转基因植物疫苗研究进展

1、转基因植物疫苗研究进展 主要内容主要内容 1 转基因植物疫苗的概念及其发展历史 2 利用转基因植物生产疫苗的原理及基本方法 3 转基因植物疫苗种类及应用 4 转基因植物疫苗的优点 5 转基因植物疫苗研究中的问题及解决办法 6转基因植物疫苗研究进展及展望1.转基因植物疫苗的概念及其发展历史 转基因植物疫苗：利用基因工程技术，将病原病原微生物的抗原编码基因微生物的抗原编码基因进行克隆重组,导入植物细胞生成转基因植物,进而表达产物，它能激发粘膜免疫,使机体产生特异性抗病能力 。发展史1989，Hiat首次在Nature发表了转基因植物疫苗的研究；1990年,Curtiss等人在烟草种子中表达了具抗原

2、性的变异链球菌表面蛋白获得成功。1992年,ason等人在烟草中又表达了乙肝表面抗原(BsAg);至今，有70多篇研究论文发表，有的进入临床阶段。 世 界 第 一 种 口 服 植 物 疫 苗2 2. .植物疫苗基本原理及方法植物疫苗基本原理及方法 原理：转基因植物疫苗或植物疫苗是把植物基因工程技术与机体免疫机理相结合,生产出能使机体获得特异性抗病能力的疫苗。 动物试验已证实，转基因植物表达的抗原蛋白经纯化后仍保留了免疫学活性，注入动物体内则能产生特异性抗体。 农杆菌转化原理农杆菌是从土壤中分离出来的革兰氏阴性细菌，根据宿主范围和致病症状可分为五种。其中研究最多也最透彻的是根癌农杆菌，农杆菌通过

3、侵染植物伤口进入细胞后能将自身Tumor-inducing(Ti)质粒的一段DNA（T-DNA）插入到植物基因组中，并且可以通过减数分裂稳定的遗传给后代。科研人员将目的基因插入到经过改造的T-DNA区，借助农杆菌的感染实现外源基因向植物细胞的转移与整合，然后通过细胞核组织培养技术，再生出转基因植株。农杆菌介导法起初只被用于双子叶植物，近年来，农杆菌介导转化在一些单子叶植物（尤其是水稻）中也得到了广泛应用。 1、获取目的基因 2、基因表达载体的构建：将目的基因与载体用DNA连接酶连接起来。 3、将目的基因导入受体细胞 ：将含目的基因的重组质粒导入农杆菌。 4、目的基因的检测与鉴定 5、将成功表达

4、的细胞导入植物体内。农杆菌转化原理加入乙肝疫苗的转基因土豆2.1利用植物生产疫苗的程序2.1利用植物生产疫苗的程序 疫苗目的基因的克隆; 高效植物表达载体系统的构建; 植物细胞的遗传转化; 受体细胞的组织培养及植株再生; 抗性植株的筛选和分子鉴定; 转化植株栽培及种植; 目标产品的提取、分离和纯化及免疫学实验等。2.2 主要表达系统 (1)稳定的整合表达系统 ：一般以根癌农杆菌环状Ti质粒上的DNA片断为载体,把编码结构性抗原决定簇参与诱导保护性免疫应答的病原体DNA序列导入植物细胞内,并整合到染色体上,整合了外源基因的植物细胞在一定的条件下长成新植株,这些植株在生长过程中可表达出疫苗,并把这

5、些性状遗传给子代,形成表达疫苗的植物品系。 (2)瞬时表达系统 ：主要是利用基因工程植物病毒(如烟草花叶病毒、豇豆花叶病毒)为载体,将编码疫苗抗原决定簇基因序列插入植物病毒基因组中,再用此重组病毒感染植物,抗原基因随病毒在植物体内复制、装配而得以高效表达。 利用稳定表达系统的优点 1 能够获得大量稳定遗传的转基因株系； 2 获得的转基因植株可以通过无性或有性繁殖方式获得大量后代； 3 可以选择外源抗原的表达器官,调节外源蛋白的组织特异性,有利于蛋白纯化； 4 可以同时将多个外源基因与植物基因组重组,从而获得多基因复合疫苗产品。 利用植物病毒作为表达载体优点 1 病毒增殖水平较高,可使外源基因有

