第九章蛋白质及氨基酸的测定 ppt课件

1、第九章 蛋白质及氨基酸的测定9.1 概述概述 蛋白质是一类存在于一切细胞中含量丰富的成分，除了贮藏蛋白质外，几乎一切的蛋白质对生物功能和细胞构造都非常重要。 食品中的蛋白质种类非常复杂，其中很多曾经被纯化和定性。蛋白质分子质量的变化范围通常为50001000000u，它们包括氢、碳、氮、氧和硫等元素，20种常见-氨基酸是蛋白质的主要构成。 蛋白质可以按照它的成分、构造、生物功能或者溶解特性来分类。如水解简单蛋白质只得到氨基酸，但结合类蛋白质还含有非氨基酸成分。 蛋白质有非常独特的构型，它可被各种变性要素，如热、酸、碱、8molL尿素、6mol/L盐酸胍、有机溶剂和去垢剂所改动，其溶解性及功能性

2、也可被变性剂所改动。蛋白质分析的重要性 (1)生物活性测定 一些蛋白质包括酶或酶抑制因子和食品科学与营养有关，例如肉类嫩化中的蛋白酶、水果成熟中的果胶酶以及豆类中的胰蛋白酶抑制因子都是蛋白质。 (2)功能性质调查 不同种类食品中的蛋白质都有其独特的食品功能性质，例如小麦面粉中的麦醇溶蛋白和麦谷蛋白具有成面团性，牛乳中的酪蛋白在干酪制造中具有凝结作用，而鸡蛋卵清蛋白具有起泡才干。(3)营养标签 总蛋白质含量； 氨基酸组成； 混合物中的特定蛋白质的含量； 蛋白质分别纯化过程中的蛋白质含量； 非蛋白氮； 蛋白质的营养价值(消化率、蛋白质效果比或氮平衡)。食品中蛋白质的含量 食品种类食品种类 蛋白质的

3、蛋白质的百分含量百分含量食品种类食品种类 蛋白质的蛋白质的百分含量百分含量大米大米(糙米糙米)大米大米(白米白米)小麦粉小麦粉(整粒整粒)玉米粉玉米粉(整粒整粒) 意大利面条意大利面条玉米淀粉玉米淀粉 7.97.113.76.912.80.3大豆大豆(成熟、生）成熟、生）豆豆(腰子状、生腰子状、生) 豆腐豆腐(生、坚硬生、坚硬) 豆腐豆腐(生、普通生、普通) 36.523.615.88.1乳制品乳制品 牛乳牛乳(全脂，液全脂，液体体) 牛乳牛乳(脱脂、干脱脂、干) 切达干酪切达干酪 酸奶酸奶(普通的、普通的、低脂低脂)水果和蔬菜水果和蔬菜 苹果苹果(生、带皮生、带皮) 芦笋芦笋(生生) 草莓草

4、莓(生生) 莴苣莴苣(冰、生冰、生) 土豆土豆(整粒、肉整粒、肉和皮和皮)3.336.224.95.30.22.30.61.02.1肉、家禽、鱼肉、家禽、鱼牛肉牛肉(颈肉、烤前颈肉、烤前腿腿) 牛肉牛肉(腌制、干腌制、干牛肉牛肉) 鸡鸡(可供煎炸的鸡可供煎炸的鸡胸肉、生胸肉、生) 火腿火腿(切片、普切片、普通的通的) 鸡蛋鸡蛋(生、全蛋生、全蛋) 鱼鱼(太平洋鳕鱼、太平洋鳕鱼、生生) 鱼鱼(金枪鱼、白金枪鱼、白色、罐装、油浸、色、罐装、油浸、滴干的固体滴干的固体) 18.529.123.117.612.517.926.5 氮是存在于蛋白质中的特征元素，不同食品中蛋白质的含量相关很大。 由于一些

