伪狂犬病检测方法样本

1、十一、伪狂犬病检测方法伪狂犬病病毒分离鉴定1材料准备DMEM 培养基、BHK-21细胞、 新生犊牛血清、青霉素、 链霉素溶液、0.22ul微孔滤膜、 细胞培养瓶、CQ培养箱、倒置显微镜。溶液配制见附录A（标准的附录）2操作步骤2.1 病料的采集对于刚死亡或活体送检并处死的动物，无菌采取肝、脾、肺、肾及其脑组织，特别是三叉神经节、嗅球，4 C送实验室检测。2.2 样品处理 待检组织在灭菌乳钵内剪碎，加入灭菌玻璃砂研磨，用灭菌生 理盐水或DME®养基制成1: 5孚1剂，一70C重复冻融后，经3000rpm离心30 分钟后，取上清液经0.22叱m微孔滤膜过滤后，加入青链霉素溶液至最终浓度

2、为100U/mL, 70C保存作为接种材料。2.3 病料接种将病料滤液接种已长成单层的 BHK-21细胞，接种量为培养基 量的10%, 37。叵温箱中吸附1小时后，加入含10麻生犊牛血清（经过56c水 浴灭活30分钟，过滤除菌，无支原体）的DMEMf养基，置37c温箱中培养。2.4 观察结果 接种后24-48小时，BHK-21细胞应出现典型的细胞病变效应（Cyto pathogenic effect, CPE）,表现为细胞变圆，脱落。如第一次接种不出现CPE,应将细胞培养物冻融后盲传三代，如仍无CPE,则判为伪狂犬病病毒 阴性。2.5 病毒的鉴定 将出现CPE的细胞培养物重复冻融后，用聚合酶链

3、式反应、 荧光抗体试验等两种方法中任一方法作进一步鉴定。伪狂犬病聚合酶链式反应1材料准备：待检组织、 组织匀浆器、 蛋白酶K,十二烷基磺酸钠（SDS）,苯 酚、氯仿，异戊醇（分析纯）、TEN缓冲液。溶液配制见附录 C（标准的附录） 引物：扩增伪狂犬病病毒基因中434651bp之间217bp基因片段，由上海 生物工程公司合成。序歹U为，上游引物 P1: 5' -CAGGAGGACGAGCTGGGQCT- 下游引物 P2: 5' -GTCCACGCCC-CGCTTGAAGCT-3仪器设备有：凝胶电泳紫外线检测仪，PCR扩增仪，电泳仪 2操作步骤：2. 1样品的采集：对于病死或扑杀动

4、物，取脑组织；对于待检活猪，用已灭菌 的棉签，伸入猪鼻腔中，采取鼻粘液，即为鼻拭子，冷藏条件送实验室检测。2.2 样品处理 所采病料经组织研磨器充分研磨，按1:5用TENS冲液悬浮收集 于离心管内，-70 C重复冻融3次，7000r/min 离心5min,如样品为鼻试子，则 加入2ml TEN缓冲液，充分挤压，取出棉签，7000rpm,离心5分钟，取上清 液。取上清液472.5屋，加入25履10%SDSF口 2.5屋 的20mg/ml蛋白酶K, 50C 水浴摇床上放置2h后加入等量的饱和酚500仙l,涡旋20s。离心取上清液，加 等量的酚：氯仿：异戍醇（25:24:1）抽提一次，再用氯仿：异戍

5、醇（24: 1）抽 提一次，最后用乙醇沉淀，真空抽干后加入20履 双蒸水溶解，-20 C贮存备用。2.3 . PCR的操作程序 先将制备的模板DNAS 100c水浴10分钟作变性处理, 然后立即放于冰浴中。PCFS应体系为：总体积25屋，含有50m?mol/L KCl,10mmol/L Tris-HCl( pH 9.0) , 0.1% Triton X-100?, ?100? m mol/L dNTPs, 0.35mol/L 引物，2 m mol/L MgCl 2,及 0.5U Taq 酶，1 仙 l 模板 DNA常见的反应体系组成如下10 X缓冲液2.5 川15mM MgCl2 2.5履dN

6、TPs 2.0仙 l引物各2.0履Taq聚合酶 1.0 川DNA 模板 2.0 仙l灭菌去离子水11.0 履矿物油约20履扩增条件为：94 C变性3分钟，进入循环，94 C 60秒，65 C 60秒，72 C 60 秒，40个循环后72c延伸5分钟。2.4 PCR产物的检测PCR扩增产物在1 %的琼脂糖凝胶上电泳，澳化乙锭染色，在紫外光下观察结果。为进一步进行PCFT增产物的特异性鉴定，可取PCR 产物用Sall酶切，酶切产物在2%琼脂糖凝胶上电泳，EB染色，在紫外光下观 察并与标准分子量比较，可见产生的140bp和77bp两个片段。伪狂犬病荧光抗体试验1材料准备：碳酸盐缓冲甘油、磷酸盐缓冲液

