洛莫司汀热敏脂质体的制备及体外抗肿瘤活性研究

1、洛莫司汀热敏脂质体的制备及体外抗肿瘤活性研究洛奠司汀热敏脂质体的制备及体外抗肿瘤活性研究黄桂华,祝侠丽,张娜,张丙杰(山东大学,药学院,h医学院,济南250012)摘要:目的制备洛莫司汀热敏脂质体并考察其体外抗肿瘤活性.方法以二棕榈酰一D,一磷脂酰胆碱(DPPC)和胆固醇为载体,采用薄膜分散法制备洛莫司汀热敏脂质体,以甘露醇为赋形剂将其制成冻干脂质体;透射电镜观察冻干前后脂质体的形态,激光散射法测定脂质体的粒径分布及Zeta电位;SephadexG一50柱分离脂质体与未包封药物,HPLC测定脂质体包封率;并考察脂质体的体外释药特性和体外抗肿瘤活性.结果脂质体为多层圆形或椭圆型小囊,无粘连,大小

2、均匀,冷冻干燥前后平均粒径分别为189,8和274,9nm;'电位分别为一19.13和一0.83mV,包封率分别为68,28%和60.32%(n=3).在pH7.4PBS介质,相变温度42时30min累积释药88,64%.相同剂量洛莫司汀溶液与洛莫司汀热敏脂质体比较,37时肿瘤抑制率分别为33.04%和35.35%,两者无明显差异(P>0,05);加热到42时肿瘤抑制率明显增加,加热10min肿瘤抑制率分别为36,75%和58.87%;加热30min肿瘤抑制率分别为50,52%和71.69%.结论洛莫司汀热敏脂质体在相变温度时,体外释药明显增加,体外抑瘤效果明显提高.关键

3、词:洛莫司汀;温度敏感脂质体;一d磷脂酰胆碱;抗肿瘤活性中图分类号:R943.42文献标识码:A文章编号:lOOt一2494(2007)12091405PreparationofLomustineThermo?SensitiveLiposomesandInvestigationofAnti?TumorActivityinVitroHUANGGuihua,ZHUXia.1i,ZHANGNa,ZHANGBing-jie(0.PharmaceuticalCollege,b,SchoolofMedici,ShandongUniversity,船n250012,China)ABSTRACT:OBJECT

4、IVEToprepareLomustinethermosensitiveliposomes(CCNUTSL)andinvestigatetheanti?tumoractivityvitro.METHODSTheCCNUTSLwerepreparedbyfilmdispersionmethodusingLotDipalmitoylracglycero一3一phosphocholine(DPPC)andcholesteilnascarriermaterials,andthentofreezedryingusingMannitolascryoprotectant.ThemorphologiesofC

5、CNU?TSLbeforeandaftereryodesieeationwereobservedbytransmissionelectronmicroscope.TheZetapotentialandtheparticlesizedistilbutionwereevaluatedbythelaserscatteringtechnique.TheliposomesandthefreedrugwereseparatedbysephadexG一50columnandtheentrapmenteffieieneiesweredeterminedbyHPLC.Thereleasecharacterist

6、icsandantitumoractivitiesofCCNUTSLinvitrowereinvestigated.RESULTSTheCCNUTSLwasmultiplayersphericalorellipsoidalshapewithuniformsizes.Themeandiameters(D50)ofCCNUTSLbeforeandaftereryodesieeationwere189.8and274.9nm,respectively.TheZetapotentialswere一19.13and一0.83mV,respectively.Theaverageentrapmenteffi

7、eiencieswere68.28%and60.32%,respectively.Theaccumulativedrugreleasepercentwas88.64%inPBS(pH7.4)at42.rhetumorinhibitionrateoftheCCNU.TSLandlomustinesolutionatthesamedoseswere35.35%and33.04%at37,respectively(P>0.05),andthetumorinhibitionrateswereincreaseddramaticallyat42oC.Thetumorinhibitionrat

8、eofLomustinesolutionandCCNUTSLwere36.75%and58.87%at42for10min.respectively.Andthetumorinhibitionratewere50.52%and71.69%at42for30min.respectively.CONCLUSIONThedrugreleasepercentsandthetumorcontrolratesofCCNUTSLareimprovedsignificantlycomparedwithlomustinesolutioninvitro.KEYWORDS:lomustine:thermo.sens

