-第章分子发光分析法

1、第第4章（课本第章（课本第8章）章）分子发光分析法分子发光分析法主要内容主要内容 4.1 4.1 概述概述4.2 4.2 分子荧光分子荧光（* *与磷光与磷光）分析法）分析法* *4.3 4.3 化学发光分析法化学发光分析法一、分子发光分析法类型一、分子发光分析法类型分子发光分析法以分子发光作为检测手段的分析方分子发光分析法以分子发光作为检测手段的分析方法，包括法，包括荧光分析法、磷光分析法和化学发光分析荧光分析法、磷光分析法和化学发光分析法法。光致发光光致发光( (分子荧光和磷光分子荧光和磷光): ):分子吸收光能被激发所分子吸收光能被激发所产生的光。产生的光。化学发光化学发光: :由化学反

2、应的化学能所激发产生的光。由化学反应的化学能所激发产生的光。生物发光生物发光: :由生物体体内化学反应释放出来的能量所由生物体体内化学反应释放出来的能量所激发产生的光。激发产生的光。4.1 4.1 概述概述灵敏度高灵敏度高。比吸收光度法一般要高。比吸收光度法一般要高2 3个数量级。个数量级。选择性比较高选择性比较高。物质对光的吸收具有普遍性，但吸光。物质对光的吸收具有普遍性，但吸光后并非都有发光现象。即便都有发光现象，但在吸收后并非都有发光现象。即便都有发光现象，但在吸收波长和发射波长方面不尽相同，这样就有可能通过调波长和发射波长方面不尽相同，这样就有可能通过调节激发波长和发射波长来达到选择性

3、测定的目的。节激发波长和发射波长来达到选择性测定的目的。样品量小，操作简便，工作曲线的动态线性范围宽。样品量小，操作简便，工作曲线的动态线性范围宽。发光分析法在光学传感器以及在生物医学、药学和环发光分析法在光学传感器以及在生物医学、药学和环境科学等方面的应用显示了它的优越性。境科学等方面的应用显示了它的优越性。 二、分子发光分析法特点二、分子发光分析法特点4.1 概述概述一、基本原理一、基本原理1. 单重态单重态(S)与三重态与三重态(T) 单重激发态中电子的自旋方向仍然和处于基态轨道的电子配对，而三重激发态中的两个电子平行自旋.单重态分子具有抗磁性单重态分子具有抗磁性,三重态具有顺磁性；三重

4、态具有顺磁性；能量能量:单重态较高，激发三重态稍低；寿命寿命:单重态较短( 10-8 s )，三重态激发态较长( 10-4-1s )。基态单重态基态单重态激发单重态激发单重态激发三重态激发三重态4.2 分子荧光与磷光光谱分析法分子荧光与磷光光谱分析法2. 2. 激发态激发态基态的能量传递途径基态的能量传递途径 电子处于激发态是不稳定状态，返回基态时，通过辐射跃迁(发光)和无辐射跃迁等方式失去能量.传递途径传递途径辐射跃迁荧光延迟荧光磷光内转移外转移系间跨越振动 无辐射跃迁4.2 分子荧光与磷光光谱分析法分子荧光与磷光光谱分析法S2S1S0T1吸吸收收发发射射荧荧光光发发射射磷磷光光系间跨越内转

5、换振动弛豫能量l l 2l l 1l l 3 外转换l l 2T2内转换振动弛豫4.2 分子荧光与磷光光谱分析法分子荧光与磷光光谱分析法非辐射能量传递过程非辐射能量传递过程 -在同一电子能级同一电子能级中，电子由高振动高振动能级转至低振动低振动能级，将多余的能量以热热的形式发出，时间约为10-5s。-当两个电子能级两个电子能级有重叠时，电子由高能级以无辐射跃迁无辐射跃迁方式转移至低能级 -多重态间的无辐射跃迁 外转换外转换：激发分子与溶剂或其他分子之间相互作用而转移能量的非辐射跃迁。4.2 分子荧光与磷光光谱分析法分子荧光与磷光光谱分析法 处于第一激发单重态第一激发单重态中的电子跃回至基态各振

