中标的国家自然基金标书

1、申报学科代码1科学部编号项目类别C010704国家自然科学基金申 请 书迷走反射调节胰腺分泌的神经传递机制研究项目名称申 请 者所在单位邮政编码通讯地址电话传真电子信箱(Email):申请日期：2002年3月10日国家自然科学基金委员会1997年制填报说明一、填写申请书前，请先查阅国家自然科学基金有关项目申请办法及规定。申请书各项内 容，要实事求是，逐条认真填写。表达要明确、严谨，字迹 要清晰易辨。外来语要同时用原文和中 文表达。第一次出现的缩写词，须注出全称。二、申请书为十六开本，复印时用B5复印纸，于左侧装订成册。第三页起各栏空格不够 时，请自行加页。一式六份（至少一份为原件），由所在单位

2、审查签署意见后，按申报学科投送国 家自然科学基金委员会对口科学部。地区科学基金项目，申请书另报送省（自治区）科委一份原 件。三、封面右上角“科学部编号”由对口科学部填写，项目类别和申报学科 代码1由申请者 填写。四、下列人员不得作为申请项目的负责人提出申请，但可作为项目组成员参加研究：一在读（含在职）研究生一已离退休的科研人员一申请单位的兼职科研人员五、申请者和项目组中具有高级专业技术职务的主要成员申请（含参加）的项目数，连同在 研的国家自然科学基金项目数（不含重点项目、重大项目），不得超过两项。六、同一项目组研究内容相近的项目，只允许报送一个学科。七、申请者可因同类项目竞争等原因，提出不宜评

3、议本项目的专家名单（姓名与单位，3 人以内），密封于信封中，钉在申请书原件封面，或另专函相关学科，供科学部选择同行评议人 时参考。科学部将对此信息保密。八、国家自然科学基金委员会地址：北京市海淀区双清路83号，通讯地址：北京8610信箱。邮政编码：100085、简表研 究 项 目名称中 文迷；走反射调节胰腺分泌必的神经传递I机制研究英 文The mechanism of the vago-vagal reflex circuit in mediating pancreatic secretion evoked by luminal factors类别A.自由申请B.高技术探索C.青年D.E.重

4、大F. 重点H. 专项 A局技术探索项 目主题号申报 学科名称1消化生理学名称2消化系内科学A.基础研究A代码1C010704代码2C03030204申请金24.00万起止年月2003年1月至200胖用2月甘所用实验室'A.国家重点B.兀部门开放头验至编号1-研 究 内 容 和 意 义摘要通过细FI胞内标记逆向追迷走感'觉细Fl胞由生通过细I内标 记逆向踪能迷走头肠细) 1电生后迷录神结合刀口土腺 m)j U泌功 qp日信kLL 目头传A道孤刺激/I1迷1-IT 背核诵过NPYJ1 LISP1 U 乃1 口调节1 S-1.脂分/ 1J阐明山FJ彳X动神经2兀接受特定刺激) J人

5、兴tXr0七ITJ神经递质IT的胰腺内神经调节11/胰腺内1 T外m八沁功口 J，从r JF中T”从迷-走咸1&神经内外分 1泌功能 11从1而确从-米走:感觉13+1A JTT*主题词1 主题词数量不多于三个；2,主题词之间空一格（英文用/分隔）。中文后Zk英文NeurochemTcal' transmissAA AVago-vagaiAreflex7 vcircuit/Pa ncreatic secreti on简表填写要求一、简表内容将输入计算机，必须逐项认真填写，采用国家公布的标准简化汉字。简表中所有代码以最新发布的国家自然科学基金申请项目分类目录及代码为准填写。高技术

6、探索课题主题号按高技术新概念新构思探索课题项目指南中主题号填写，申请其重点项目时项目类别也填写B,并在申请书封面右上角加注“高技术探索课题重点项目”。二、凡选择性栏目，将相应提示符 A B等之一填入该栏的右下角。三、部分栏目填写要求：项目名称一一应确切反映研究内容和范围，最多不超过25个汉字（包括标点符号）。基础研究一一指以认识自然现象、探索自然规律为目的，不直接考虑应用目标的研究活动。应用基础研究一一指有广泛应用前景，但以获取新原理、新技术、新方法为主要目的的研究。申报学科一一申请项目所属的最基础学科。如涉及多学科可填写两个，先填为主学科。申请金额一一以万元为单位，用阿拉伯数字表示，注意小数