9、itiveliposomes;DPPC;antitumoractivity在研究的各种新型脂质体中,热敏脂质体即温度敏感脂质体(thermo-sensitiveliposomes,TSL)是一个很有发展前途的分支,它有效利用了脂质体和热疗的双重优势来提高治疗效果,降低不良反应.热敏脂质体大都采用液晶转变温度稍高于生理温度的磷脂制备,在其相变温度时,脂质体的磷脂膜由凝胶态转变到液晶态,这种结构的变化导致脂质体膜的通透性增加,脂质体内部包封的药物释放度亦增加j.我们以相变温度42的二棕榈酰-D,一磷脂酰胆碱(DPPC)和胆固醇为载体材料,以亚硝基脲类广谱抗肿瘤药洛莫司汀(1omustine,CCN

10、U)为模型药物,采用薄膜分散法制备CCNU热敏脂质体(CCNU.TSL),初步考察了热敏脂质体的理化性质.并对其体外释药特性和体外抑瘤作用进行了研作者简介:黄桂华,女,副教授Tel:(0531)88382015Email: ?914?Pharm,2007June,Vo1.42No.12中国药学杂志2007年6月第42卷第12期究.此项研究国内外尚未见报道.1材料CCNU原料药(山东潍坊制药厂);DPPC(Sigma公司);注射用大豆磷脂(上海浦江磷脂);胆固醇(上海化学试剂站);维生素E(黑龙江九三油脂有限责任公司);甘露醇(临淄制药厂);四甲基偶氮唑蓝(MTF,Sig

11、ma公司);胎牛血清与RPMI1640培养基(GibcoBRL公司);C6胶质瘤细胞株(山东大学齐鲁医院中心实验室).旋转蒸发器RE5298(上海亚荣生化仪器厂);SHBm循环水式多用真空泵(郑州长城科工贸);JY一92一超声波细胞粉碎机(宁波新芝科器研究所);Zetasizer3000粒度分布与电势分析仪(英国Malvern公司);JEM一1200EX透射电镜(Et本电子);ETSD4型定时恒温磁力搅拌器(上海雷磁仪器厂);LC一10A型高效液相色谱仪(Et本岛津);MDFU71v低温冰箱(SANYO公司);FD一1C一55真空冷冻干燥机(北京博医康实验仪器).YJ一1450医用净化工作台(

12、苏州净化设备公司);DHP一781型电热恒温培养箱(湖北省黄石市医疗器械厂).2方法2.1CCNUTSL的制备采用薄膜分散法制备CCNUTSL.将CCNU,DPPC,胆固醇,维生素E等置于100mL圆底烧瓶中,加入氯仿溶解,在38减压旋转下除去溶剂,在器壁上形成薄膜,向烧瓶中加入15mLPBS(pH7.4),电磁搅拌5min,即可形成大多层脂质体.将此溶液于探头式超声处理器(80100W)超声30s,用0.22m滤膜加压过滤,即得脂质体混悬液.2.2冻干CCNUTSL的制备在CCNUTSL混悬液中加入5%的甘露醇作为冻干赋形剂,分装于安瓿中,于一70超低温冰箱预冻24h,在一45条件下冷冻干燥

13、24h,充N,压盖即得.2.3CCNU热敏脂质体含量测定方法的建立2.3.1色谱条件分析柱为C一ODS(4.6mm×250mm,5Ixm),流动相为乙腈一水(65:35),流速1.0mL?min,检测波长254nm,进样量20L.2.3.2标准曲线的制备精密称取CCNU原料20.0mg于100mL棕色量瓶中,加甲醇溶解并定容至刻度作为贮备液(冰箱低温贮存备用).精密吸取贮备液适量,加甲醇制质量成浓度分别为1,2,4,6,8,10mg?L的系列标准溶液,按"2.3.1"色谱中国药学杂志2007年6月第42卷第12期条件测定.2.3.3回收率与精密度测定按处方量80%