6、动能级时，得到最大波长与吸收的光辐射不同的荧光 10-710 -9 s.处于第一激发三重态最低振动能级第一激发三重态最低振动能级的电子跃回至基态时，发射磷光。 10-410s 电子由基态单重态激发至第一激发三重态的几率很小-禁阻跃迁由第一激发单重态的最低振动能级，以系间窜跃系间窜跃方式转至第一激发三重态，经过振动弛豫转至其最低振动能级，跃回至基态时便发射磷光。4.2 分子荧光与磷光光谱分析法分子荧光与磷光光谱分析法3 3、荧光、荧光/ /磷光光谱曲线磷光光谱曲线荧光或磷荧光或磷光强度光强度与与发射光波长发射光波长的关系的关系 固定激发光波长为其最大激发波长，测量发射不同波长的荧光或磷光强度。荧

7、光强度荧光强度与与激发激发光波长光波长的关系的关系 固定测量波长为荧光/磷光的最大发射波长，改变激发波长，测量荧光或磷光强度。200260320380440500560620荧荧 光光 激激 发发 光光 谱谱荧荧 光光 发发 射射 光光 谱谱磷磷 光光 光光 谱谱室室 温温 下下 菲菲 的的 乙乙 醇醇 溶溶 液液 荧荧 （ 磷磷 ） 光光 光光 谱谱4.2 分子荧光与磷光光谱分析法分子荧光与磷光光谱分析法4. 4. 荧光、磷光与分子结构的关系荧光、磷光与分子结构的关系A. A. 产生荧光的必备条件产生荧光的必备条件（1）具有合适的结构；（2）具有一定的荧光量子产率。 kf为荧光发射过程的速率

8、常数，为荧光发射过程的速率常数，主要取决于化学结构主要取决于化学结构;ki为其它有关过程的速率常数的总和为其它有关过程的速率常数的总和, 主要取决于化学主要取决于化学环境，也与化学结构有关环境，也与化学结构有关.4.2 分子荧光与磷光光谱分析法分子荧光与磷光光谱分析法B.化合物的结构与荧光（1）跃迁类型跃迁类型: *的荧光效率高，有利于荧光的产生；（2）共轭效应共轭效应: 提高共轭度有利于增加荧光效率并产生红移（3）刚性平面结构刚性平面结构：降低分子振动，减少与溶剂的相互作用，故具有很强的荧光。4.2 分子荧光与磷光光谱分析法分子荧光与磷光光谱分析法l大的共轭大的共轭 键结构键结构l形成刚性平

9、面结构形成刚性平面结构l取代基团为给电子取代基取代基团为给电子取代基强荧光物质所具有的结构特征强荧光物质所具有的结构特征 4.2 分子荧光与磷光光谱分析法分子荧光与磷光光谱分析法（1 1）大的共轭）大的共轭 键结构键结构化合物名化合物名化合物结构化合物结构 Fl lEXnml lEM nm苯苯 0.11205278萘萘 0.29286321蒽蒽0.46365400丁省丁省0.60390480戊省戊省 0.52580640稠环芳烃稠环芳烃4.2 分子荧光与磷光光谱分析法分子荧光与磷光光谱分析法（2）刚性平面结构）刚性平面结构例例1 1 荧光素与酚酞荧光素与酚酞 F 0.924.2 分子荧光与磷光

10、光谱分析法分子荧光与磷光光谱分析法CH2 F 1 F 0.2例例2 2 芴与联苯芴与联苯4.2 分子荧光与磷光光谱分析法分子荧光与磷光光谱分析法例例 3 3 偶氮苯与杂氮菲偶氮苯与杂氮菲 4.2 分子荧光与磷光光谱分析法分子荧光与磷光光谱分析法例例4 4 荧光衍生物荧光衍生物硫胺荧O1BVNNNSCH3C2H5OHNH2HClH3C(Z)NNNSCH3C2H5OHH3C(Z)N(E)硫胺素，硫胺素，VB1， 非荧光非荧光硫胺荧，强荧光硫胺荧，强荧光4.2 分子荧光与磷光光谱分析法分子荧光与磷光光谱分析法 给电子基团-增强荧光； 吸电子基团-减弱荧光； 卤素原子因重原子效应而减弱荧光. 空间结构