7、点。起止年月一一起始时间从申请的次年 1月算起。终止时间为完成年度的12月。所用实验室一一系指研究项目将利用的实验室，仅填写国家计委批准的国家重点实验室或部门批准的开放实验室。所在单位名称及代码一一按单位公章填写全称。例如“中国科学院西安光学精密机械研究所”不得填“中科院西安光机所”或“西安光机所”。全称中的数字，一律写中文，例如：中国航天工业总公司第七。一所。首次申请国家自然科学基金的单位，尚未编入单位代码，其代码暂不填写。示。 项目组主要成员一一指在项目组内对学术思想、技术路线的制订与理论分析及对项目的完成起重要作用的人员，本人 应在申 请书上亲自签名。本栏双线右侧内容不输入计算机。研究内

8、容和意义一一摘要与主题词均录入软盘。-2-二、立论依据(包括项目的研究意义、国内外研究现状分析，并附主要参考文献及出处)对基础研究，着重结合国际科学发展趋势，论述项目的科学意义；对应用基础研究，着重结合学科前 沿、围绕国民经济和社会发展中的重要科 技问题，论述其应用情景。餐后胰腺分泌是食物消化吸收过程中的重要组成部分，目前认为这一过程 主要由内分泌激素胆囊收 缩素(CCK及迷走一迷走反射作用于胰腺的迷走神经 胆碱能节后神经调节巧。但餐后迷走神经信号的上 传、中枢整合后控制胰腺分 泌信号的下传神经通路及在这一通路中参与的神经递质还未阐明，病理研究 证 实迷走神经初级传入纤维位于肠上皮以下粘膜固有

9、层内，提示肠道接受刺激后 并不直接作用于迷走神 经传入纤维，而通过间接途径起作用。5羟色胺(5-HT)为传递内脏感觉的神经递质，美国Michigan大学胃肠肽研究中心报道迷走神经 初级传入纤维含有大量 CCK-A及5HT3受体，肠道内的刺激，如碳水化合物、高渗盐水及粘膜磨擦等，可导致肠粘膜嗜倍细胞 (EC)释放5HT,继而作用于迷走传入神经末梢的5-HT3受体，引起迷走反射主导的胰腺分泌次。迷走感觉神经元细胞内电生理记录进一步发现5-HT与CCK可能协同作用刺激迷走神经传入纤维。然而这种信号如何上传以及参与其传递过程的神经递质仍不清楚。迷走神经节 (vagal no dose gan glia

10、 )及孤束核(nu cleus tractus solitarius, NTS 为迷走传入的重要部位。迷 走神经节及孤束核内均有多种神 经递质，研究发现谷氨酸盐(glutamate, Glu)及P物质(substance P, SP)在迷走神经节内合成并释放至孤束核，而起兴奋性神经递质作用。Glu及SP是否参与肠道 刺激后迷走神经的信号传入尚未见报道。我们推测肠道刺激后，肠道EC细胞释放5-HT, 5-HT作用于 迷走初级传入神经末梢的5HT受体，兴奋迷走传入神经，将信号传至迷走神经节，迷走神经节利用Glu及SP作为兴奋性神经递质将信号传至孤束核。因此，在本研究的前半部分，我们将通过肠腔刺激观

11、察迷走神经节内兴奋 性神经元神经递质Glu及SP的表达，并通过神经元细胞内电生理记录证实Glu及SP作为兴奋性神经递质参与信号上传。同时孤束核内Glu及SP受体表达 增加，电生理记录确定兴奋性神经元，通过神经元染色证实迷走传入神经将Glu主SP作为兴奋性递质 将外因刺激的信号传至中枢。中枢对胰腺分泌功能的调节主要是通过迷走运动背核(dorsal motor nucleus, DMN )发出的副交 感运动神经起作用。以往零星的研究发现DMN微量注射甲状腺素激素(thyrotropin-releasing hormone, TRH能刺激胰腺分泌， 而胰多肽(pancreatic polypepti

