 DNA序列，能活化RNA聚合酶，使之与模板DNA 准确地结合并具有转录起始的特异性。操纵序列（操纵元件）可被具有抑制转录作用的

5、 阻遏蛋白识别并结合13 .真核生物基因结构包括外显子和内含子，称 为断裂基因14 .增强子：可位于基因的上游或下游，也可位 于内含子中，它不能启动一个基因的转录，但有 增强转录的作用14:表观遗传：在DNA序列不发生改变的情况下,基因功能出现可逆的、可遗传的变化。包括组蛋白修饰（包括甲基化、乙酰化、磷酸化、泛素化、糖基化）、DNA甲基化、RNA干扰等。15 . DNA甲基化：生物体在DNA甲基转移酶的催 化下，将甲基转移到特定的碱基上的过程。DNA 甲基化一般发生在CG双核甘酸的C上面。16 .基因突变类型：点突变、插入缺失、动态突 变17 .错义突变：点突变改变了三联体密码子，导致基因产物

6、中某个氨基酸被另一个氨基酸所取 代。18.无义突变（链终止突变）：DNA序列的改变使位原核生物的结构基因中无内含子成分，不得编码某一氨基酸的密码子突变终止密码，则导 致翻译过程提前终止。19 .基因组：一个细胞或一种生物体的整套遗传 物质，包括基因和非编码DNA20 .原核生物基因组特征:基因组较小没有典型的细胞核结构操纵子结构是原核生物基因组的功能单需要经过剪接加工过程具有编码同工酶的基因含有可移动DNA?列21 .质粒：指细菌细胞染色体以外，能独立复制 并稳定遗传的共价闭合环状分子。22 .转座因子（转座元件）：是一类在细菌染色体、 质粒或噬菌体之间自行移动并具有转位特性的 独立的DNAf

7、f列。包括插入序列、转座子、Mu噬菌体23 .病毒基因组类型：24 .人类基因组包括：细胞核内的核基因组和细 胞质内的线粒体基因组。25 .人类基因组的最大特征：存在大量的非编码 序列和重复序列26 .多基因家族：由某一祖先基因经过重复和变 异所产生的一组基因。27 .假基因：在多基因家族中，某些成员并不产 生有功能的基因产物，这些基因称为假基因。28 .多态性：不同的个体之间，在基因组 DNAff 列上会存在差异，平均而言，一对同源染色体每 1000个碱基就会出现一个碱基的差异（基因组中 蛋白质编码区大概是每2500个碱基出现一个差 异）。当某种变异相对常见，在群体中的频率高 于1%寸，则成

8、为多态性。29 .人类基因组多态性形式：限制性片段长度多态性小卫星和微卫星多态性单核甘酸多态性拷贝数多态性30 .单核甘酸多态性：在基因组水平上由单个核 甘酸变异所引起的DNAff列多态性第二章：核酸杂交技术1 .核酸分子杂交：单链的核酸分子在合适的条件 下，与具有碱基互补序列的异源核酸形成双链杂 交体的过程。2 .核酸分子杂交的基本原理：在一定条件下，双 螺旋之间氢键断裂，DN粉子成为单链；将一种 核酸单链标记成为探针，再与另一种核酸单链进 行碱基互补配对，变性DNAR要消除变性条件， 有碱基互补区域的单链又可以重新结合成双链， 形成异源核酸分子的双链结构。3 .复性：变性DNAR要消除变性

9、条件，有碱基互 补区域的单链又可以重新结合成双链， 这一过程 称作复性。4 .变性：在一定条件下，双螺旋之间氢键断裂，双螺旋解开，DN粉子成为单链，形成无规则线 团，这一过程称作变性5 . Tm融解温度大小取决于DN粉子的长度和核 酸分子的C-G含量，C-G碱基含量越高，Tm值越 Wj。6 .探针：指所有能与她特定的靶分子发生特异性 的相互作用。7 .核酸探针：特指能与靶核酸序列发生碱基互补 杂交，并能由其标记被特异性检测的核酸分子。8 .探针的标记方法：放射性标记：32P标记的 放射性探针敏感而可靠，可以检测到含量极微的 核酸分子而且不会妨碍核酸分子间的杂交。 非 放射性标记：非同位素探针多