6、高水平表达; 2 病毒繁殖速度快,外源基因在接种后12周内就可达到最大量的积累; 3 植物病毒的基因组小,易于进行遗传操作; 4 植物病毒可以感染单子叶等非农杆菌寄生植物,扩大了适用植物的范围。3 转基因植物疫苗种类及应用 1990年,在转基因烟草中用农杆菌介导转化法表达出约占烟草蛋白0.02%的变异链球菌表面蛋白(spaA); Mason(1992)提出了利用转基因植物生产可食用疫苗的概念; 在短短10年左右的时间里,已经有十几种病毒或细菌的抗原基因在转基因植物中获得表达,且基本保留了其天然免疫原性。 乙型肝炎疫苗等基因已在转基因植物中报道的植物疫苗主要种类 (1)细菌疫苗:主要有大肠杆菌热

7、不稳定毒素B亚单位疫苗和霍乱毒素B亚单位疫苗。 (2)病毒疫苗:目前研制出的病毒疫苗有乙型肝炎疫苗、免出血症病毒疫苗、口蹄疫病毒疫苗、传染性胃肠炎冠状病毒疫苗、狂犬病病毒疫苗、诺沃克病毒疫苗、传染性胃肠炎病毒疫苗、呼吸道合胞病毒疫苗等。(3)寄生虫疫苗: 李霞等将疟原虫多表位抗原(AWTE)基因与CT-B基因融合构建植物表达载体转化烟草,经PCR检验证实成功, 经Westernblotting等分析表明特异表达的融合蛋白是CT-B和AWTE基因的结合,具有二者的抗原活性。(4)避孕疫苗: 哺乳动物受精过程中精卵结合是具有种属特异性的,这种特异性是由精子表面的特异蛋白与卵细胞透明带ZP3糖蛋白通

8、过受体配体模式进行的。Fitchen等将小鼠ZP3蛋白的一个抗原决定簇融合表达在TMV的衣壳蛋白中,在感染的植物中产生高水平的融合蛋白,用该蛋白免疫小鼠,小鼠体内产生了抗ZP3的特异性血清抗体,能识别ZP3的合成肽。4 转基因植物疫苗的优点 成本低廉； 疫苗易于口服，安全方便； 口服疫苗比传统疫苗更有效； 它能对真核蛋白质进行准确的翻译后加工修饰,使三维空间结构更趋于自然状态 ； 易于存储和分发,无需冷藏设备,可长期随时供给。传统疫苗 经典疫苗制备的基本过程包括：选择适宜的培养基或细胞进行茵、毒株大量繁殖，收集培养物，提纯，半成品捡定，稀释，分装，成品检定； 疫苗的基本成分包抗原、佐剂、防腐剂

9、、稳定剂、灭活剂及其他活性成分。传统疫苗的成份5 转基因研究中的问题及解决办法 重组蛋白的表达问题 （主要）； 重组蛋白的转译后修饰及糖基化问题； 用于口服时易被消化及其作用机理问题； 表达产物的提取加工费用问题； 口服抗原疫苗免疫耐受方面的问题。 重组蛋白的表达问题 重组蛋白的表达量低,表达效率不稳定 在已报道的研究中,外源基因所表达的重组抗原蛋白,大约只占植物中可溶性蛋白的0.01%0.37%; 转基因沉默 由于外源基因的甲基化及基因共抑制等而使外源基因的表达不稳定.提高表达水平的一些方法 1 优化密码子的使用； 2 启动子的选择； 3 对目的基因进行改造与优化（使用植物偏爱密码子）； 4

10、 特定调控序列的使用（增强子、内含子使用）； 5 消除位置效应（应用核基质结合区以及定点整合技术）； 6 外源蛋白的靶向表达（蛋白体、种子中的质体、叶绿体等）。选择合适启动子 双子叶植物：35启动子； 单子叶植物：Actin、bi启动子； 特异性启动子 种子特异性启动子、果实特异性启动子、叶肉细胞特异性启动子、根特异性启动子、损伤诱导特异性启动子、化学诱导特异性启动子、光诱导特异性启动子、热激诱导特异性启动子等。 复合式启动子优化密码子 选择植物偏爱的密码子； 外源基因的含量和分布与宿主染色体尽量一致或接近, 防止宿主识别系统对外源基因的甲基化。6 研究进展6 展望 尽管利用转基因植物生产口服疫苗存在许多问题,其前景仍是十分美好的; 对于世界上偏僻落后贫穷的国家和地区的人们、对动荡不安的发展中国家的人们以及发达国家的穷人们而言可以通过服用廉价的植物疫苗获得抵抗疾病的免疫力; 可以肯定,利用转基因植物生产的食用疫苗将成为人类防治疾病的又一有力工具。对待转基因食品的态度 除了美国人对转基因食品情有独钟外,世界各国似乎都对转基因食品心有疑虑,其中