11、及存在环境对荧光也有不同影响.（3 3）取代基效应）取代基效应: :不同的取代基对荧光光谱及其强度有很大的不同。4.2 分子荧光与磷光光谱分析法分子荧光与磷光光谱分析法给电子取代基给电子取代基 增强荧光增强荧光NH2, NHR, NR2, OH, OR, 等等OHNHHl lEM285-365 nm270-310 nm310-405 nm相对荧光强度相对荧光强度 1.8 1.0 2.04.2 分子荧光与磷光光谱分析法分子荧光与磷光光谱分析法芳环上有芳环上有 给电子基，使荧光增强。给电子基，使荧光增强。4.2 分子荧光与磷光光谱分析法分子荧光与磷光光谱分析法吸电子取代基，吸电子取代基，减弱荧光C

12、OCOON+OOn 电子不与电子不与 电子共轭电子共轭OOOHOH非荧光非荧光强荧光强荧光4.2 分子荧光与磷光光谱分析法分子荧光与磷光光谱分析法 配体：具有配体：具有共轭双键共轭双键的配体与金属离子形成具的配体与金属离子形成具有有刚性结构刚性结构的螯合物，则可以的螯合物，则可以产生产生/ /增强荧光增强荧光. .4.2 分子荧光与磷光光谱分析法分子荧光与磷光光谱分析法特征荧光特征荧光：*配体*ffdd金属离子+Mn+4.2 分子荧光与磷光光谱分析法分子荧光与磷光光谱分析法例例 ：金属配合物：金属配合物4.2 分子荧光与磷光光谱分析法分子荧光与磷光光谱分析法5. 激发光谱与发射光谱的关系 a.

13、 Stokes位移位移(激发光谱与发射光谱之间的波长差值)：发射光谱的波长比激发光谱的长，振动弛豫消耗了能量。b. 镜像规则镜像规则: 通常荧光发射光谱与它的吸收光谱通常荧光发射光谱与它的吸收光谱成镜像对称关系。成镜像对称关系。c. 发射光谱的形状与激发波长无关；发射光谱的形状与激发波长无关；4.2 分子荧光与磷光光谱分析法分子荧光与磷光光谱分析法200250300350400450500荧光激发光谱荧光激发光谱荧光发射光谱荧光发射光谱nm蒽的激发光谱和荧光光谱蒽的激发光谱和荧光光谱4.2 分子荧光与磷光光谱分析法分子荧光与磷光光谱分析法荧光三维谱图荧光三维谱图4.2 分子荧光与磷光光谱分析法

14、分子荧光与磷光光谱分析法6 6、荧光强度与溶液浓度的关系（定量分析）、荧光强度与溶液浓度的关系（定量分析）溶液的荧光强度(If )与溶液吸收的光强度(Ia)及荧光量子产率( f）的关系 ： If = f Ia 由朗伯由朗伯-比耳定律：比耳定律： A=lg（I0/ It），）， Ia= I0- It Ia = I0(1-10-A ) If = f I0(1-10-A )浓度很低时浓度很低时(吸光度吸光度A0.05),将括号项近似处理得：将括号项近似处理得： If = 2.3 f I0 A= 2.3 f I0 b c = Kc （定量分析依据）（定量分析依据）4.2 分子荧光与磷光光谱分析法分子荧

15、光与磷光光谱分析法。荧光分子与溶剂或其他溶质分子的相互作用引起荧光强度降低的现象 猝灭剂：与发光分子相互作用而引起发光强度下降的物质。 动态猝灭：动态猝灭：猝灭剂与发光物质的激发态分子之间的相互作用。 静态猝灭静态猝灭：猝灭剂与发光物质的基态分子之间的相互作用。4.2 分子荧光与磷光光谱分析法分子荧光与磷光光谱分析法8.影响荧光强度的环境因素（1 1）溶剂的影响）溶剂的影响 溶剂的溶剂的极性增加极性增加，荧光物质的激发态更稳定，荧光物质的激发态更稳定，荧光强度荧光强度增大，波长红移增大，波长红移。（2 2）温度的影响温度的影响 荧光强度对温度变化敏感，荧光强度对温度变化敏感，温度增加温度增加，