12、de, PP )则能抑制胰腺分泌何。脑内注射生 长抑素(somatostatin, SS)、钙调基因相关肽(caldtonin gene-regulated peptide, CGRP及胰高血糖素类似肽(61呢39011- like-peptide-1,GLP-1 )亦 对胰腺分泌有抑制作用-% 但各种中枢神经递质调节胰腺分泌的作用通 路，它们对迷走传出神经功能的调节、对胰腺内神经元的调控，以及特定神经递质 对胰腺分泌的特异性 调节作用尚未见报道。DMN勺迷走传出神经对胰腺分泌的调控是非常复杂的，其方面接受NTS的传 入信息、，另方面也接受高级中枢3a 节是众多兴奋性神经递质与抑制性神经递质综

13、合作用的结果，迷走神经传出纤 维作用于胰腺内神经,后 者综合各种中枢信息，调节胰腺功能。研究发现DMN迷走传出神经有多种神经递质，如乙酰胆碱、NOS及各种神经肽(VIP、NPYGRP等，因此，我们推测特定的刺激可以作用于某一组迷走运动神经元，它们有特定的神经递质，这 些传出纤维作用于具有不同的特有神经递质的胰腺内神经元，从而调控不同的胰腺功能。综上所述，虽然以往的研究已经发现肠道刺激后，肠粘膜EC释放5-HT,作用于迷走传入神经末 梢5-HT3受体最终引起胰腺的分泌，但这种刺激上传通路及参与的神经递质均不明确。DMN内微量注 射某些神经递质已证实对胰腺的分泌功能有兴奋或抑制作用，但中枢传出对胰

14、腺分泌的调控通路及其相 关的神 经递质尚不清楚。因此，我们设计了本研究，希望能初步确定肠道刺激引起胰 腺分泌的一个完整 的神经通路，即肠道刺激激发迷走传入冲动到NTS DM1传出冲动到胰腺调节胰腺分泌功能。这一研究将证实存在脑-胰通路(Brai n-Pa ncreas In teraction )的假说，丰富对胰腺分泌调节机制的认识，对胰腺疾病的救治具有 重要的意义。参考文献1. Li Ying, Owyang C. Endogenous cholecystokinin stimulated pancreatic enzyme secretion viaa vagal afferent pat

15、hway. Gastroenterology, 1994;107(2) :525-5312. Li Ying, Hao Y, Owyang C. High-affinity CCK-A receptors on the vagus nerve mediatesCCK-stimulated pancreatic secretion in rats. Am J Physiol, 1997;273(3Pt1 ):G679-G6853. Li Ying, Owyang C. Pancreatic secretion evoked by cholecystokinin andnon-cholecysto

16、kinin-dependent duodenal stimuli via vagal afferent fibers in rat. J Physiol, 1996;491 (3):773-7824. Li Ying, Hao YB. Zhu JX, OwyangC. Serotonin released from intestinal ECcells mediate luminal non-CCK stimulated pancreatic secretion in rats. Gastroenterology, 2000;118(6):1197-12075. Li Ying, Hao YB

17、, Zhu JX, Owyang C. Intestinal serotonin acts as a paracrine substance tomediate pancreatic secretion stimulated by non-CCK dependent luminal factors. AmJ Physiol, 2001 ;281(4):G916-G9236. Zhu JX, Wu XY, Owyang C, Li Ying. Electrophysiological evidence that intestinal 5-HT actsas a paracrine to medi

18、ate vagal signal transmission evoked by luminal factors in the rat.J of Physiol, 2001 ;530(3):431-4427. Li Ying., WuYX, OwyangC. Serotonin and cholecystokinin synergistically stimulate at vagal primary afferent neurons. Gastroente (6) ogy, 2001 ;120(5):A38328. Granata AR, Sved AF, Reis DJ. In vivo r

19、elease by vagal stimulation of L-(3H) glutamic acid in the nucleous tractus solitarius preloaded with L-(3H) glutamine. Brain Res Bull, 1984;12(1)：5-9.9. Okumura T, Taylor IL, Pappas TN. Microinjection of TRHanalogue into the dorsal vagal complex3b10. Okumura T, Pallas TN, Taylor IL. Pancreatic poly

