人参皂苷Rh2对LoVo细胞迁移和转移能力的影响及机制讨论0001

1、人参皂音Rh2对LoVo细胞迁移和转移能力 的影响及机制讨论我国结肠癌的发病率呈逐年上升的趋势，联合化疗和生物治 疗有助于提高患者的5年生存率，然而，其药物本身的毒副作用 极大限制了其应用范围。随着传统医学的复兴，越来越多的中药 以及中药单体被应用于临床科学试验。人参皂音Rh2是人参中分离提纯的一种单体，具在各种肿瘤的相关研究中有着较为显著的 作用，研究表明：Rh2能有效抑制人肝癌细胞 SMMC-7721人结肠 癌细胞Caco-2和HT-29、小鼠宫颈癌细胞 U14人食管癌细胞 Eca-109、马立克氏病肿瘤细胞系 MSB4人白血病多药耐药(MDR) 细胞K562/VCR的增殖，提高机体免疫力

2、，引起肿瘤细胞凋亡，导 致肿瘤生长受到抑制。然而，针对人参皂音Rh2对结肠癌转移的实验研究，目前尚无研究报道。目前，体外研究肿瘤细胞的转移能力主要采用Transwell实验。Transwell实验通过检测体外肿瘤细胞的迁移和侵袭能力来判 断肿瘤细胞转移能力的高低。本研究拟采用Transwell实验检测人参皂音Rh2对体外结肠癌LoVo细胞的迁移和侵袭能力的影响， 并初步探讨其分子机制，现报道如下。1材料与方法1.1 细胞和试剂人结肠癌细胞LoVo株由香港科技大学赠送；Rh2购自上海雅吉生物科技有限公司(CatNo.A0241 ,纯度大于982.6mg/g),溶于 二甲基亚碉（DMSO中配成10

3、mmol/L母液分装冻存备用；四甲基偶 氮嚏盐（MTT）购自美国Sigma公司；胎牛血清、液体培养基 RPMI-1640和细胞培养用2.5g/L胰酶购自美国Gibco公司；胶原预 包被的 Transwell（CatNo.3422） 购自美国 Corning 公司；兔抗人 -Tubulin（BM1453）、-catenin（BA0426） 、CD44（BA0321）基质金 属蛋白酶 MMP2（BA3716）基质金属蛋白酶抑制剂J TIMP2（BA0576-2） 和E-Cadherin（BA0475-2）抗体均购自武汉博士德生物工程有限公 司。1.2 主要仪器BoxunSW-CJ-2F型双人双面净

4、化工作台（中国上海博迅实业有 限公司医疗设备厂）;ThermoFisherScientific 细胞培养箱（美国 赛默飞世尔科技公司）;MoticAE2000倒置显微镜（中国麦克奥迪实 业集团有限公司）;IX71 荧光显微镜（日本 Olympus公 司）;iMark680 酶标仪（美国Bio-Rad公司）;Bio-Rad 电泳转膜仪 （美国Bio-Rad公司）等。1.3 MTT法测定不同浓度Rh2对LoVo细胞增殖的影响5103/孔LoVo细胞接种 于96孔板内，完全培养基培养过夜，加入 0、5、10、20、40、 60mol/LRh2分别处理24、48、72h,每个浓度做6个平行孔，采 用酶

5、联免疫检测仪于 490nm处测取每孔的吸光度（D）值。1.4 Rh2 对 LoVo细胞迁移的影响将细胞密度为5105个/mL的LoVo细胞铺于 24孔板（每孔500L）上，加入含体积分数10%台牛血清的RMPI-1640培养液，培养1624h,使形成单层细胞，换成无血清培养基继续培养过夜；用200L移液枪枪头在单层细胞上呈一字划痕，用磷酸 盐缓冲液（PBS）清洗3次；加入5、10、20、40、60mol/L无血清培 养基配制Rh2溶液，平行2个样本，孵育24h,在倒置荧光显微镜 下观察并拍照。最后通过计数爬入一字划痕空白区域内的细胞数 来反映细胞的迁移能力。1.5 Rh2对LoVo细胞转移的影

6、响待测细胞培养至对数生长期，消化细胞，用PBS和无血清培养基先后洗涤1次；用无血清培养基悬浮细胞，计数，调整浓度为 2105/mL,在24孔板（下室）加入600L含体积分数15灿清的培养 基;上室用70L无血清培养基培养箱孵育 3min,吸弃培养基后加入 经过不同浓度的人参皂音 Rh2处理的100L细胞悬液；继续在孵箱 培养24h,用镜子小心取出chamber,吸干上室液体，移到预先加 入约800L甲醇的孔中；室温固定30min,取出chamber,吸干上室 固定液，移到预先加入约800LGiemsa染液的孔中；室温染色30min, 轻轻用PBS冲洗浸泡数次，取出chamber,吸去上室液体，