16、非辐射跃迁的概，非辐射跃迁的概率显著增加，率显著增加，荧光强度减弱荧光强度减弱。（3 3）溶液溶液pHpH 对对酸碱化合物酸碱化合物，溶液，溶液pHpH的影响较大的影响较大（见下例）。（见下例）。（4 4）表面活性剂）表面活性剂 表面活性剂表面活性剂的存在，可以保护激发单重态的荧光物质分的存在，可以保护激发单重态的荧光物质分子，减小非辐射跃迁的概率，子，减小非辐射跃迁的概率，提高荧光效率提高荧光效率。（5 5）顺磁性物质）顺磁性物质 顺磁性物质顺磁性物质（如（如OO2 2）会使激发单重态的荧光物质分子向）会使激发单重态的荧光物质分子向三重态的体系间窜跃速率加大，三重态的体系间窜跃速率加大，降低

17、荧光效率降低荧光效率。（6 6）溶液荧光的猝灭）溶液荧光的猝灭 激发分子与溶剂分子或其它溶质分子的相互作用激发分子与溶剂分子或其它溶质分子的相互作用，使能，使能量转移，量转移，荧光强度减弱甚至消失荧光强度减弱甚至消失。 主要组成部件主要组成部件：高压汞灯/氙弧灯/连续可调染料激光光源 ：石英光电倍增管II0F1 .1 .荧光分析仪器荧光分析仪器特殊点：特殊点：有两个单色器，光源与检测器通常成直角。二、荧光分析仪器二、荧光分析仪器4.2 分子荧光与磷光光谱分析法分子荧光与磷光光谱分析法LS -55荧光/磷光/发光分光光度计4.2 分子荧光与磷光光谱分析法分子荧光与磷光光谱分析法LS -55荧光/

18、磷光/发光分光光度计F-2500型荧光型荧光光谱仪光谱仪F-4500型型荧光光谱荧光光谱仪仪1.直接定量法直接定量法KCIF02468100.00.20.40.60.81.0IFConc. / g/ml三、荧光的常规测定方法4.2 分子荧光与磷光光谱分析法分子荧光与磷光光谱分析法MFKCIAMAMFFFAIMC2. 2. 间接测定法间接测定法猝灭荧光法猝灭荧光法 被分析物本身不发荧光，或者因荧光量子产率太低而无法进行直接测定，便只能采用间接测定的办法。如：光衍生法、荧光猝灭法、敏化荧光法等4.2 分子荧光与磷光光谱分析法分子荧光与磷光光谱分析法四、荧光分析法的应用 基于荧光对于微环境的敏感性，

19、荧光分析已广泛用于研究化学/生物体系的物理、化学性质及其变化情况。可以采用有机试剂以进行荧光分析的元素已近70种。 4.2 分子荧光与磷光光谱分析法分子荧光与磷光光谱分析法4.2 分子荧光与磷光光谱分析法分子荧光与磷光光谱分析法4.2 分子荧光与磷光光谱分析法分子荧光与磷光光谱分析法*五、磷光的测定方法* *1. 1. 低温磷光分析低温磷光分析 由于三重态寿命较长，为减小非辐射失活过程的影响，通常应在低温条件下测量磷光。 液氮是最常用的冷却剂，因而要求所使用的溶剂在液氮温度下应具有足够的黏度并能形成明净的刚性玻璃体，且对分析物具有良好的溶解特性，在所研究的光谱区内没有很强的吸收和发射，并容易制

20、备和提纯。 4.2 分子荧光与磷光光谱分析法分子荧光与磷光光谱分析法* *2. 2. 室温磷光分析室温磷光分析 固态基质表面室温磷光分析：固态基质表面室温磷光分析：分析物通过物理吸附或某种化学作用力被束缚在固体基质表面，增大了刚性，减小了碰撞失活的概率，在严格干燥试样的情况下限制了氧的猝灭作用，显示室温磷光。 胶束稳定的室温磷光分析：胶束稳定的室温磷光分析：磷光体进入表面活性剂的胶束溶液中，微环境和定向约束力发生变化，减小内转化和碰撞能量损失等非辐射失活过程概率，明显增大三重态的稳定性，使磷光强度显著增大。 敏化室温磷光分析敏化室温磷光分析4.2 分子荧光与磷光光谱分析法分子荧光与磷光光谱分析