20、peptide microinjection into the dosal motor nucleus inhibits pancreatic secrtion in rats. Gastroenterology, 1995;108(5): 1517-2511. Li Ying, Jiang YC, OwyangC. Calcitonin gene-regulated peptide inhibits pancreatic exocrine secretion by modulation of vagal parasympathetic outflow. Am J Physiol, 1998;

21、275(5Pt1):G957-G96312. Li Ying, Owyang C. Somotostatin inhibits pancreatic enzyme secretion by a central vagal site of action. Am J Physiol, 1993；265(28)： G251-G25713. Li Ying, Zhu JX, Rillamas E, Nozu F, OwyangC. Glucagon-like-peptide-l acts via dorsal vagal complex to inhibit pancreatic enzyme sec

22、reation. Gastroenterology, 1998;114 (4): G474114. Li Ying, Wu XY, Owyang C. Hypothalamic regulation of pancreatic secretion is mediated by central cholinergic pathway. Gastroenterology, 2000;118(4): A13115. Rogers RC, McTigue DM, Hermann GE. Vagal control of digestion: modulation by central neural a

23、nd pheripheral endocrine factors. Neuroscience and Biobehavioral Reviews,1996;20(1)：57-6616. Wang J, Zheng H, Berthoud H. Functional vagal input to chemically identified neurons in pancreatic ganglia as revealed by fos expression. Am J Physiol, 1999;277(5Pt1 ):E958-E9643c -三、研究方案4a 1 .研究目标、研究内容和拟解决的

24、关键问题 研究目标肠道接受刺激后，迷走感觉神经利用谷氨酸盐(Glu)、P物质(SP)作为神经递质肠道接受刺激后，迷走感觉神经通过Glu、SP将信息传递到孤束核，孤束核内Glu受体及SP受体 增加，亦参与这一迷走传入通路肠道接受刺激后，迷走运动背核通过SP神经肽(neropeptide, NPY)兴奋有特定神经递质的胰腺内神经元，刺激胰腺分泌；并通过生长抑素(SS)作用于有特定神经递质的胰腺内神经元，抑制胰腺分泌研究内容肠道刺激后，迷走感觉神经神经递质传递机制 利用c-Fos的表达确定肠道接受各种刺激(碳水化合物、高渗盐水、5-HT)后，迷走神经节(vagal no dose gan glia)

25、内的迷走感觉神经元 通过免疫组化双重染色，观察c-Fos阳性神经元Glu及SP的表达，说明肠 道刺激后迷走感觉神经Glu及SP表达增加 通过迷走感觉细胞的电生理记录及细胞内神经微粒(neurobiotin) 标记，确定肠道刺激后被兴奋的迷走感觉神经元，联合细胞内神经微粒标记及免疫组化双重染色确定这些迷走感觉神经元利用Glu及SP作为神经递质孤束核对肠道刺激的反应 利用c-Fos的表达确定肠道接受各种刺激(碳水化合物、高渗盐水、5-HT)后，孤束核(nucleus tract us solitarius, NTS)内的迷走感觉神经元 通过免疫组化双重染色，观察cFos阳性神经元Glu受体及SP受

26、体的表 达，说明肠道刺激后 NTS迷走感觉神经Glu受体及SP受体表达增加 通过NTS内迷走感觉细胞的电生理记录及细胞内神经微粒标记，确定肠道刺激后被兴奋的迷走感觉 神经元，联合细胞内神经微粒标记及免疫组化双NTS内微量注射Glu受体阻断剂或SP受体阻断剂后，观察胰腺分泌功能，说明阻断这一上传通路，中枢对胰腺分泌的调节不能下传肠道刺激后迷走运动背核对胰腺分泌的调节 肠道接受刺激后，胰腺内注射荧光标记霍乱毒素B（CTB）,逆向追踪迷走运动背核（dorsal motor nucleus, DMN）内CTB阳性神经元（支配胰腺神经 元）。利用双重免疫 荧光标记观察CTB阳性神经元c-Fos、乙酰胆磴

