合理用药施保华

1、全国基层医疗机构抗菌药物合理应用微生物实验室标准化建设与细菌耐药性检测南阳市中心医院南阳市中心医院施保华施保华主要内容 微生物实验室的任务 微生物检验的必要性 临床细菌室的规范化 细菌耐药机制及检测 微生物实验室的任务：* 帮助临床医师寻找真正的致病菌,为临床提供致病菌感染和用药的依据.* 医院感染监测* 监测细菌耐药性变迁，进行流行病学追踪，并为临床经验用药提供依据。细菌培养的必要性：技术层面的需要政策层面的需要法律层面的需要 2006年6月1日卫生部医疗机构临床实验室管理办法正式实施。对不同等级的医院应开展的检验项目和设备作出了明确的规定。* 三级医院：* 二级医院：* 生物安全要求：目前

2、抗菌药物的应用现状： 人类用： 医院（20%） 有疑问的应用 （50%） 社区（80%） 20%-50% 农业用： 治疗性（20%） 高度怀疑 （50%） 预防促生长（80%） 40%-80% 耐药形势严峻，耐药株和多重耐药株不断产生目 的 截至2012年底，建立并全面运行覆盖全国二级以上医院的监测系统，建立覆盖全国的基层医疗机构抗菌药物临床应用抽样监测系统，完善药物合理使用和不良事件监测制度，增强对药物不良事件的敏感性并有效应对，实现安全、有效、经济的临床合理用药目标。 计划2012年1月2012年12月。国家级监测系统全面覆盖900家三级医院，各省级监测系统覆盖本辖区二级医院。 南阳市中心

3、医院，首批加入全省细菌耐药监测网细菌室的标准化微生物实验室检测系统的建立：检测系统：（包括仪器试剂方法质控物SOP）* 手工鉴定系统：生物学性状、双歧索引、KB法药敏* 手工编码鉴定系统：如API staph鉴定系统-* 半自动细菌鉴定系统：crystal 、 Microscan, ATB* 全自动细菌鉴定及药敏系统：VITEK，BD等。可提供MIC及专家分析结论提示耐药等* 质控菌株：ATCC25922、25923、27853微生物实验室检测系统的建立： 房间布局流程分区合理，防鼠虫等符合生物安全要求 设备：基础设备 自动化设备 SOP文件规范化操作标本采集和运送的规范条例培养前标本质量检测

4、规范标本接种规范细菌鉴定流程规范细菌药物敏感试验规范基本实验室质量控制无菌体液细菌报告规范日常工作中存在的问题* 阳性率低* 标本污染* 结果不准* 出报告时间过长调查一日常工作中什么标本最多？标本采集运送由谁完成？是否合格接种间隔时间如何？调查二痰培养标本做常规涂片吗？调查三日常工作做室内质控吗？调查四 是否做到了三级报告制生化项目实验室检验错误 检验前-61.9% 检验中-15.0% 检验后-23.1% Clin Chem. 2007 Jul;53(7):1338-42. Epub 2007 May 24. 影响细菌室检验结果最重要的因素为标本的质量garbage in ，garbage

5、out检验前应对策略严格执行标本采集运送的规范和培养前标本质量检测规范；检验前泌尿标本采集的规范 采集后的标本应立即送检(*30分) 采集时间:多数药物从尿道排泄,所以不管用哪种方法都应在用药前采集,应采集早晨第一次的尿. 标本管不应含防腐剂和消毒剂 采集中段尿时要先用肥皂清洗女性的外阴和男性的外生殖器包括皮内,然后用清水冲洗 长期留置尿导管的患者应在更换新管时留取尿标本. 做厌氧培养时应膀胱穿刺采集尿.分泌物采集规范 对开放性病灶的采集:如眼结膜脓性分泌物,扁桃体,外耳道,手术后切口,导管治疗感染,痔管内脓液,生殖道分泌物等均属于开放性病灶,应先用灭菌生理盐水冲洗表面污染物,也可取感染部位下