14、,100%,120%精密称取CCNU原料,分别加处方比例辅料,加甲醇溶解并定容至刻度;同法配制辅料溶液.将上述溶液用0.22m微孔滤膜过滤,取续滤液加流动相稀释至进样浓度,按"2.3.1"色谱条件测定计算回收率.1d内测定5次,求得Et内精密度;每天测定1次,测定5d,求得Et间精密度.2.4包封率测定2.4.1脂质体中游离药物的分离采用葡聚糖凝胶(Sephadex)G一50柱(2.5cm×30cm)层析法分离脂质体中的游离CCNU,以PBS(pH7.4)为洗脱液,流速0.5mL?rain,将游离药物及脂质体分段收集.脂质体用甲醇破乳后,按"2.3&qu

15、ot;项下方法测定.2.4.2包封率的测定取"2.4.1"项下的流出物作为供试液.分别取供试液和标准对照液20L注入液相色谱仪,记录峰面积.用外标法计算出脂质体原液的总药物浓度(c)和游离药物浓度(c),根据下式计算包封率J:包封率%=×100%2.5CCNUTSL物理性质测定2.5.1形态观察取CCNUTSL混悬液适量,加水稀释,然后滴加在覆盖碳膜的铜筛网上,自然风干,滴加3%磷钨酸钠溶液负染,在透射电镜下观察脂质体形态,并拍摄照片.2.5.2粒径分布及表面电位测定"取CCNUTSL混悬液适量,适当稀释,用磷酸缓冲溶液(pH7.4)作支持液,采用ZET

16、ASIZER3000粒度分布与电势分析仪(英国Malvem公司)测定,动态光散射软件数据处理记录平均粒径,考电位及多分散性指数.2.6体外释放度试验采用反向透析法测定CCNUTSL体外释放度.取10mLPBS置于特制的宽口小瓶中,将1mL的PBS置于透析袋中,透析袋两端系口置于特制的宽口小瓶.将小瓶置30,37,40,41,42和44恒温振荡器上预热30rain,加入脂质体混悬液0.2mL,分别于0,10,20,30,60,120,240,300min取样0.2mL(同时补加相同温度下的PBS0.2mL),各样品加0.2mL的甲醇稀释后即进行HPLC测定.根据下式计算累积释放百分率.ChinP

17、harmJ,2007June,Vo1.42No.12Q=×00%式中:Q一各时间点的累积释放百分率,c一各时间点的实际药物浓度,一溶出介质总体积,一每次取样体积,ci为i时刻各取出样品的药物浓度;一脂质体中含CCNC量.2.7体外抗肿瘤活性试验.2.7.1样品溶液的配制不同浓度CCNU.TSL的配制:精密量取CCNU.TSL(CCNU浓度相当于I临床治疗剂量的峰浓度,即3g?L)适量,加无菌蒸馏水溶解,用培养液分别稀释1,2,4,8,10倍,用0.22m微孔滤膜过滤除菌,备用.CCNU水溶液(CCNUSOL)的配制:称取CCNU适量,用0.9%NaC1,10%乙醇,2%Tween一8

18、0临用前配制(CCNU浓度相当于临床治疗剂量的峰浓度,即3g?L),用0.22m微孔滤膜过滤除菌,备用.2.7.2体外抗肿瘤活性试验方法在无菌条件下将肿瘤细胞先经Hank'S液洗涤后,以0.25%胰酶+EDTA消化分散细胞,并用锥虫蓝测试细胞活性,肿瘤细胞活性达95%以上.取细胞接种于96孔培养板中,细胞数10000?孔,置于含5%CO,的孵箱中培养4h.每孔加入20L药液,每种药物浓度各设10个复孔,对照组加DMEM培养液,在水浴(一组为正常体温,水浴温度设为37oC;另一组为加热组,水浴温度设为42),5%CO,中培养72h后,离心10min,吸去上清液,每孑L加入M,邝20L(5

19、mg?L),继续培养4h.吸去上清液,每孔加入二甲亚砜(DM.so)100L,使充分溶解,测定每孔570nm处的吸光度(A).按下列公式计算各药物浓度和温度对肿瘤细胞的抑制率(inhibitionratio,IR).-R=.%式中:IR为抑制率(IR>130%为敏感;IR<30%为不敏感);A,一对照组测定的吸光度;A:一实验组测定的吸光度.3结果与讨论3.1冻干试验结果与再水化分析液体状态的脂质体不稳定,如药物渗漏,粒子聚集及长期储存分层等现象,冷冻干燥法基本解决了这些问题.以甘露醇为冻干赋形剂,添加抗氧剂维生素E,将CCNU.TSL制成冻干粉,提高了稳定性.CC