27、转移酶（ChAT）、Glu受体及SP受体的表达，说明DMF内支配胰腺的神经元可被肠道刺激激活 通过微量注射法，脑室内或DMF内注射NPY受体拮抗剂、SP受体阻断剂、NPYSPSS,通过 迷走神经胰腺枝的电生理记录，确定上述神经递质可作用于DMN调节迷走神经到胰腺的传出信 号，调节胰腺的分泌功能 肠道接受刺激后，DMh内微量注射SPNPYSS,观察胰腺内迷走神经元（c-Fos阳性），利用双重免疫荧光标记，观察c-Fos阳性神经元ChAT胃拟解决的关键问题迷走神经节迷走感觉神经元内电生理记录迷走神经节迷走感觉神经元内神经微粒注射孤束核内迷走感觉神经元内电生理记录孤束核内迷走感觉神经元内神经微粒注射

28、迷走运动背核内微量注射法迷走神经胰腺枝电生理记录双重免疫荧光标记4b2.拟采取的研究方法、技术路线、实验方案及可行性分析研究方法利用c-Fos表达阳性确定迷走神经节、孤束核、迷走运动背核及胰腺内迷走 感觉神经利用免疫组化双重染色研究迷走神经节内c-Fos阳性神经元Glu、SP等神经 递质表达利用荧光免疫组化双重染色研究孤束核内cFos阳性神经元Glu受体及SP受体表达通过迷走感觉细胞的电生理记录，确定肠道刺激后被兴奋的迷走感觉神经元，免疫组化双重染色确定这些迷走感觉神经元利用Glu及SP作为神经递质。荧光免疫组化双重染色研究孤束核内被兴奋神经元Glu受体及SP受体表达胰腺内注射荧光标记霍乱毒素

29、B （CTB）,逆向追踪迷走运动背核内CTB阳性神经元（支配胰腺神 经元）。利用双重免疫荧光标记观察CTB阳性神经元c-Fos.乙酰胆磴转移酶（ChAT）、Glu受体及SP受体的表达通过微量注射法，脑室内或DMF内注射NPY受体拮抗剂、SP受体阻断剂、NPY SPSS,通过迷 走神经胰腺枝的电生理记录，确定上述神经递质可作用于DMN调节迷走神经到胰腺的传出信号，调节 胰腺的分泌功能通过迷走运动背核内微量注射SPNPYSS,利用双重免疫荧光标记，观察胰腺内迷走神经元ChAT 胃泌素释放肽等神经递质的表达技术路线肠道刺激后迷走感觉神经的神经递质传递机制奋时伴SP Glu表-5a 一孤束核对肠道刺激

30、的反应肠腔内灌注各种刺激液（高渗盐水、5-HT或碳水化合物）孤束核（nucleus tractus solitarius.-5b 一肠道刺激后迷走运动背核对胰腺分泌的调节肠腔内灌注各种刺激液（高渗盐水、5HT或碳水化合物）脑室注射NPYSP 受体拮抗剂DM儆量注射NPYSPDMNt 量 注射SSCTB阳性确定DMN支配胰腺神经元双重免 疫荧光CTB阳性C-Fos表达ChAT表达SP受体表达Glu受体表ST说明DMN 神经元可被 肠道刺激迷走神经胰腺枝电生理记录观察放电情胰腺分证明DMN 通过NPYSP SS 调节胰腺分C-Fos阳性神经元ChAT表达GRP表达说明特定 的刺激通 过特定的 神经

31、递质，作用 于特定的 胰腺内神 经元，发 挥调节5c可行性分析课题组已取得本研究初步预实验结果： 肠腔灌注后，迷走神经节c-Fos表达增加，免疫组化双重染色提示c-Fos阳性神经 元内Glu表达增加（图1） 已建立迷走神经节电生理记录方法（图2）,肠腔灌注5HT后迷走神经节内神经 元放电增加（图3）已完成迷走感觉神经元内神经微粒注射方法，双重免疫组化染色显示迷走神经元中 富含SP （图4） 肠道灌注刺激后，孤束核内神经元cFos表达增加，免疫组化双重染色 提示c-Fos 阳性神经元Glu受体表达明显增加（图5） 孤束核内微量注射Glu受体阻断剂可减少肠腔灌注5HT后胰腺分泌（图6） 胰腺内注射