6、的组织送检# 闭锁性脓肿:如淋巴脓肿,肺脓肿,肝脓肿,腹腔脓肿,盆腔脓肿等,对封闭的脓肿采用穿刺或引流的方法采样,应在用药前采集,应注意脓液的气味,性状,颜色注意厌氧菌存在的可能.不能及时送检应用输送培养基.便标本采集规范 1.采集时间:腹泻患者应在用药前急性期采集;沙门菌感染,肠热症应在2周内采;厌氧菌出现症状即采集. 2.采集方法:自然排便者可用小木棒挑取有脓血和黏液的部位的粪便23克,如液状粪便取絮状物盛于无菌的,密封的,不吸水的,容器内或直接盛于保存液中;对不易获得粪便患者及幼儿,可用直肠拭子采集后置保存液或输送培养基中送检.痰标本的采集和运送条例 标本采集时间：用抗生素前 采集方法：

7、自然咳痰：必须用清水漱口3次，应包括咽喉部，立即用力咳出痰，于灭菌容器中或输送培养基中。 支气管镜或支气管毛刷：由医生采集，建议直接种入培养基。厌培养标本采集规范条例 痰标本的厌氧培养标本采集：必须用气管穿刺法获得痰液，从口腔吐出的痰标本不能用于厌氧培养 尿标本的厌氧培养标本采集：耻骨上膀胱穿刺获得尿标本可用于厌氧菌培养 便标本厌氧培养标本采集：可用排出的便做厌氧培养但应少与空气接触。血液及骨髓标本采集运送规范采血时间：尽可能在用抗生素前，心内膜炎例外采血量：至少应采一套2瓶，分需氧和厌氧。两瓶血量不少于16-20毫升，先将10毫升注入需氧瓶，再将剩余血采血注入厌氧瓶采血方法：不要与血气和血沉

8、标本一起采血；不应在血注入培养瓶前换针头；不应在静脉导管或静脉留置口采血。血液及骨髓标本采集运送规范采血间隔:如果第一次采集2套(4瓶)血培养标本,在以后的2-5天内不必再采血,但心内膜炎和导管相关性败血症除外.必要时行多部位静脉采血儿童:采血量应是总血量的1%.延迟培养瓶的处理:延迟培养瓶不要放冰箱,应放置常温,尽早送往临床细菌室 其他无菌体液的采集运送规范 无菌的采集是培养成功的首要因素 采集的标本应立即送至细菌室,如脑膜炎双球菌有自溶酶,离体后会迅速自溶.肺炎链球菌和流感嗜血杆菌离体后极易死亡. 延迟送检后一定不能放冰箱,如肺炎链球菌和流感嗜血杆菌等对温度敏感的细菌在冰箱会很快死亡. 痰

9、培养标本培养前的规范 * 实验室在接种前必须作痰涂片革兰染色,当在低倍镜下白细胞数小于10个每视野,上皮细胞大于25个每视野时应作为不合格的培养标本; * 当白细胞数小于10个每视野,上皮细胞小于25个每视野时，可参照油镜观察标本中细菌分布作出判断; * 当标本中细菌种类超过3种以上,未见到纤毛柱状上皮细胞,作为不合格标本,如见到数量不等的白细胞或纤毛柱状上皮细胞或两者同在,含1-2种不同细菌,可考虑继续培养.结果可根据病情再作分析;当涂片中见的到1-3种细菌,少量的扁平上皮细胞,少量或较多纤毛柱状上皮细胞均可按合格标本继续培养.培养结果结合涂片判断定植菌或致病菌 尿培养分离出3种以上的细菌,

10、或分离出凝固阴性葡萄球菌,革兰阳性棒状杆菌等非定义为致病菌的细菌,且涂片未见到,应在报告中提示可能是污染细菌，建议结合临床表现考虑结果的参考价值. 眼结膜拭子分离出凝固酶阴性葡萄球菌,涂片未见到,可能是污染的细菌,应建议重送标本. 前列腺液标本分离出凝固酶阴性葡萄球菌或革兰阳性小杆菌,且涂片未见到,可能是污染细菌,应建议重送标本.培养结果结合涂片判断定植菌或致病菌当涂片中见到的细菌,并有细胞吞噬现象存在,在培养时分离出该细菌可推测为致病菌.涂片报告的日期和培养报告日期要对应，便于医生鉴别结果的参考价值。每一个视野可见到大于20个/油镜或该菌占所见到细菌的50%，可推测是标本中的优势细菌。细菌鉴

