毛细管电泳实验讲义-13级

1、预习要求：  1、思考题无论正确与否，需全部作答；最后一道思考题要写原因。  2、预习报告中要包含实验原理，仪器试剂，实验步骤，记录表格。  3、查阅毛细管电泳四种待分析物(苯甲醇、苯甲酸、水杨酸、对氨基苯甲酸)的pKa值，并标明所查文献或网址。4.3毛细管电泳法4.3.1原理1808年俄国物理学家Von Reuss首次发现电泳现象，即溶液中的荷电粒子在电场作用下会因为受到排斥或吸引力而发生差速迁移。1937年瑞典科学家Arene Tiselius成功地把电泳技术用于人血清中不同蛋白质的分离，因此而获得了1948年诺贝尔化学奖。在传统电泳中凝胶可以抑制因热效应而导

2、致的对流，但如果在自由溶液中施加高的电压，就会导致大的焦耳热，严重影响分离。因此，人们一直致力于减小分离介质的尺寸。1981年美国学者Jorgenson和Lukacs使用内径为75 µm的熔融石英毛细管，配合30 kV的高电压进行自由溶液电泳，获得了高于40万理论塔板数的分离柱效。这标志着毛细管电泳（capillary electrophoresis, CE）作为一种新型分离分析技术的诞生。经过近30年的发展，CE现已广泛应用于无机离子、中性分子、药物、多肽、蛋白质、DNA及糖等各类化合物的分析，并被认为是20世纪分析化学领域中最有影响的进展之一。20世纪90年代后期出现的阵列CE技

3、术作为基因测序的关键方法在人类基因组计划中发挥了极其重要的作用。CE的的分离原理如图4.6所示。在毛细管中充满缓冲液，将其两端置于缓冲溶液瓶中，当样品被引入毛细管后，在毛细管两端施加直流电压，此时，电渗流带动整个溶液在毛细管中流动，不同的带电粒子因其电泳淌度的不同而发生差速迁移，从而实现分离。与传统的电泳技术相比，CE具有应用范围广、分离效率高、分离模式多、样品用量少、分析成本低、环境友好等特点。 CE有6种分离模式，见表4.14。毛细管区带电泳（CZE）是最简单的模式，因为毛细管中的分离介质只是缓冲液。在电场的作用下，样品组分以不同的速率在分立的区带内进行迁移而被分离。由于电渗流的作用，正负

4、离子均可以实现分离。在正极进样的情况下，正离子首先流出毛细管，负离子最后流出。中性分子由于不带电荷，故随电渗流一起运动，故CZE模式不能分离不同的中性化合物。MEKC和CEC则可同时分离带电的和中性化合物。图4.6 CE仪器组成示意图表4.14 6种CE分离模式的分离依据及应用范围分离模式分离依据应用范围毛细管区带电泳（CZE）溶质在自由溶液中的淌度差异可解离的或离子化合物、手性化合物及蛋白质、多肽等毛细管胶束电动色谱（MECC）溶质在胶束与水相间分配系数的差异中性或强疏水性化合物、核酸、多环芳烃、结构相似的肽段毛细管凝胶电泳（CGE）溶质分子大小与电荷/质量比差异蛋白质和核酸等生物大分子毛细

5、管等电聚焦（CIEF）等电点差异蛋白质、多肽毛细管等速电泳（CITP）溶质在电场梯度下的分布差异(移动界面)同CZE，电泳分离的预浓缩毛细管电色谱（CEC）电渗流驱动的色谱分离机制同HPLC影响CE分离的主要因素有：缓冲液的种类、浓度和pH值，缓冲液添加剂的种类和用量，电压的方向和大小，进样方式和样品的浓度，毛细管的尺寸和温度，以及毛细管内壁的修饰等等。4.3.2仪器结构与操作1. 毛细管电泳仪的构成图4.6所示为CE仪器示意图。其组成部分主要是高压电源、缓冲液瓶（包括样品瓶）、毛细管、检测器以及控制系统。高压电源是为分离提供动力的，商品化仪器的输出直流电压一般为030 kV。大部分直流电源都