20、NU.TSL冻干后形成细小的白色粉针状结晶,摇动后易形成细小粉末,含水量0.8%1.2%.冻干PharmJ.2007June.Vo1.42No.12后的脂质体在生理盐水,超纯水,PBS等溶媒中,在短时间内迅速完全再水化;如果冻干后的脂质体在贮存过程中受潮,在上述溶液中再水化效果不理想,呈细小颗粒状.3.2含量测定方法学考察测定结果表明,辅料对测定无干扰,见图1.!一'0_4OIUI2t/min图1CCNU高效液相色谱图A一空白脂质体;BCCNU对照溶液;cCCNU热敏感脂质体Fig1ThehighperformanceliquidchromatogramofCCNUAblatlklip

21、somes:BcontrolsolutionofCCNU:CCCNUTSLCCNU在110mg?L内峰面积(A)与质量浓度(P)线性关系良好,A=9694.9P(mg?L)一213.41,r=0.9998.最低检测限及最低定量限分别为4和15g?L.高,中,低3个浓度的平均回收率为99.1%,RSD为2.42%.13内精密度RSD<0.72%;日间精密度RSD<1.80%,适合本品含量测定.3.3理化性质与包封率测定3.3.1形态优化处方制备的CCNU.TSL在透射电镜下观察有明显的指纹状,呈多层圆形或椭圆型小囊,无粘连,见图2.A13圈2CCNUTSL透射电镜照片

22、A一冷冻干燥前(×480oo);B一冷冻干燥后(×1900oo)Fig2MicrophotographofCCNUTSLbytransmissionelectronmicroscopeAbeforecryodesiccation(x48ooo):Baftercryodesiccation(×190ooo)3.3.2粒径分布及Zeta电位采用Zetasizer3000激光粒度分布与电势分析仪测定优化处方制备的CCNU.TSL,冻干前后平均粒径分别为(189.8±4.2)和(274.9±4.8)nm,多分散性指数分别为0.150和0.214,在生理

23、pH条件下,冷冻干燥前后Zeta电位分别为一19.13和一0.83mV.Zeta电位与体系的稳定性密切相关,测定Zeta电位可中国药学杂志2007年6月第42卷第l2期以预测脂质体贮存体系的稳定性.见图3.A1020501005001000Diameter/nm间释放量逐渐降低,到300min时几乎没有药物释放.理论上药物累积释放量应维持在较高水平,但CCNU在高温下不稳定,在高温下长时间保存降解速度加快,药物含量降低.因此,我们考察了CCNU溶液在不同温度下的降解情况,结果见图5.图一A一冷冻干燥前;B一冷冻干燥后目lFig3SizedistributionofCCNUTSL.JA一eror

24、ecryodescatjon;一cryodesiccatjon.':1.三三圣三豢;ji=;.3?3?3包封率优化处方和工艺制备的CCNU-.m.,.TSL,经SephadexG一50柱分离后测定冻干前后的图5CCNU不同温度下的降解曲线?n=3包封率分别为68.28%及60.32%(:3).一.I一.;o一.;_.一.;心一-一一.-一由图2可知,CCNU-TSL冻干前后脂质体的物Fig51'ldti.c.fCCNUsolutionidifferentt.理性质发生了不同程度的变化,包封率略下降;粒径.mt:3稍大;考电位增加等.脂质体粒径大小和分布均匀一30oC;o一37o

25、C;_-一40oC;._4loC;-_42oC;一程度与其包封率和稳定性有关,冷冻干燥脂质体在44快速冷冻的过程中,由于冰晶的形成,使已形成的脂由图5可知,CCNU在水溶液中,随温度升高,质体膜破裂,形成了冰晶片层与破碎的脂膜相问的降解速度加快.30体外释放30min由100%降存在状态,在缓慢复水过程中使脂膜互相融合,重新至40?25%,37降至3?59%;42体外释放180形成脂质体,因此包封率降低,粒径变大.min由100%降至1?41%;44药物几乎完全降解.3.4体外释放试验药物降解符合一级动力学,37时CCNU降解方程CCNU.TSL在不同温度时体外释放结果见图4.为:lgc=一0