10、由生物素、地高辛 或荧光素标记。无环境污染，可较长时间贮存。9 .核酸分子杂交类型：液相杂交、固相杂交、原 位杂交10 . Southern印记杂交：两个主要过程：一是将 待测定核酸分子转移并结合到一定的固相支持 物上；二是固定于膜上的核酸同位素标记的探针 在一定的温度和离子强度下退火，即分子杂交过 程。11 .Southern印记杂交原理：将凝胶上的 DN展 性并在原位将单链DN*断转移至固相支持物 上，经紫外线照射固定，再与相对应结构的标记 探针进行杂交，用放射自显影或酶反应显色，从 而检测特定DN吩子的含量。12. Southern印记杂交与Northern印记杂交的 区别：Southe

11、rn印记杂交是检测 DNA勺， Northern印记杂交是检测特异mRNA勺。第三章：核酸扩增技术1 .聚合酶链反应（PCR技术是1983年K.Mullis发明的。基本原理和过程与细胞内 DNA勺复制相 似，PC唯复进行DN限制的过程，使DNA导以 扩增。2 .PCR的基本原理：与细胞内 DN限制相似。过 程：变性、退火、延伸。3 .PCR扩增体系：模板、引物、dNTP TaqDN靡 合酶和缓冲液等。4 .实时PC期:术：主要包括DN姣联荧光染料技 术和荧光共振能量转移技术。5 .DNA交联荧光染料技术：SYBR Greenl染料能 选择性地渗入至双链DN粉子中，并产生强烈荧 光，结合的荧光信

12、号和 DN桔量成正比。缺点是特异性不够，使反应体系中荧光本底较Wj。6 .水解探针技术标记原理：反应体系中除了两条 引物还要一条荧光素标记的探针，探针的 5'端 标记荧光报告基团R, 3'端标记荧光淬灭集团 Q当探针完整时R基因和Q基因分别位于探针 的两侧，Q基团抑制R基团使其不能发射荧光。7 .Ct值：处于扩增曲线和荧光本底基线的交叉 点处相应的反应循环数。Ct值的大小与样品中模板DNA勺起始拷贝数成 反比，起始模板量越高，Ct值越小，反之越大。8 .当温度升至其熔点温度（Tn）时荧光量急剧下 降而形成熔点曲线，其波峰所在温度即代表被检DN吩子的Tm值。（SYBR Green

13、l标记时 用熔点曲线校正）第四章：核酸序列分析1 .双脱氧链终止法是Sanger发明的，原理：进行测序反应Sanger引入了双脱氧 核昔三磷酸（ddNTP作为链终止物，ddNTP比 dNT喳3'端缺少一个羟基，不能同后续的dNTP 形成3' ,5'-磷酸二酯键，因此正在增长的DNA 链不再延伸。凝胶电泳和序列读取2 .DNA自动分析技术的测序反应西主要包括：DNA 模板、测序引物、DNA1合酶和荧光标记等。3 .商品化的测序平台主要有：罗氏/454公司的 GS FLX测序平台、Illumina/Solexa 公司的 Genome Analyzer测序平台和 ABI公司的

14、SOLiD 测序平台。4 .第二代测序技术基本原理：先进行文库制备， 即将片段化的基因组DN炳侧连上通用接头；随 后运用PCRT增技术来生产几百万个空间固定 的DN魔，这种DN曦由单个文库片段的多个拷 贝组成，称PC限隆阵列或称聚合酶克隆，最后 进行测序，即测定每个克隆的核甘酸序列 5.DNA簇由单个文库片段的多个拷贝组成，称 PCRS隆阵列或称聚合酶克隆。6 .第三代测序技术（单分子测序技术）：该技术 利用单分子技术和DN膘合酶，在聚合反应的同 时就可以读取测序产物。第五章：生物芯片技术1 .生物芯片：将大量生物大分子有序地固化于支 持物表面，组成密集二维分子排列，然后与标记 的待测生物样品

