产淀粉酶的活性芽胞杆菌的分离鉴定与育种0001

1、题目产淀粉酶的活性芽胞杆菌的分离、鉴定与育种摘要第一通过淀粉培育基从土壤中挑选出产淀粉酶的活性菌株，对菌株初步鉴定后进行微波诱变，挑选出产量高、性状优良的正突变菌株，并用正交实验的方式，从发酵培育 基三个要紧成份（玉米粉、黄豆饼粉、酵母粉）对产酶条件进行优化，实验最后利用多 相分类的方式对挑选出的正突变菌株做了菌种鉴定，初步确信为短芽抱杆菌。引言淀粉酶是最先用于工业生产而且迄今仍是用途最广、产量最大的酶制剂产品之一。 淀粉酶种类繁多，特点各异，在造纸、印染、酿造、果汁和食物加工、医药、洗涤剂、工 业副产品及废料的处置、青贮饲料及微生态制剂等多种领域具有广漠的用途1。此刻淀粉酶要紧来源于植物和微

2、生物2并通过发酵完成生产，因此挑选出高产、稳固的淀粉酶 产生菌是淀粉酶生产的头等大事3。本文试图从土壤中分离出产淀粉酶的芽抱杆菌，通 过诱变育种及发酵条件优化来取得高产、稳固的淀粉酶产生菌株。一、 研究方式一、实验材料：河北大学生命科学学院院前的土壤二、仪器设备：高压蒸汽灭菌锅、培育皿、培育基分装器、PH试纸、移液管、吸耳球、玻璃棒、量筒、三角刮、试管、试管架、酒精灯、电子天平、显微镜、三角烧瓶、洗瓶、 接种针、接种环、双层瓶、擦镜纸、德汉氏小管、直尺、记号笔等。诱变箱：微波炉（E30E-3）离心机、721分光光度计：3、培育基和试剂（1）培育基：淀粉培育基、牛肉膏蛋白陈培育基、种子培育基4&

3、#39;7、动身培育基4'7、 糖发酵培育基、明胶培育基、柠檬酸盐培育基、醋酸铅培育基、蛋白陈液体培育基（呷 咪实验）、葡萄糖蛋白陈培育基（.、M. R实验）、硝酸盐液体培育基、酪素培育基（2）试剂：碘液、孔雀绿染液、番红染液、乙醴、呷咪试剂、KOH、a -耐酚、甲基红、格里斯氏试剂、锌粉、3%H2O2、柠檬酸缓冲液、1%淀粉溶液、3,5-二硝基水杨酸 （注：所用药品均为分析纯）。4、实验方式（1）细菌的分离与初步鉴定：将土壤系列稀释，把10-4、10-5、10-6别离涂布到淀粉培育基上，37c倒置、留宿培育，影印，将碘液加到淀粉平板上，记录显现水解圈的单菌落的H/C值5。将显现水解圈

4、的菌落进行芽抱染色，显微观看菌种形态。保菌供下次实验用。(2)微波诱变6:将新鲜斜面上的菌种转接到液体的牛肉膏蛋白陈培育基中 37c下培育18-24h0将 菌液离心、洗涤、稀释，在必然功率下别离诱变 30s、60s、90s,稀释菌液并涂布 到淀粉培育基平板上，37c下留宿培育，别离测水解圈的H/C值，将正突变的菌种 保留到斜面培育基上。(3)高产菌株发酵条件的优化7:通过正交实验对高产菌的发酵条件进行优化，成立高产菌株的最正确摇瓶发酵条件。将诱变取得的菌种接种到种子培育基瓶中培育 12-16h,以后，将种子瓶中的菌液以5% 的接种量别离接种到动身培育基和优化培育基中，发酵 18-24h后，用D