11、定 趋向性鉴定试验 细菌鉴定 趋向性鉴定试验 革兰阳性球菌：触酶试验，葡o/F.凝固酶试验- 革兰阴性杆菌：氧化酶试验，葡o/F.-血清学试验 肠道致病菌生化特征符合的前提下必须有血清学的试验做最后确认#，基层细菌室应具备13项血清试剂。沙门志贺耶尔森药敏标准1。用CLS指南推荐的KB药敏标准进行常规药敏试验判断。2。根据CLSI的不断更新，要及时更换应用的标准。3。根据CLSI推荐的方法，开展重要的耐药菌的检测。如MRSA，VRE，HLARE，ESBL。检验中 标准化中最易控制的环节 严格执行标准操作流程 适当增加培养手段重视涂片染色 痰涂片 脓性标本涂片 血培养涂片检验中检验后沟通向临床提

12、供及时信息： 危急值报告 三级报告制度真正执行室内质控检验中室内质控内容 环境条件控制记录 设备控制记录 培养基质控记录 试剂控制记录 药敏控制记录 报告单规范 参加室间质量评价药敏选择标准CLSI规则检验中药敏实验应遵守准则 备用纸片应-20冰箱保存。工作用纸片应存放在4冰箱中不超过一个月。 M-H琼脂必须符合实验要求（厚41、35 、片间距） 培养基PH应7.2-7.4最适宜。 仔细测量抑菌环大小，每次试验质控菌种抑菌环应在规定范围。 根据CLSI的不断更新，要及时更换应用的标准。结果报告注意内容 非苛氧菌：*.对分离于CSF中的细菌，下列药物不作为常规报告。因为这些药物，治疗某些细菌引起

13、的感染可能无效。1.仅通过口服途径给药的药物2.1和2代头孢菌素（除头孢呋新钠外）3.克林霉素、大环内酯类、四环素类、氟喹诺酮类。*.头孢噻吩可以代表头孢匹林、头孢拉定、头孢氨苄、头孢克罗、头孢羟氨苄。 不代表头孢唑啉、头孢呋辛、头孢泊肟、头孢丙烯、氯碳头孢。*青霉素敏感的葡萄球菌对其他青霉素类，头孢菌素类和碳青素类也敏感。青霉素耐药而苯唑西林敏感的菌株对青霉素酶不稳定的青霉素类耐药，但对耐青霉素酶的青霉素类，-内酰胺/-内酰胺酶抑制剂复合物，头霉素类和碳青霉烯类敏感。苯唑西林耐药的葡萄球菌对所有当前可用的-内酰胺类抗菌药物均耐药。因此，仅测试青霉素和苯唑西林就可以推知一大批-内酰胺类抗菌药物

14、的敏感性。不必常规测试其他青霉素类、-内酰胺酶抑制剂复合物、头霉素类和亚胺培南。*克雷伯菌属和大肠埃希菌中产ESBLs菌株对青霉素、头孢菌素或氨曲南临床治疗可显耐药性，尽管在体外药敏试验时，其中某些抗生素显示敏感。这些菌株中某些显示其抑菌环低于正常敏感菌群，但高于某些超广谱头孢菌素或氨曲南的标准（断点分界值）,这些菌株用ESBLs筛选试验，可能发现潜在性产ESBLs。而另外一些菌株可能对这些抗菌药物中的一些或数种实验结果出现中介或耐药。产ESBLs菌株，对所有青霉素类、头孢菌素类及氨曲南试验结果均报告耐药。* 来自粪便样本分离到的沙门菌属和志贺菌属菌株，只有氨苄西林、喹诺酮类和TMP/SMZ可