6、配有输出极性转换装置，可以根据分离需要选择正电压或负电压。缓冲液瓶多采用塑料（如聚丙烯）或玻璃等绝缘材料制成，容积为13 mL。考虑到分析过程中正负电极上发生的电解反应，体积大一些的缓冲液瓶有利于pH的稳定。进样时毛细管的一端伸入样品瓶，采用压力或电动方式将样品加载到毛细管入口，然后将样品瓶换为缓冲液瓶，接通高压电源即可开始分析。目前CE用的毛细管主要是内径为25-100 mm的熔融石英毛细管，外面涂有聚酰亚胺保护层，长度50 cm左右。CE多用UV检测器，由于光线通过毛细管进行“柱上”检测，故没有柱外效应的问题。当然，毛细管的检测窗口处要除去涂层，保证透明。此外，CE还用电化学检测器、激光诱

7、导荧光检测器和质谱检测器等。2. 毛细管电泳仪的操作（1）准备工作，包括安装毛细管、连接电源线和信号线，等等。（2）配置缓冲溶液。根据实验要求配置适当浓度和pH值的缓冲溶液，并经0.45 mm滤膜过滤，再超声波脱气10 min。然后分装到仪器的缓冲液瓶中，置于仪器样品盘上毛细管入口（Inlet）的适当位置。在毛细管出口(Outlet)相应的位置放置一个空的废液瓶。（3）配置样品溶液，并用0.45mm滤膜过滤。将样品瓶置于仪器样品盘上毛细管入口（Inlet）的适当位置。注：实际操作中，学生不需要完成（2）（3）步骤，直接使用已经配置好的缓冲溶液即可。（4）开启仪器电源，设置工作温度，编辑冲洗毛细

8、管程序：建议顺序依次是：1 mol/L NaOH溶液冲洗3 min，二次水冲洗3 min，缓冲溶液冲洗5 min。冲洗过程中毛细管出口(outlet)对准废液瓶的位置。然后运行该程序。程序编辑方法请参看仪器操作说明书。（5）开启计算机和相应的工作站软件，参照操作说明书进行程序编写，待检测器基线稳定后便可开始进样分析。（6）编辑分析方法，按照实验要求和样品瓶位置，设置毛细管温度、进样条件、分析电压以及检测波长。（7）运行分析方法，工作站软件自动记录电泳图。（8）每次进样前通常要用分析缓冲液冲洗毛细管3 min左右，以保证分析的重现性。（9）完成实验后，用纯水冲洗毛细管10 min，再用空气吹干1

9、0 min。（10）退出色谱工作站软件，关闭计算机和仪器电源。实验4.7 毛细管区带电泳法分离离子型化合物【目的】进一步理解毛细管电泳的基本原理；熟悉毛细管电泳仪器的构成和操作；了解影响毛细管电泳分离的主要操作参数。【原理】CE是以电渗流(EOF)为驱动力，以毛细管为分离通道，依据样品中组分之间淌度和分配行为上的差异而实现分离的一种液相微分离技术。离子在自由溶液中的淌度（m）可表示为：式中q为粒子的荷电量，h为介质粘度，r为带电粒子的流体力学半径。因此，离子的电泳淌度与其荷电量呈正比，与其半径及介质粘度呈反比。带相反电荷的离子其电泳淌度的方向也相反。需要指出，在物理化学手册中查到的离子淌度常数

10、是绝对淌度，即离子带最大电量时测定并外推至无限稀释条件下所得到的数值。在CE分离实验中测定的值往往与此不同，故将实验值称为有效淌度（me）。有些物质因为绝对淌度相同而难以分离，但我们可以通过改变介质的pH值，使离子的荷电量发生改变。这样就可以使不同离子具有不同的有效淌度，从而实现分离。在水溶液中多数固体表面根据材料性质的不同带有过剩的负电荷或正电荷。就石英毛细管而言，表面的硅羟基在pH大于3以后就发生明显的解离，使表面带有负电荷。为了达到电荷平衡，溶液中的正离子就会聚集在表面附近，从而形成所谓双电层。这样，双电层与管壁之间就会产生一个电位差，叫做Zeta电势。当毛细管两端施加一个电压时，组成扩