5、NS法测酶活及 制麦芽糖-OD标准曲线，确信最正确发酵条件。水平实验因素玉米粉A (g/L)黄豆饼粉B (g/L)X#C (g/L)1818229224311235表1实验因素与水平试验万因素ABCD111112122231333421235r 2231162312731328321393321表2不同处理的试验结果活性菌株的鉴定8：利用多相分类的方式对所分离的菌株进行鉴定：形态鉴定：个体和群体形态鉴定生理生化反映：将诱变取得的正突变菌株进行以下反映： 糖发酵实验、甲基红实验、实验、柠檬酸盐利用实验、呷咪实验、H2s实验、硝酸盐还原实验、明胶水解实验、过氧化氢酶实验、酪素水解实验、耐盐实验。(

6、注：各实验所用培育基及试剂见附录)二、研究结果和分析1、显微镜观看芽抱染色，可知分离取得的为芽抱杆菌。2、H/C 值(1)在分离芽抱杆菌时，影印以后水解圈粘连在一路，无法准确测得H/C值。分析：可能是所采土样中产淀粉酶的芽抱杆菌含量较多，涂平板之前稀释倍数 不够致使单菌落过于密集，水解圈粘连。(2)紫外诱变后的平板影印：单菌落 透明圈直径/mm(H) 菌落直径/ mm(C)H/C表3 透明圈直径(H)和菌落直径(C)及比值分析：通过结果，可看出通过紫外诱变后，有的菌株产酶活能力有所提高，有的减 小，挑选产酶活能力最高的菌株，保留供后续实验利用。3、正交实验优化发酵条件(1)、麦芽糖标准曲线1.

7、2001.000D( 0.800Oy = 0.5327x + 0.0098R = 0.98450.6000.4000.2000.0000.00.51.01.52.02.5图1麦芽糖标准曲线麦芽糖量(mg分析：标准曲线的精准度不高，缘故要紧有三点：、最后所测三个OD值都超过了 ，显著偏大，可能是稀释倍数不够所致;、本实验所用的分光光度计利用年限已久，不免会造成测量结果有误差;、由于操作失误，忘记每一个试管做平行测量，造成结果不精准。(2)、酶活力的测定试验号 对照 出发 123456789OD5400麦芽糖含量(mg)0表4 DNS法测正交试验后各条件下麦芽糖含量分析：依据标准曲线，计算出各个

8、OD值对应的麦芽糖含量，其中，五、7、八、9四个 实验号对应的测量结果误差太大，不能作为比较酶活大小的依据。(3)、正交实验结果由于DNS法测酶活时，接近一半的结果误差太大，因此正交实验失败，无法取得菌株的最正确发酵条件。4、活性菌株鉴定网(1)、菌落群体形态观看：表面湿润、有不规那么突起，菌落直径可能2-3cm。(2)、生理生化反映结果：、糖发酵培育基颜色由紫变黄，无气泡产生，结果呈阴性。、甲基红实验：滴加甲基红染液后变红，结果呈阳性。、实验：结果不变红，呈阴性。、柠檬酸盐利用实验：无变蓝，结果呈阴性。、呷咪实验：无玫瑰红，结果呈阴性。、H2s实验：无变黑，结果呈阴性。、硝酸盐还原实验：滴加

9、格里斯试剂后，培育基颜色变成玫瑰红，结果呈阳性。、明胶水解实验：结果呈阴性。、过氧化氢酶实验：有气泡产生，结果呈阳性。、酪素水解实验：显现水解圈，结果呈阳性。(11)、耐盐实验：盐浓度为3%、5%、7%的培育基中均有生长的菌落，其中盐浓度为 3%的培育基中菌浓度最高，7%的最少。结果为阳性。综合上述实验结果，初步确信所得菌株为短芽抱杆菌。三、讨论本实验的设计方案具有必然的理论依据，若是操作适当，各方面条件知足，会取得 产淀粉酶的活性芽抱杆菌高产菌株，及该菌株的最正确摇瓶发酵条件。但操作进程存在 很多缺点，致使结果失败，要紧问题有：1、分离芽抱杆菌时，稀释度不够致使水解圈粘连；2、DNS法测OD