21、法*六、磷光分析法的应用 基于磷光具有Stokes位移大的优点，室温磷光分析法已成为一种与荧光分析法相互补充的重要分析技术，在生物医学、药物分析、临床检验、农药和植物生长激素的分析以及环境中多环芳烃的检测等方面得到了日益广泛的应用。 4.2 分子荧光与磷光光谱分析法分子荧光与磷光光谱分析法4.2 分子荧光与磷光光谱分析法分子荧光与磷光光谱分析法4.2 分子荧光与磷光光谱分析法分子荧光与磷光光谱分析法*七、磷光分析仪器 荧光计上配上磷光测量附件即可对磷光进行测量。在有荧光发射的同时测量磷光。 测量方法：（1）通常借助于荧光和磷光寿命的差别，采用磷光镜的装置将荧光隔开。（2）采用脉冲光源和可控检测

22、及时间分辨技术。 室温测量时，不需要杜瓦瓶。4.2 分子荧光与磷光光谱分析法分子荧光与磷光光谱分析法化学发光是由化学反应提供的能量激发物质所产生的光辐射。化学发光分析法基于化学发光现象的分析方法。化学发光反应存在于生物体(萤火虫、海洋发光生物)中，称生物发光(bioluminescence)。 优点：优点：(1). 灵敏度很高。(2). 仪器设备简单，无须光源和单色器，因而也消除了散射光和杂散光的干扰；(3). 线性范围宽；(4). 分析速度快。 局限：局限：目前可供的发光体系尚有限，发光机理有待进一步研究，方法的选择性有待进一步提高。 * *4.3 4.3 化学发光分析法化学发光分析法1.1

23、.基本原理基本原理 化学反应过程中，某些化合物接受能量而被激发，从激发态返回基态时，发射出一定波长的光。 A +B = C + D* D* D + h （1）能够发光的化合物大多为芳香族化合物；（2）化学发光反应多为氧化还原反应，激发能与反应能相当; E=170300 kJ/mol；位于可见光区；（3）发光持续时间较长，反应持续进行.4.3 化学发光分析法化学发光分析法2. 2. 化学发光效率化学发光效率化学效率：化学效率：emcecl参加反应的分子数发射光子的分子数参加反应分子数参加反应分子数激发态分子数激发态分子数 ce 发光效率：发光效率：激发态分子数激发态分子数产生光子数产生光子数 e

24、m 时刻t 的化学发光强度(单位时间发射的光量子数)：dc/dt 分析物参加反应的速率；4.3 化学发光分析法化学发光分析法 tctIddclcl3. 3. 化学发光分析的依据化学发光分析的依据 在化学发光分析中，被分析物相对于发光试剂小得多，对于一级动力学反应： cttcttIAttcl0cl0cldddd dc/dt =Kc； K 为反应速率常数。定性依据：定性依据：（1）在一定条件下，峰值光强度与被测物浓度成线性；（2）在一定条件下，曲线下面积为发光总强度(S)，其与被测物浓度成线性：4.3 化学发光分析法化学发光分析法4. 4. 化学发光反应的类型化学发光反应的类型4.1 4.1 气相

25、化学发光反应气相化学发光反应a. 一氧化氮与一氧化氮与O3的发光反应的发光反应 NO + O3 NO2* NO2* NO2 + h 发射的光谱范围：600875nm，灵敏度1ng/cm-3.b.氧原子与氧原子与SO2、NO、CO的发光反应的发光反应 O3 O2 + O （1000 C石英管中进行） SO2 + O + O SO2* + O2 SO2 * SO2* + h 最大发射波长：200nm；灵敏度1ng/cm-3. 4.3 化学发光分析法化学发光分析法 O3 O2 + O （1000 C石英管中进行石英管中进行） NO + O NO2* NO2 * NO2 + h 发射光谱范围：发射光谱

26、范围：4001400nm；灵敏度；灵敏度1ng/cm-3.氧原子与氧原子与CO的发光反应：的发光反应： CO + O CO2* CO2 * CO2 + h 发射光谱范围：发射光谱范围：300500nm；灵敏度；灵敏度1ng/cm-3.氧原子与氧原子与NO的发光反应：的发光反应：4.3 化学发光分析法化学发光分析法c. 乙烯与乙烯与O3的发光反应的发光反应 乙烯与乙烯与O3反应，生成激发态乙醛：反应，生成激发态乙醛： CH2O* CH2O + h 最大发射波长：最大发射波长：435nm；对；对O3的特效反应；线性响应的特效反应；线性响应范围范围1 ng/cm-3 1 g/cm-3；4.3 化学发光分析法化学发光分析法d.火焰中的化学发光反应火焰中的化学发光反应 在富氢火焰