26、?0044t+1?8083(r=0?9850),42降由图4可知,各温度下的释放曲线可分为上升和下解方程为:lgc=一0?0102t+1?9871(r=0?9982).降部分,上升部分相同温度下随时间延长释放量增为了证实由于CCNU的热降解造成CCNU-TSL加,30,37,40,41,42和44分别由0%增加至体外释放后期释放百分率下降,我们将释放药物与37.03%,35.22%,39.75%,48.68%,86.44%及降解药物累积作为纵坐标,拟合CCNU-TSL在3720.45%.30mi温度为37时,药物释放和42时的释放曲线.结果见图6.35.22%;温度为42时,药物释放88.64

27、%达到最201高值,与DPPC相变温度一致m0.一050100l50200250300350t/min图4CCNUTSL在不同温度下的释放曲线.n=3一3OoC;037oC;_一4OoC;去一41oC;-一42oC;一44Fig4TheaccumulativereleasecurveofCCNU.TSLindiffer-enttemperature.n=3一3OoC;037oC;0一4ooC;去一41oC;-一42oC;一44实验中发现,药物释放30min后,延长释放时中国药学杂志2007年6月第42卷第12期80岩嚣0加0306090l20150l802l0240270300t/UILq图6

28、拟合后CCNUTSL37oC和42时的释放曲线.n=3-_I_一37oC;一42Fig6ThefittingreleasecurveofCCNUTSLat37and42.n=3-_I_一37oC:-Ik-一42由图6可知,拟合后CCNU-TSL在37时,30和180min体外累积释放百分率分别为50.44%和72.12%;在42时30和180min体外累积释放百分率分别为90.12%和100%.因为在相变温度(42ChinP0J.2007June.Vo1.42No.12舯口舯印加如0矗甚嚣暑I【I旨暑.oC)时,CCNU热敏脂质体双分子层中疏水链从有序排列变为无序排列,膜由胶晶态变为液晶态,其

29、厚度减小,流动性增加,被包裹在脂质体内的药物释放速率最大;另外胆固醇具有调节脂质体流动性的作用,通常称为脂质体流动性缓冲剂.当低于相变温度时,胆固醇可使膜减少有序排列而增加流动性;当高于相变温度时,胆固醇可增加膜的有序排列而减少流动膜的流动性.因此,CCNU热敏脂质体在相变温度(42oC)时体外释药比正常体温(37oC)快,这一结论与文献报道一致¨.3.5体外抗肿瘤活性试验CCNUSOL和CCNUTSL在相同时间不同温度和相同温度加热不同时间,肿瘤细胞抑制率测定结果见表1.表1CCNU水溶液和热敏脂质体对肿瘤细胞的抑制率.%Tab1Inhibitionratiotocancercel

30、lofCCNUSOLandCCNU一IT.ofdifferentconcentrations.%SampleconcentrationInhibitionratiotocancercel1/%Sample-?-r?v-?-?-,/g?L37oC.10min42oC,10min42oC.30min从表1可以看出,正常体温37cc时,同剂量ccNUSOL与CCNUTSL相同时间的抑瘤率分别为35.35%与33.04%,抑瘤率无明显变化¨加热到42cc抑瘤率由36.75%增加为58.87%,30min由50.52%增加为71.69%,抑瘤率明显增加,CCNUTSL中含药量减少到原剂量的1/

31、10时,加热30min抑瘤率仍能达到30.13%,较正常体温37cc组抑瘤率5.41%明显提高(P<0.01).这一结果与体外热敏脂质体在42cc,30man可释放药物达88.64%,而37cc,30min仅释放50.44%相一致.由此可见,将CCNU制成热敏脂质体,结合肿瘤热疗,减小给药剂量在肿瘤部位仍可达到治疗浓度.这一实验结果预示,对毒性较大的抗肿瘤药物,可通过制备靶向制剂达到增加治疗部位药物浓度,降低全身不良反应的目的.进一步动物实验正在进行中.REFERENCES1fFUMG.TANGZS.Researchadvancesofthermosensitiveliposom

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