7、用湿棉 棒小心擦去上室底部膜表面上的细胞，用小镜子小心揭下膜，底 面朝上晾干；移至载玻片上，显微镜下随机取9个大小一致的视野 计数，统计结果。最后通过计数穿膜细胞数来反映细胞的转移能 力。1.6 Westernblot 检测CD44 MMP2TIMP2、ECadherin 和-catenin 表达具体方法参 见文献，对Rh2处理后的细胞进行裂解提取蛋白，经十二烷基硫 酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE分离后转印。转印好的聚偏 二氟乙烯（PVDF）膜封闭后依次加入相应一抗和二抗，膜入发光液中孵育后，用化学发光荧光成像系统对图像进行扫描，最后对蛋 白条带进行灰度值分析。1.7 统计方法应用S

8、PSS17.0统计软件进行数据统计分析。计量资料以均数标准 差(xs)表示，两组之间的比较采用t检验法分析；多组间的比较采 用单因数方差分析法分析，组间两两比较采用SNK-q检验法分析。 按=0.05水平，以P0.05为差异有统计学意义。2结果2.1 Rh2对LoVo细胞活性的影响为了排除药物的细胞毒性或细胞增殖作用对迁移和转移功能 的影响，首先采用MTT法检测不同浓度 Rh2对LoVo细胞生长的影 响。表1结果显示：与空白对照组比较，采用浓度为5、10、20、40mol/LRh2处理LoVo细胞24h后，细胞生长无明显抑制， 差异无 统计学意义；当Rh2浓度mol/L处理24h、浓度 mol

9、/L处理48h、 浓度mol/L处理72h时，LoVo细胞生长明显受到抑制，差异有统 计学意义(P0.05或P0.01),提示人参皂音 Rh2对LoVo细胞活力 的影响有时间和浓度依赖性。所以在后续实验中，把 Rh2作用浓 度控制在40mol/L以内，作用时间为24h进行研究。2.2 Rh2对LoVo细胞迁移能力的影响结果显示：560mol/L浓度Rh2对LoVo细胞迁移的影响结果， 随着药物浓度增加对细胞迁移能力的抑制增强，20mol/L以上浓度的Rh2处理LoVo细胞24h,与空白对照组比较有显著抑制作用 (P0.05)。2.3 Rh2对LoVo细胞转移功能的影响结果显示：560mol/L

10、浓度Rh2对LoVo细胞转移的影响，随着药物浓度增加对细胞转移能力的抑制增强，20mol/L以上浓度的Rh2处理LoVo细胞24h,与空白对照组比较有显著抑制作用 (P0.05),结果与抑制迁移能力一致。2.4 Rh2 对 CD44 MMP-2TIMP-2、E-Cadherin、-catenin 蛋白表达的影响560mol/L的Rh2对各蛋白表达的影响，随着Rh2药物浓度的 升高，与空白对照组比较，CD44 MMP清白表达水平显著下降(P0.05) , TIMP2、E-Cadherin、-catenin 蛋白表达水平显著上升 (P0.05)。3讨论结肠癌是胃肠道中常见的恶性肿瘤，晚期治疗效果不

11、佳，恶 性肿瘤发生侵袭和转移是最终导致患者死亡的主要原因。人参皂 音Rh2单体能抑制癌细胞生长并诱导其凋亡，逆转其异常分化， 抑制肿瘤转移能力，与化疗药物联合应用能提高疗效、减少副作 用。本研究结果显示：一定浓度的人参皂音Rh2能显著抑制LoVo细胞的迁移和转移能力，且抑制作用随着药物浓度的增加而增强， 结果与陶丽华、朴丽花、Kim和姚兴军等关于人参皂音 Rh2能显著 抑制肿瘤细胞的迁移和转移能力的报道相一致。肿瘤细胞的转移 能力与肿瘤细胞内异常表达的某些分子密切相关。-catenin 和E-Cadherin基因介导细胞与细胞之间的黏附，与细胞黏附分子 CD44相互作用，它们的低表达有助于肿瘤

12、细胞的扩散和转移 18-20。而细胞基底膜的降解是肿瘤远处转移的重要因素，基质 金属蛋白酶(MMPs旧组织抑制因子(TIMP)的平衡对维持细胞基底膜的完整具有重要作用。上调 -catenin、E-Cadherin基因表达，促进细胞黏附，下调 MMP并同时上调TIMP2基因表达，阻止细胞外基质的降解，并进而降低与肿瘤远处转移黏附分子 CD44基因的 表达，可以起到抑制肿瘤侵袭与转移的作用。恶性肿瘤的主要生物学特性之一就是肿瘤的浸润与转移，恶 性肿瘤从原位增殖性病变发展到侵袭、转移等复杂过程，其与降 解酶类、黏附分子、癌细胞运动能力及其受体等多种原因都分不 开，细胞外基质的降解、基底膜完整性的破坏