5、食品的组分具有类似的物化性质而使得对蛋白质的分析变得非常复杂。 非蛋白氮能够来自于游离氨基酸、小肽核酸、磷脂、氨基糖、嘌呤以及某些维生素、生物碱、尿酸、脲和氨基离子，因此，食品中的总有机氮主要来自于蛋白质，小部分来自于非蛋白质组分的有机氮。 食品中的脂类和碳水化合物等成分能够会干扰食品蛋白质的分析。 目前，已建立和完善了大量测定蛋白质的方法。这些方法的根本原理包括利用蛋白质的氮、肽键、芳香族氨基酸和紫外吸收性质以及游离基、光散射性质和染色结合才干。即： 一类是利用蛋白质的共性，即含氮量、肽键和折射率等测定蛋白质含量； 另一类是利用蛋白质中特定氨基酸残基、酸性和碱性基因以及芳香基团等测定蛋白质含

6、量。 常用的方法为凯氏定氮法粗蛋白质测定 此外，双缩脲法、染料结合法、酚试剂法、NIR法等也常用于蛋白质含量测定，因其方法简便快速，多用于消费单位质量控制分析。 氮基酸总量测定通常采用酸碱滴定法，目前HPLC、氮基酸分析仪也已得到广泛运用。2 蛋白质的测定一、常量凯氏定氮法1 原理 样品中的蛋白质和其他有机成分在催化剂存在下，被硫酸消化，总有机氮转化成硫酸铵，在碱性条件下转化为氨，经过水蒸汽将氨蒸馏至硼酸溶液中构成硼酸铵，用规范酸溶液滴定，测出样品转化后的氮含量。由于非蛋白组分中也含有氮，所以此方法的分析结果为样品中的粗蛋白含量。 2NH2 (CH2) 2COOH13H2SO4(NH4)2SO

7、4+6CO2 12SO216H2O 2NaOH (NH4)2SO42NH3+ Na2SO4 +2H2O2NH3+ H3BO3 (NH4)2B4O7 + 5 H2O(NH4)2B4O7 + 5 H2O + 2HCl2NH4Cl + 4H3BO32 主要仪器3 测定方法1消化2蒸馏3滴定4 结果计算 100100001.14%21FmVVC蛋白质 蛋白质含蛋白质含氮量氮量%换算系换算系数数 蛋白质含蛋白质含氮量氮量%换算系换算系数数蛋或肉蛋或肉16.06.25燕麦燕麦17.155.83牛乳牛乳15.76.38大豆大豆17.515.71小麦小麦17.545.70大米大米16.815.75玉米玉米16

8、.06.25花生花生 18.32 5.46二、微量凯氏定氮法1 测定原理同凯氏定氮法2 主要仪器蛋白质测定仪3 测定方法1样品处置 精细称样约相当氮3040mg 100ml定氮瓶 固体样品0.22.0g 半固体样品25g 液体样品汲取1020ml 参与催化剂、硫酸 0.2g硫酸铜，3g硫酸钾、20ml(普通用5ml)硫酸， 硒催化剂1g、5ml硫酸小心加热，至无泡沫产生大火消化，至液体呈蓝绿色廓清透明，再继续加热0.5h。取下放冷，小心加20ml水。转移至100ml容量瓶中，加水定容。取与处置样品一样量的硫酸铜、硫酸钾、硫酸按同一方法做试剂空白实验。2按装定氮安装水蒸气发生瓶内装水至约2/3处

9、，加甲基红指示液数滴及数毫升硫酸，参与数粒玻璃珠以防暴沸；加热煮沸水蒸气发生瓶内的水。3蒸馏吸收接纳瓶内参与10ml(普通用30ml) 2%硼酸溶液及混合指示液1滴，并使冷凝管的下端插入液面下；汲取10.0ml样品消化稀释液由小玻杯流入反响室，并以10ml水洗涤小玻杯使流入反响室内，塞紧小玻杯的棒状玻塞。将10ml 40%氢氧化钠溶液倒入小玻杯，提起玻塞使其渐渐流入反响室，立刻将玻塞盖紧，并加水于小玻杯以防漏气。夹紧螺旋夹，开场蒸馏。蒸馏5min，挪动接受瓶，使冷凝管下端分开液面，再蒸馏1min。然后用少量水冲洗冷凝管下端外部。半微量凯氏定氮蒸馏安装半微量凯氏定氮蒸馏安装4滴定 取下接纳瓶，以