10、值时，一部份数据显著偏大，可能是稀释倍数不够所致；3、本实验所用的分光光度计利用年限已久，不免会造成测量结果有误差；4、DNS法测OD值时，由于操作失误，忘记每一个试管做平行测量，造成结果不精 准；5、由于考虑到时刻的限制，实验进程中芽抱杆菌分离时的复筛及突变后的复筛都没 做，假设要取得精准靠得住的实验数据，应该操作完善。另外，诱变存在专门大的不确信性，为使诱变效率提高，运用分子生物学技术对菌株进行基因操作和定向改造，会使菌株选育朝着快捷、高效的方向进展9。以上几点能够作为尔后该实验改良的几点建议，及操作进程中应注意的问题。四、结论通过初筛，从土壤中分离取得产淀粉酶的芽抱杆菌；微波诱变以后，通

11、过挑选，取 得正突变菌株；进一步正交优化发酵条件，探访最正确摇瓶发酵条件；最后利用多相分 类鉴定可知：从土壤中能挑选出产淀粉酶的活性短芽抱杆菌。五、参考文献1张双民.土壤中淀粉酶高产菌株的分离及产酶条件的优化.土壤肥料，2006 022唐 嘉，陈朝银，赵声兰，等.一种初筛产胞外淀粉酶菌株的简化方式A.生物加工 进程，2020, 06 (01): 013燕卫东.贫瘠土壤中淀粉酶产生菌株的挑选.生产与科研实验，2020 (12):734高宏.枯草芽抱杆菌纤溶酶高产菌株选育、发酵条件优化及其分离纯化.南京农业大学，食物微生物及其生物技术，2006 09: 135沈萍，陈向东.微生物学实验.北京：高等

12、教育出版社，2007, 187-1906林云萍.枯草芽抱杆菌B68发酵条件及诱变选育的研究.华南热带农业大学硕士学位 论文，2006 05: 127关志炜.枯草芽抱杆菌发酵产纳豆激酶的研究.食物科学，2007 06: 24-308东秀珠，蔡妙英.常见细菌系统鉴定手册M.北京：科学出版社，2001.a淀粉酶高产芽抱杆菌的选育和鉴定.中国食物学报，2020 09 (06)六、附录(一)、培育基的配制一、淀粉培育基蛋白陈10g,氯化钠5g,牛肉膏5g,可溶性淀粉2g,蒸储水1000mL,琼脂1520g, 121c 灭菌 20min二、牛肉膏蛋白陈培育基蛋白陈10g,氯化钠5g,牛肉膏3g,蒸储水10

13、00mL，琼脂1520g, 121c灭菌20min, 3、种子培育基蛋白陈1%,酵母膏, NaCl1%,琼脂2%,可溶性淀粉4、动身培育基玉米粉 10g,淀粉 15g,豆粉 20g,酵母粉 3g, KH 2PO4 , ZnSO4 , MgSO4 7H2O , 5、糖发酵培育基蛋白陈水培育基1000mL, %澳甲酚紫乙醇溶液（澳甲酚紫溶解到100mL乙醇中）12mL,另配20%糖溶液，蛋白陈水121c灭菌20分，20%糖溶液112c灭菌30 min, 别离灭菌后再混合。六、明胶培育基牛肉膏蛋白陈液100mL,明胶1218g, ,在水浴锅中将上述成份溶化，不断搅拌 溶化后调pH, 121摄氏度灭菌

14、30 min。7、柠檬酸盐培育基NH4H2PO41g, K2HPO41g, NaCl5g,柠檬酸钠 2g,琼脂 1520g,蒸储水 1000mL, 1%澳香草酚蓝乙醇液10mL,将上述各成份加热溶解后，调，然后加入指示剂，摇 匀，用脱脂棉过滤。制成后为黄绿色，分装试管，121摄氏度灭菌20 min后制成斜面。八、醋酸铅培育基的牛肉膏蛋白陈琼脂100mL,硫代硫酸钠，10%醋酸铅水溶液1mL,将牛肉膏蛋白 陈琼脂培育基加热溶解，待冷却至60摄氏度加入硫代硫酸钠调分装于三角瓶中，115 摄氏度灭菌15 min。掏出后待冷至5560摄氏度，加入醋酸铅水溶液，混匀后倒入 灭菌试管中。九、呷咪培育基蛋白