13、，是肿瘤细胞完成 浸润转移的先决条件。阻止肿瘤细胞浸润扩散的天然屏障是基底 膜，正常基底膜是由IV型胶原等成分构成的致密网状结构，固有 细胞不能正常通过。细胞外基质的降解主要由蛋白水解酶来完成， 基质金属蛋白酶 MMP是一类锌离子依赖的细胞外蛋白水解酶，能够降解基底膜，促进恶性肿瘤细胞的侵袭和转移。MMPS舌性的主要调节因子是组织金属蛋白酶抑制剂 （TIMPs） , TIMPs能够与激活 状态的 MMPs即TIMP2与MMP2吉合，从而能够抑制 MMPS勺产生 及其活性，是肿瘤发生恶变与转移的阻抑因素。陈磊峰等研究证 实在原发性肝癌细胞中降低 MMP的表达可以抑制肝癌细胞侵袭和 迁移。王文祥等

14、实验结果表明 TMIP2的表达与非小细胞肺癌伴淋 巴结转移呈负相关，即伴有淋巴结转移的肺癌组织中TMIP2的表达减弱。卢锦娥等研究说明在宫颈癌演变过程中，细胞通过TIMP2表达水平的上调从而起到抑制癌细胞的浸润、转移特性。本研究 结果表明：随着Rh2药物浓度的升高，MMP21白表达水平下降， TIMP2蛋白表达水平上升，二者维持在一个相对平衡稳定的状态， 阻止了细胞外基质的降解， 从而抑制了人结肠癌细胞 LoVo细胞的迁移和转移。E-Cadherin是广泛存在于各类上皮细胞中的钙依赖性跨膜糖 蛋白，主要介导同型细胞间的黏附反应，除具有调节胚胎组织的 发育、组织形成、参与细胞与细胞间信息传递交流

15、等作用外，对 促进细胞的黏附聚集、维持上皮形态结构完整性、维持细胞极性 和参与分化调节也至关重要。E-Cadherin在肿瘤细胞中的表达缺失使细胞间的同质黏附力下降，导致肿瘤易于扩散和转移。包俊 杰等通过实验发现，从正常乳腺组织发展到乳腺癌组织再到腋窝 转移淋巴结组织的过程中，E-Cadherin表达逐渐减少。翁密霞等 也通过实验结果表明，ECadherin的下调与缺失和非小细胞型肺癌 的进展、分化及转移密切相关。吴继锋等的研究结果显示， E-Cadherin表达与肿瘤的类型及分化有关，恶性程度越高、分化 越差的肿瘤其E-Cadherin丧失越明显。本研究结果表明：E-Cadherin蛋白表达

16、水平与 Rh2药物浓度呈正相关，也证明了 Rh2 在抑制人结肠癌细胞 LoVo细胞的迁移和转移方面的作用。-catenin主要位于细胞膜，主要功能为介导细胞间黏附和参 与基因的表达。李进展等研究发现，-catenin 在胃癌组织中的低表达率提示其与肿瘤转移的相关性，而E-Cadherin与-catenin的正相关表达与协同作用提示了它们在肿瘤恶性转移中的意义。本研究结果中，随着Rh2药物浓度的升高，E-Cadherin与-catenin 的表达也呈正相关性的增长， 为Rh2抑制人结肠癌LoVo细胞的迁 移和转移提示重要意义。CD44分子作为一种细胞表面跨膜糖蛋白的黏附分子，分布十 分广泛。其主

17、要参与细胞间及细胞与基质间的特异性粘连过程，在细胞的黏附、血管的形成和肿瘤的浸润和增殖中发挥重要作用姚杰等通过对肺癌的淋巴结转移灶中CD44的表达状态的研究,发现原发灶CD44表达与转移淋巴结 CD44表达呈正相关，提示患者 肺癌病灶中的肿瘤干细胞标记物 CD44表达越高，其发生淋巴转移 的风险也就越高。本研究结果中，CD44蛋白表达水平随着 Rh2药物浓度的升高而下降，再次验证了Rh2在抑制人结肠癌细胞 LoVo细胞的迁移和转移方面的作用。近年来，不止一种中药成方或中药单体被用于研究其对人结 肠癌细胞LoVo细胞侵袭或转移能力的影响，例如安昌勇等研究证实了柳皮素对人结肠癌细胞 LoVo细胞处理48h后，LoVo细胞增殖、 侵袭能力受到明显抑制，其半数