11、散层的阳离子被吸引而向负极移动。由于这些离子是溶剂化的，故将拖动毛细管中的体相溶液一起向负极运动，这便形成了EOF。EOF的大小可用速率和淌度来表示：式中nEOF为电渗流速率，E为外加电场强度，mEOF为电渗淌度，x为Zeta电势，h和e分别为溶液的粘度和介电常数。可见，影响EOF大小的因素主要有电场强度、Zeta电势和缓冲液的性质。一般来说，E越大，pH越高，表面硅羟基的解离程度越大，电荷密度越大，电渗流速率就越大。EOF还与毛细管的表面性质（硅羟基的数量、是否有涂层等）和溶液的离子强度有关，双电层理论认为，增加离子强度可以使双电层压缩，从而降低Zeta电势，减小EOF。温度升高可以降低介质

12、粘度，增大EOF。由上可知，电渗流的方向与电场方向一般是一致的，即从正极到负极。但在溶液中加入阳离子表面活性剂后，由于毛细管表面强力吸附阳离子表面活性剂的亲水端，而阳离子表面活性剂的疏水端又会紧密结合一层表面活性剂分子，结果就形成了带正电的表面，双电层Zeta电势的极性发生了反转，最后使电渗流的方向发生了变化。EOF的一个重要特性是具有平面流型，其优点是径向扩散对谱带扩展的影响非常小，这是CE具有更高分离效率的一个重要原因。EOF的另一个重要优点是可以使几乎所有被分析物向同一方向运动，而不管其电荷性质如何。这是因为电渗淌度一般比离子的电泳淌度大得多，故当离子的电泳淌度方向与电渗流方向相反时，仍

13、然可以使其沿电渗流方向迁移。这样，就可在一次进样分析中同时分离阳离子和阴离子。中性分子由于不带电荷，故随电EOF一起运动，故CZE模式不能分离不同的中性化合物。MEKC和CEC则可同时分离带电的和中性化合物。CE的分析参数可以用色谱中类似的参数来描述，比如与色谱保留时间相对应的有迁移时间，定义为一种物质从进样口迁移到检测点所用的时间，迁移速率（n）则是迁移距离（l，即被分析物质从进样口迁移到检测点所经过的距离，又称毛细管的有效长度）与迁移时间（t）之比：因为电场强度等于施加电压(V)与毛细管长度(L)之比：根据电泳的基本公式：n = mE，可得：ma被称为表观淌度，它是电泳淌度与电渗流淌度的矢

14、量和，即：本实验采用一种中性化合物测定电渗流淌度，然后就可求得被分析物的有效淌度。注意，阴离子的有效淌度为负值，因为其与电渗淌度的方向相反。【仪器与试剂】样品I：浓度为2.00 mg·mL-1的苯甲醇的标准水溶液、苯甲酸、水杨酸、对氨基苯甲酸的标准水溶液, 浓度均为1.00 mg·mL-1。样品II：未知浓度混合样品。缓冲溶液：以缓冲盐的负离子浓度计，10 mmol·L-1的pH分别为6.0，7.0，8.0的磷酸缓冲溶液。配制方法为通过10 mmol·L-1磷酸一氢钠和10 mmol·L-1磷酸二氢钠的溶液互相混合调整pH值,以保证缓冲溶液浓度