15、陈10g, NaCl5g,蒸储水1000mL, 121摄氏度灭菌20 min10、葡萄糖蛋白陈培育基（.、M. R实验）蛋白陈5g,葡萄糖5g, K2HPO4 2g,蒸储水1000mL,将上述各成份溶于水中，调, 分装试管，112摄氏度灭菌30 min。1 一、硝酸盐液体培育基%, %, %,蔗糖2%, %, 115摄氏度高压蒸汽灭菌30 min。1二、酪素培育基A液：Na2HP04 7H2O ,干酪素4g,加适量蒸储水，并加热溶解B液：KH 2PO4 ,加水溶解A、B液混合后，加入酪素水解液，加琼脂 20g最后用蒸储水定容至1000mL。酪素水解液的配制：1g酪蛋白溶于碱性缓冲液中，加入1%

16、的枯草芽抱杆菌蛋白酶 25mL加水至100mL, 30摄氏度水解1h。用于配制培育基时其用量为1000mL培育 基加入100mL水解液。13、耐盐实验所用培育基蛋白陈10g,氯化钠（别离为30g> 50g、70g）,牛肉膏3g,蒸储水1000mL,琼脂 1520g, 121c 灭菌 20min, （二）、试剂一、碘液碘片1g,碘化钾2g,蒸储水300mL0先用少量（35mL）蒸储水溶解碘化钾，再投入碘片待碘全溶解后，加入水稀释至 300mL0放置棕色瓶中待用。2,、2/试剂对二甲基氨基苯甲醛2g, 95%乙醇190mL,浓盐酸40mL。3、甲基红试剂甲基红，95%乙醇60mL,蒸储水40

17、mL,先将甲基红溶于乙醇中然后加入蒸储水。4、格里斯氏试剂A液：对氨基苯磺酸，10%稀醋酸150mLB液：a -蔡胺，蒸储水20mL, 10%稀醋酸150mL五、%标准麦芽糖溶液称取100mg麦芽糖，用蒸储水溶解并定容至100ml。六、1% 3,5-二硝基水杨酸试剂称取1 g 3,5-二硝基水杨酸，溶于20 ml浓度2 mol/L氢氧化钠溶液中，加入50 ml蒸储 水,再加入30 g四水洒石酸钾钠（C4H4KNaO6 4H2。）待溶解后用蒸储水定容至100 ml, 盖紧瓶塞，勿使CO2进入。7、柠檬酸缓冲液A液（L柠檬酸）：称取C6H8O7 ,用蒸储水溶解并定容至1LB液（L柠檬酸钠）：称取N

18、a3c6H5O7 用蒸储水溶解并定容至1L取A液55mL与B液145mL混匀即为柠檬酸缓冲液八、1%淀粉溶液：称取1g淀粉溶于100mL柠檬酸缓冲液中（三）、酶活测定方式（1）标准曲线的制作（见下表）取7支20 ml具塞刻度试管，预先干净灭菌干燥，编号，按表加入试剂。摇匀，至滚 水浴中煮沸5 min。掏出后流水冷却，加蒸储水定容至20 ml,以1号管作为空白调零点，在 540 nm的波长下比色测定吸光度值。并成立通过吸光度值求麦芽糖含量的回归方程。试剂1234567麦芽糖标准液（mL0H2O （mL）03,5-二硝基水杨酸（mL）麦芽糖含量（mg）0OD5400表5 标准麦芽糖溶液成分表及 OD测定值（2）粗酶液淀粉酶活力测定待测粗酶液的制备：发酵24 h后离心（4000r/min,20min）,搜集上清液即为待测粗酶液。按以下顺序操作：取20 ml具塞刻度试管，预先干净灭