15、作于常规实验报告。除此之外，肠道外感染沙门菌属分离株，应测试并报告氯霉素和一种三代头孢菌素。 * 对四环素敏感的菌株也被认为对多西环素和米诺环素敏感。然而，四环素中介和耐药的某些菌株，可以对多西环素、米诺环素或两者皆敏感。* 除铜绿假单胞菌、不动杆菌属、洋葱伯克霍尔德菌和嗜麦芽寡养单胞菌外，非肠杆菌科菌株应用稀释法进行试验。* 对于肠球菌属菌种，头孢菌素类、氨基糖苷类（除了筛选高水平耐药性）、克林霉素和甲氧苄啶/磺胺甲恶唑（TMP/SMZ）在体外可能有活性，但临床上无效，因此不能报告这些药物为敏感。* 青霉素敏感性可以预测不产-内酰胺酶的肠球菌对氨苄西林、阿莫西林、酰基氨苄西林、氨苄西林/舒巴

16、坦、阿莫西林/克拉维酸、哌拉西林/他唑巴坦的敏感性。对于血液和脑脊液的肠球菌分离株，推荐检测-内酰胺酶。 CLSI提示注意。 1-严重的肠球菌感染，如心内膜炎，需要青霉素或氨苄西林加一种氨基糖苷类抗生素进行联合治疗。 2-用万古霉素治疗严重的肠球菌感染，如心内膜炎，常需要与一种氨基糖苷类抗菌药物联用。 3-利福平不能单独用于化疗 苛氧菌：肺炎链球菌及其他链球菌测试红霉素可以预告阿齐霉素、可拉霉素和地红霉素的敏感性。对于脑脊液的流感嗜血杆菌分离菌株，常规只报告氨苄西林、一种三代头孢菌素、氯霉素和美洛培南的测试结果。由嗜血杆菌属细菌引起的呼吸道感染，可用阿莫西林/克拉维酸、阿奇霉素、克拉霉素、头孢

17、可罗、头孢丙烯、氯碳头孢、头孢地尼、头孢克肟 建立规范的临床微生物室检测体系，严格执行标准化操作，进行细菌检验前、中、后的质量控制，是检验结果准确的重要保证常见细菌耐药机制及检测细菌耐药的主要机制水解酶外膜通透性泵出机制适者生存靶位改变细菌对-内酰胺类的主要耐药机制 -内酰胺酶的分类根据结构金属-内酰胺酶丝氨酸-内酰胺酶A类-内酰胺酶 ESBLsESBLs KPCKPCB类-内酰胺酶 IMP VIMIMP VIMD类-内酰胺酶OXAOXAC类-内酰胺酶 AmpCAmpC（金属酶）ESBLs的特点 多由普通-内酰胺酶TEM-1/2、SHV-1点突变而来 常由含多种耐药基因的可结合性大质粒携带 易

18、传递给其他种、株，引起医院内感染的爆发流行 主要产生该酶的细菌为： 大肠杆菌、克雷伯菌属、肠杆菌属、伤寒沙门菌属、铜绿假单胞菌 ESBLs的药敏特点理论敏感药物：碳青霉烯类、头霉素类、 -内酰胺酶抑制剂复合物耐药药物：青霉素、头孢菌素、单环-内酰胺类药物 CLSICLSI提示及规定：提示及规定： 对于大肠埃希氏菌、克雷伯菌属，如确认为产ESBLs菌株，不管体外药敏试验的结果如何，对所有的青霉素类、头孢菌素类和单环-内酰胺类药物都应报告耐药。因为其在体内表现为临床耐药。ESBLsAmpCAmpC酶 AmpC酶是最重要的-内酰胺酶之一，属C类酶，耐酶抑制剂克拉维酸，但可被邻氯西林抑制，对头孢菌素的

19、水解率大于青霉素。 AmpC酶有染色体介导和质粒介导两种。 染色体AmpC酶主要存在于阴沟肠杆菌、铜绿假单胞菌、枸橼酸杆菌、鲍曼不动杆菌、粘质沙雷菌等细菌中 染色体AmpC酶的表达模式： 诱导型 结构型: ampD突变 启动子突变 质粒AmpC酶主要存在于 天然缺乏AmpC结构基因的细菌，如：克雷伯菌属、奇异变形杆菌和沙门菌属 缺乏AmpR、由弱启动子和衰减机制调控而低水平表达的大肠埃希菌。 质粒AmpC酶的表达模式：持续高产指所有能明显水解亚胺培南或美罗培南等碳青指所有能明显水解亚胺培南或美罗培南等碳青霉烯类抗生素的一类霉烯类抗生素的一类内酰胺酶内酰胺酶分别属于分别属于Ambler分子分类中