32、荧光标记CTB逆向追踪至迷走运动指核，见CTB免疫荧光阳性神经 元，神经元内ChAT c-Fos. NK1受体表达增加（图79） 建立迷走神经胰腺枝电生理记录方法，迷走运动指核内注射NPY电活动明显增加（图10） 迷走运动背核内微量注射SP,胰腺内神经元c-Fos表达增加，c-Fos阳性神经元内 ChAT表达增加（图11）上述预试验结果表明，课题组已掌握了完成本研究的关键技术，能够成功解决关键问题。-5d 一3 .本项目的特色和创新之处本研究使用的免疫组化双重染色及多重染色技术、活体内电生理记录技术 均为当今世界 先进的技术，结合胰腺分泌功能的研究将确定一个完整的神经通路，即肠道刺激激发迷走传

33、 入冲动到孤束核，迷走运动背核传出冲动到胰腺调节胰腺分泌功能。这一研究将证实存在脑-5f 一一胰通路(Brai n-Pa ncreasIn teraction )的假说，丰富对胰腺分泌调节机制的认识。4 .年度研究计划及预测进展2003年1月2003年12月（第一年度） 肠道刺激后迷走神经节c-Fos表达c-Fos阳性神经元Glu、SP表达肠道刺激后迷走神经节电生理记录迷走神经节神经元神经微粒标记及Glu、SP表达 肠道刺激后孤束核c-Fos表达c-Fos阳性神经元Glu、SP表达2004年1月2004年12月（第二年度）肠道刺激孤束核神经电生理记录 孤束核内神经元微粒标记及Glu受体、SP受

34、体表达 孤束核内微量注射Glu受体阻断剂对胰腺分泌的调节 胰腺内注射，逆向追踪，迷走运动背核c-Fos表达c-Fos阳性神经元Ch AT Glu受体及SP受体的表达2005年1月2005年12月（第三年度）迷走运动背核微量注射对迷走神经胰腺枝电生理作用及胰腺分泌功能的影响 迷走运动背核微量注射对胰腺内迷走感觉神经元的影响 课题总结，发表论文，申报成果5 .预期研究成果初步确定脑一胰轴（Brain-Pancreas Interaction ）的神经通路，即肠 道刺激激发迷走传入至孤束核，迷走运动背核传出冲动到胰腺，调节胰 腺分泌。 本研究完成后，将申报国家科技成果奖。SCI收录期刊上发表论文数篇

35、。6四、研究基础1 .与本项目有关的研究工作积累和已取得的研究工作成绩2 .已具备的实验条件，尚缺少的实验条件和拟解决的途径（包括利用国家重点实验室和部门 开放实验室的计划与落实情况）7-6.申请者和项目组主要成员的学历和研究工作简历，近期已发表与本项目有关的主要论着目录和获得学术奖励情况及在本项目中承担的任务；青年科学基金申请者还应注明学位论文名称及导师姓名与工作单位论文：作者题目刊名年份卷（期）页码 专着：作者书名出版者年份8a 论文：作者题目刊名年份卷（期）页码 专着：作者书名出版者年份8c 五、经费预算支出科目金额（万元）计算根据及理由1 .合计2 ,科研业务费3 .科研业务费4 ,仪

36、器设备费5 .实验室改装费6 .协作费7.管理费注：预算支出科目按下列顺序填写：1 .科研业务费2.实验材料费3.仪器设备费4.实验室改装费5.协作费6.项目组织实施费。开支范围详见国家自然科学基金资助项目财务管理办法第二章。9-六、申请者正在承担的其它研究项目（攀登计划、863计划、攻关任务和各部委、省市任务等项目的名称及编号、任务来源、起止年月、负责或参加以及与本申请项目的关系等情况）七、申请者承担（负责或参加）国家自然科学基金资助项目的情况批准号项目名称起止年月负责或参进展或完成情况加-#-对申请者负责的前一个已结题科学基金资助项目（项目名称及批准号）完 成情况，后继研究进展及 与本申请项目的关系加以详细