7、、 丙酮（分析纯），伪狂犬病荧光抗体、 冰冻切片机，荧光显微镜。溶液配制见附录 D（标准的附录）2操作步骤2.5 样品采集扑杀可疑动物，取大脑、淋巴结、扁桃体迅速送检实验室，如不能及时送出，必须冻结保存，避免腐败、自溶。本法也可用于对疑似伪狂犬病病毒的培养物进行鉴定。2. 2切片制备 将样品组织块切成1cm x 1cm的面，不经任何固定处理， 直接贴于冰冻切片托上，进行切片，切片厚度要求 5 7um,将切片展贴于 0.8mmx 1mm1的洁净载玻片上。2. 3固定：将切片置纯丙酮中固定15分钟，取出立即放入0.01mol/L, pH7.2 的磷酸盐缓冲液中，轻轻漂洗34次，取出，自然干燥后尽快

8、进行荧光抗体染色。2. 4染色 将伪狂犬病荧光抗体滴加于切片表面，置温盒内于37c作用30分 钟，取出后放入磷酸盐缓冲液中充分漂洗，再用0.5moL/L, pH9.0 9.5碳酸盐 缓冲甘油封固盖片（0.1mm厚），染色后应尽快镜检，必要时可放置低温待检。2. 5观察将染色后的切片标本置激发光为蓝紫光或紫外光的荧光显微镜下观察。2. 6判定：于荧光显微镜视野中，见细胞中出现明亮的黄绿色荧光，判为伪狂犬病病毒感染阳性。伪狂犬病微量中和试验（固定病毒，稀释血清法）1材料准备0. 25烟酶（配制见附录B）、BHK-21细胞，多道可调微量移液器，96孔 细胞培养板，CO2培养箱，倒置显微镜。2操作步骤

9、2.1 病毒半数组织细胞感染量（TCID50）的测定：2.1.1 病毒培养和收获将伪狂犬病毒接种于长成单层的 BHK-21细胞，接种量为液体培养基量的10%,37c培养，待出现病变后，冻融，收获病毒。2.1.2 病毒的滴定 用DMEM1养基将伪狂犬病病毒作连续10倍稀释，即10 1、10 2每个稀释度取100八 加入96孔细胞培养板中，随后加入经0.25% 胰酶消化的BHK-21细胞100仙L（细胞含量以105/mL左右 为宜），每个稀释度 作8个重复，并设空白细胞培养对照。置37C 5%CO培养箱中。2.1.3 TCID 50计算 逐日观察细胞病变，并记录细胞病变孔数，直到对照细 胞老化脱落

10、为止。按照Reed-MuenchS计算病毒的TCIg（具体的计算示例见附 录B）。2.2 中和试验将无菌采集的待检猪血清置 56c水浴灭活30分钟。用DMEM培养基作倍比稀释，在细胞培养板各孔中加入 50 nL培养基，随后在第一孔中 加入经待检猪血清50 nL混合后，用微量移液器取出50仙L,加到第二孔中，混 匀后取出50 nL再加入第三孔中，依此类推。血清稀释度即为1: 2、1: 4、1: 8,每份待检血清稀释度作24个重复。将50L含200个TCID50的病毒液 加入到不同稀释度血清孔中，37 c作用1小时，每孔中再加入100 nL经胰酶消 化分散的BHK-21细胞，同时设病毒对照、阳性血

11、清、阴性血清，待检血清、正 常细胞对照。2.3 计算抗体中和效价逐日观察，直至细胞对照出现老化脱落为止，按Reed-Muench两氏法，计算抗体中和效价。如抗体效价为1: 2及1: 2以上，则判为伪狂犬病抗体阳性。伪狂犬病酶联免疫吸附试验（间接法）1材料准备：抗原、 酶标抗体，底物（OPA H2O）,酶联免疫检测仪；溶液配 制见附录F（标准的附录）2操作步骤：2.1 包被 将PRWC原加入酶标板孔内,每孔100uL, 37c作用1h后置4c冰箱 过夜。2.2 洗涤弃去孔内液体，用洗涤液洗3次，每次3min,用吸水纸拍干2.3 封闭 各孔加入封闭液100uL 37 c作用1h。按2.2步骤洗涤2.4 4加入待检血清待检血清经56oC30分钟灭活将待检血清用洗涤液稀释，每 孔100uL, 37 C作用1h。重复2.2步骤。2.5 5加入酶标抗体 用洗涤液将酶标抗体按工作浓度稀释，每孔100uL, 37C 作用1h。重复2.2步骤。2. 6 加入底物（OPD-H22）:每孔100uL,室温避光显色25分钟。2. 7终止反应 每孔加入50uL终止液终止反应。2. 8测定ODfi在酶联免疫检测仪上490nm®长处读数。2. 9血清阴阳性判定标准的确定 取60份经中和试验检测为PRV抗体阴性的猪 血清，按1:20稀释后进行间接EL