15、一致。NaOH溶液 (1.0 mol·L-1)，高纯水或超纯水。Capel-105RT电泳仪，60 cm长的熔融石英毛细管（有效长度51 cm），内径50 或75mm。5 mL移液管2支，1mL 移液管2支，分别标上四种标样的标签。10 mL容量瓶4个，滴管2支，分别标上标准、未知的标签。塑料样品管若干个，分别用于三种标准样品、未知样品、三种缓冲溶液、NaOH、水和废液，做好标号。滴瓶一共5个，分别用于加装三种缓冲液、1 mol·L-1的NaOH和乙醇。镊子、洗瓶、吸耳球、试管架、塑料样品管架、废液烧杯各一个。【实验内容】（1）仪器的预热和毛细管的冲洗打开仪器（已经安装和毛

16、细管）及计算机工作站，不加分离电压，设置毛细管温度为25。每次使用前对毛细管进行活化（先用NaOH冲洗20 min，纯水冲洗5 min，pH6.0缓冲冲洗5 min）。(2)不同缓冲溶液对分离的影响配制浓度分别为600，200，100，10.0 g·mL-1的苯甲醇、水杨酸、苯甲酸、对氨基苯甲酸的10 mL混合标样水溶液。待毛细管冲洗完毕，取1 mL（pH =6.0）混合标样，置于塑料样品管进行分析。操作参数为：进样压力30 mbar（1bar=105 Pa），进样时间5 s；分析电压25 kV。运行已经编写的程序，直到四种成分流出毛细管。测定完毕后，冲洗毛细管，顺序依次是：1 mo

17、l·L-1 NaOH溶液1 min，高纯水2 min，然后更换毛细管进出口两端的缓冲溶液(进出口的10号位置)为pH =8.0的磷酸缓冲液，并用该缓冲液冲洗毛细管5 min；然后按照相同的方法测试混合标样。按照前面的顺序再次冲洗毛细管，再次更换进出口两端的缓冲溶液为pH=7.0的磷酸缓冲液，并冲洗毛细管5 min；然后按照相同的方法测试混合标样。（3）出峰顺序的确认按照下表所示分别配制含不同浓度的苯甲醇、水杨酸、苯甲酸、对氨基苯甲酸的的混标水溶液。用pH=7.0的磷酸缓冲液冲洗毛细管3 min，然后分别测试混标水溶液，注意每一次进样前，须用pH=7.0的磷酸缓冲液冲洗毛细管3 min

18、。苯甲醇水杨酸苯甲酸氨基苯甲酸定容总量标样一4 mL2 mL1 mL0.1 mL10 mL标样二3 mL3 mL1 mL0.1 mL10 mL标样三3 mL2 mL2 mL0.1 mL10 mL标样四3 mL2 mL1 mL0.2 mL10 mL（4）三份混合标样的配制和测定冲洗毛细管的同时，可以配制三份混合标样，体积如下，分别用水定容。（思考：为什么混合标样中各组分的浓度差别很大？）然后按照以上相同的方法分别测定，直到四种成分流出毛细管。苯甲醇水杨酸苯甲酸氨基苯甲酸定容总量标样一1 mL1 mL0.5 mL0.1 mL10 mL标样二2 mL1.5 mL0.75 mL0.15 mL10 mL

19、标样三3 mL2 mL1 mL0.2 mL10 mL（5）未知浓度混合样品的测定。方法与条件同上，测试未知浓度混合样品。（6）完成实验以后，用高纯水冲洗毛细管10 min，再用空气冲洗10 min。然后关闭仪器。（7）打印报告，清理实验台。【数据处理】（1）根据电泳的原理及峰面积的变化，判断两组混合标样中4个峰各自的归属。（需要查找被分析物的pKa值，并根据标样的峰面积变化推断各峰的归属，重要！）。（2）按照已知浓度混合标样电泳图所得峰面积计算未知浓度混合样品中各个组分的浓度（外标定量法）。（3）判断并分析哪个组分可以作为电渗流标记物，据此计算各个组分的表观淌度和有效淌度。本次CE实验使用的毛细管总长度50 cm，有效长度40 cm。（4）根据电泳的原理，判断在另外两种缓冲溶液下，各个峰的归属，并对各个组分迁移时间的变化做出分析和讨论。表1