20、的分子分类中的A类、类、B类、类、D类类酶酶 。 碳青霉烯酶 外膜通透性下降 先天不足：内在性耐药先天不足：内在性耐药或或固有性耐药；固有性耐药；细菌本身存在的膜孔蛋白较少或蛋白通道细菌本身存在的膜孔蛋白较少或蛋白通道较小，使一些抗菌药物不能进入菌体内部较小，使一些抗菌药物不能进入菌体内部 后天培养：原有的孔蛋白通道由于细菌后天培养：原有的孔蛋白通道由于细菌发生突变而使该孔蛋白通道关闭或消失发生突变而使该孔蛋白通道关闭或消失靶位改变MRSA Methicillin-resistant staphylococcus aureus 甲氧西林耐药的金黄色葡萄球菌MRSCN / MRCoNS Meth

21、icillin-resistant coagulase-negative staphylococcus 甲氧西林耐药的凝固酶阴性葡萄球菌mecA基因编码的PBP2a发生结构变异，对所有的-内酰胺类药物耐药常同时表现对红霉素、克林霉素、四环素等多重耐药性，万古霉素、利奈唑胺常是MRS的最后选择MRS是医院获得性感染的重要来源，易引起爆发流行主动外排系统铜绿假单胞菌的主动外排系统 主要由3部分组成：外膜蛋白，内膜蛋白，膜融合蛋白 3种蛋白连接在一起可形成连续的通道，开口于外膜，直接将药物排到菌体外常见细菌的耐药机制 1. ESBL（主要） 2. 质粒AmpC酶 3. 碳青霉烯酶 4. 外膜蛋白丢失

22、大肠埃希菌、克雷伯菌产AmpC酶的肠杆菌（阴沟肠杆菌、枸橼酸杆菌、粘质沙雷菌等） 1. 染色体AmpC酶 2. ESBL 3. 外膜通透性下降 4. 碳青霉烯酶铜绿假单胞菌 1. ESBL、AmpC、碳青霉烯酶等 2. 外膜通透性下降 3. 主动外排机制 4. 生物被膜鲍曼不动杆菌 1. OXA等D类碳青霉烯酶及金属酶 2. 染色体AmpC酶及ESBLs 3. 外膜蛋白低表达 4. 主动外排系统：adeABC基因簇编码的泵出系统 5. 核蛋白体靶位的改变金黄色葡萄球菌1.-内酰胺酶2.MRSA3.VRSA常见耐药机制的表型检测常见耐药机制的表型检测 甲氧西林耐药的葡萄球菌（甲氧西林耐药的葡萄球

23、菌（MRS） 超广谱超广谱-内酰胺酶（内酰胺酶（ESBLs） 万古霉素耐药肠球菌（VRE） 高水平氨基糖苷类药物耐药的肠球菌（HLARE） 青霉素耐药肺炎链球菌（PRSP） 肠杆菌科细菌中碳青霉烯酶的检测 甲氧西林耐药的葡萄球菌（甲氧西林耐药的葡萄球菌（MRS） 超广谱超广谱-内酰胺酶（内酰胺酶（ESBLs） 纸片法（筛选阳性）： 出现以下一种情况即可怀疑该菌株产生ESBL 头孢泊肟17mm 头孢他啶22mm 头孢噻肟27mm 头孢曲松25mm 氨曲南 27mm超广谱超广谱-内酰胺酶（内酰胺酶（ESBLs） 纸片法（表型确认试验） 头孢他啶和头孢他啶/克拉维酸、头孢噻肟和头孢噻肟/克拉维酸 任一复方制剂的抑菌圈直径与相应单药抑菌圈直径相差5mm时，即可判断该菌产ESBL。 肠杆菌科细菌肠杆菌科细菌-碳青霉烯酶的检测碳青霉烯酶的检测1、当实验室检测到菌株对碳青霉、当实验室检测到菌株对碳青霉烯类药物中介或者耐药时，只需要烯类药物中介或者耐药时，只需要按照实际检测结果报告临床，没必按照实际检测结果报告临床，没必要进行改良要进行改良Hodge试验。试验。 （因为（因为医生通常