10、0.05000mol/L普通用0.01000 mol/L盐酸规范溶液滴定至灰色或蓝紫色为终点。 同时汲取10.0ml试剂空白消化液作空白实验5 结果计算 X样品中蛋白质的含量，%；V1样品耗费盐酸规范液的体积，ml；V2试剂空白耗费盐酸规范液的体积，ml； N盐酸规范溶液的当量浓度；0.0141mol/L盐酸规范溶液1ml相当于氮克数；m样品的质量(体积)，g(ml)；F氮换算为蛋白质的系数。10010010014. 021FmNVVx优点 可用于一切食品的蛋白质分析中； 操作相对比较简单； 实验费用较低； 结果准确，是一种测定蛋白质的经典方法； 用改良方法(微量凯氏定氮法)可测定样品中微量的

11、蛋白质。 缺陷 最终测定的是总有机氮，而不只是蛋白质氮； 实验时间长(至少需求2h才干完成)； 精度差，精度低于双缩脲法； 所用试剂有腐蚀性。三、双缩脲法1原理 在碱性条件下，铜离子和多肽(至少有两个肽键，如双缩脲、多肽和一切的蛋白质)生成的复合物呈紫红色，吸收波长为560nm，比色所得的吸光度值和样品中蛋白质的含量成正比。 2测定方法 (1)5mL双缩脲试剂和1mL蛋白质溶液(110mg蛋白质mL)混匀。试剂包括硫酸铜、氢氧化钠和酒石酸钾钠以及稳定在碱性溶液中的铜离子； (2)混合液在室温下放置15min或30min，然后在560nm处比色，读取吸光度值，并扣去空白； (3)假设反响液不廓清

12、，在测定吸光度前可过滤或离心； (4)用牛血洁白蛋白(BSA)建立蛋白质浓度与吸光度的规范曲线。 双缩脲法优点 该方法比凯氏定氮法费用低，速度快(可在不到30min的时间内完成)，是分析蛋白质最简单的方法； 比福林酚法、紫外吸收法或比浊法更少发生颜色偏离； 几乎没有物质干扰食品中蛋白质的双缩脲反响； 不需求测定非多肽或非蛋白质来源的氮。缺陷 不如福林酚法灵敏，分析时至少需求24mg蛋白质； 假设存在胆汁素，那么吸光度会虚伪添加； 高浓度的胺盐会干扰反响； 不同蛋白质其最终反响产物的颜色不同，如明胶的双缩脲反响产生红紫色； 假设有高浓度的脂或碳水化合物存在时，最终的反响溶液中能够会呈乳白色； 此方法不是一个丈量绝对值的方法，必需用知浓度的蛋白质(如BSA)或经凯氏定氮法校正。四乙酰丙酮比色法GB/T 5009.5-2019第二法3氨基酸的测定一、茚三酮比色法1. 原理 氨基酸在碱性条件下与茚三酮作用生成蓝紫色化合物，其颜色深浅与氨基酸含量成正比，测定反响物的吸光度570nm可计算出样品中氨基酸含量。2. 试剂 2%茚三酮 pH8.04磷酸缓冲溶液氨基酸规范溶液3.仪器分光光度计4. 测定方法1样品处置 称样加水、活性炭加热提取过滤滤液定容2规范曲线制备与样品测定标准溶液(200g/mL)样液标准或样液体积,ml0.00.51.01.52.02.52.0加入25mL比色管，加水至4