15、中的靶分子杂交，通过特定仪器 对杂交信号的强度进行快速、并行、高效地检测分析，从而判断样品中的靶分子数量。 主要特点是高通量、微型化和自动化。2 .生物芯片根据固定的探针种类不同分为：DNA 芯片、蛋白质芯片、细胞芯片和组织芯片等；根 据芯片的用途不同分为：表达分析芯片、测序芯 片和芯片实验室等。3 .DNA芯片原理：核酸杂交原理。4 .常见的芯片制备方法：原位合成（在片合成）、 直接点样（离片合成）5 .蛋白质芯片：将蛋白质或多肽有序地固定在固 相载体表面形成微阵列，用标记了荧光的蛋白质 与之作用，洗去未结合的成分，经荧光扫描测定 芯片上各点的荧光强度，来分析蛋白质之间或蛋 白质与其他分子之

16、间的相互作用关系。第六章：蛋白质组学技术1 .蛋白质组：一种基因组所表达的全部蛋白质， 即包括一个细胞或一个组织或一个机体的基因 所表达的全部蛋白质。2 .Western印记又称免疫印迹，是一种蛋白质测 定技术。3 .Western印记原理：蛋白质之间作用，依据 Southern印记杂交。过程：4 .双向凝胶电泳的原理：第一向电泳是依据蛋白 质的等电点不同，通过等电聚焦将带不同净电荷 的蛋白质在pH梯度介质中外加电场作用形成分 离的蛋白质区带。5 .目前在蛋白质组研究中，ESI质谱仪和 MALDL-TO质谱仪最为常用。第八章：病毒感染的分子生物学检验1 .乙型肝炎病毒基因组结构：HBV DN编

17、带有部 分单链区的环状双链DN粉子，是目前已知感染 人类最小的DN隔毒。基因组长为3.2kb。 HBV 的两条链长度不等，长链（负链）携带有病毒全 部的编码信息；短链（正链）在不同分子中长度 不等。2 .HBV基因组负链DN柱要有四个开放读码框 架：S基因区（编码外膜蛋白）、C基因区（编码 核心蛋白）、P基因区（编码多聚酶蛋白）、X基 因区（编码X蛋白）HBsA谣机体受HBV染的主要标志之一。3 .HIV为逆转录RNAi毒。4 .人类免疫缺陷病毒基因组结构：有两条相同的 正义RNA5 .在HIV-1基因组中3个结构基因，编码结构蛋白：gag基因（编码结构蛋白）、pol基因（编码 逆转录蛋白）、

18、env基因（编码包膜前体蛋白）6.6 个调控基因：tat、rev、nef、vif、vpr、 vpu/vpx 等。7 .流感病毒的遗传物质：单股负链 RNA8 .人流感病毒分为甲（A）、乙（B）、丙（C）三 型，流感病毒的遗传物质是单股负链 RNA 第十一章：单基因遗传病的分子生物学检验1 .人类的单基因遗传病的主要遗传方式分为三 种：常染色体遗传、X连锁遗传、Y连锁遗传。 单基因遗传病分子生物学检验的策略包括直接 和间接诊断策略直接诊断策略：直接揭示导致遗传病发生的各种 遗传缺陷，即用分子生物学技术直接检出致病基 因的突变或由于结构变化与转录异常导致的基 因的表达量的改变等遗传缺陷。2 .镰状

19、细胞贫血发生的分子机制：镰状细胞贫血 患者由于3珠蛋白基因中第 6位密码子存在单 个碱基的突变，由原来的GA嚷成GTG使谷氨 酸变成缴氨酸，导致氧结合能力过低，红细胞发 生镰变。第十二章：肿瘤分子生物学检验1 .肿瘤相关的基因：原癌基因、肿瘤抑癌基因、 细胞周期调节基因、细胞凋亡基因、维持细胞基 因组稳定基因、肿瘤转移相关基因、肿瘤血管生 成相关基因2 .原癌基因：人类固有的一类基因，能诱导细胞 正常转化并使之获得新生物特征的基因总称。原 癌基因激活机制包括：插入激活、基因重排（染 色体异位）、基因点突变（移码突变）、基因扩增、 基因转录改变3 .抑癌基因：可编码对肿瘤形成起阻抑作用蛋白 质的基因，正常情况下负责控制细胞的生长和增 殖。一、 血液基因组提取1,苯酚/氯仿作用：对蛋白质有极强的变性 作用，而对DNA却没有影响，经苯酚/氯仿抽 提后，苯酚/氯仿层与水相