Illumina平台测序原理及常见测序文库构建ppt课件

1、Illumina 平台测序原理及常见几平台测序原理及常见几 种测序文库构建流程简介种测序文库构建流程简介1ppt课件.目目录录2ppt课件.第一部分：测序测序原理与流第一部分：测序测序原理与流程程 简介简介3ppt课件.文库构建文库构建( 6 hrs)cBot HiSeq2500 MiSeqHiSeq2000 HiSeq2500 GA IIxMiSeqHCS/RTA ICS MSRCASAVABaseSpace1-8 samples1-8 samplesDNA4ppt课件.Illumina 测序流程测序流程文库构建文库构建( 6 hrs)cBotHiSeq25001-8 samplesMiSe

2、qHiSeq2000 HiSeq25001-8 samplesGA IIxMiSeqHCS/RTA ICS MSRCASAVABaseSpaceDNA5ppt课件.文库构建流程文库构建流程片段片段化化 DNA末端补末端补平平3加加A接头连接头连接接PCR6ppt课件.高质量DNA文库结构文库构建的目的是在目的DNA片段两端都连接上想要 的接头此单链部分与FlowCell表面上P7接头相同此单链部分与FlowCell表面上P5接头相同Index Sequencing Primer7ppt课件.文库构建文库构建( 6 hrs)cBot HiSeq2500 MiSeq1-8 samplesHiSeq

3、2000HiSeq25001-8 samplesGA IIxMiSeqHCS/RTA ICS MSRCASAVABaseSpace8ppt课件.测序芯片 (Flow Cell)简介flow cell是有2个或8个泳道(Lane)的 玻璃片，与一元硬币的厚度相当每个泳道(Lane)内的上下两个表面 随机的布满了能够与文库两端接头 分别互补配对的寡核苷酸(oligos,P7 和P5接头)在flow cell上进行cluster簇生成9ppt课件.仪器简介仪器简介单条单条DNA 模板模板约约1000条条DNA模板的模板的 拷贝拷贝cBotHiSeq Sequen ncceerr35个循环的桥式PCR

4、10ppt课件.cBot 工作流程DNA文库变性：使用NaOH将双链DNA文库变性为单链模板链杂交：将单链DNA模板杂交到Flow Cell 上 第一链合成：以Flow Cell 表面上的oligos为引物，合成第一链桥式PCR：冲走单链DNA模板，以合成的第一链 为模板进行35循环的桥式PCR线性化：将与P5接头连接的DNA链从Flow Cell 上去除阻断3OH：防止在后续测序过程中继续延伸DNA链杂交测序引物11ppt课件.DNA模板杂交和一链合成接头序接头序列列5-3 延延伸伸含有P7和P5两种接头 的FlowCell表面单链DNA分子与FlowCell 表面的对应接头杂交以杂交的单链

5、DNA为模板， FlowCell上的接头为引物， 合成第一链12ppt课件.新合成的链原始模板链双链DNA变性丢弃原始模板链丢弃原始模板链模板链被冲洗走新合成的链留在FlowCell 上13ppt课件.桥式PCR扩增单链DNA与FlowCell表面对应接头杂 交，形成“桥”以接头为引物进行扩增14ppt课件.桥式PCR扩增15ppt课件.变性变性双链的“桥”得到与FlowCell相连的两条互补 的单链DNA分子16ppt课件.第二轮桥式PCR扩增17ppt课件.完成桥式PCR扩增完成28循环的桥式PCR18ppt课件.线性化双链“桥”变性为单链红色箭头为P5接头上的 切割位点19ppt课件.线

6、性化切割并冲走与P5接头相连的那 条DNA链20ppt课件.阻断阻断3 OH21ppt课件.杂交Read 1 引物Read1 测序引 物将测序引物杂交到文库的接头上22ppt课件.Illumina 测序流程测序流程HiSeq2000 HiSeq2500 GA IIxMiSeqHCS/RTAICS MSRCASAVABaseSpace文库构建文库构建( 6 hrs)cBot HiSeq25001-8 samplesMiSeq1-8 samples23ppt课件.进行Read1 测序杂交Index 测序引物，进行Index 测序 Paired End Turnround，合成Read1互补链 杂交

7、Read 2 测序引物，进行Read 2 测序HiSeq SBS 测序流程24ppt课件.HiSeq SBS 测序流程123Paired End Turnaround25ppt课件.Sequencing By Synthesis，SBS测序原理4种种 Fl-NTPs +聚合酶聚合酶拍照，收集信号拍照，收集信号去阻断，切除荧光基去阻断，切除荧光基团团X 36 - 15126ppt课件.可逆终止化学反应一次加入4种修饰的dNTP(可逆终止子)准确度高可以得到同聚物序列 合成 照相，收集信号 去阻断，切除荧 光基团下一个碱基合成27ppt课件.100 MicronsClusters28ppt课件.已

8、完成测序合成的片段Blocked 3-ends变性掉已完成测序合成的 片段恢复被阻断的3 OHPaired End Turnround29ppt课件.形成形成的的 桥桥5-3延延伸伸桥式PCR5-3延伸Paired End Turnround30ppt课件.形成的形成的双双 链的链的桥桥Paired End Turnround31ppt课件.模板模板链链Paired End Turnround等温变性，完成15轮桥式 PCR后，进行线性化，将模 板链切除，保留新合成的子 链32ppt课件.新合成新合成的的 链链3 -OH阻阻断断Read2测序测序引引 物物Paired End Turnroun

9、d线性化，3 -OH阻断杂交Read2测序引物33ppt课件.Sequencing By Synthesis 2nd ReadX 36 - 1514种种 Fl-NTPs + 聚聚 合酶合酶拍照，收集信号拍照，收集信号去阻断，切除荧光基去阻断，切除荧光基团团34ppt课件.Illumina 测序流程测序流程HCS/RTA ICS MSRCASAVABaseSpace文库构建文库构建( 6 hrs)cBot HiSeq25001-8 samplesMiSeqHiSeq2000 HiSeq25001-8 samplesGA IIxMiSeq35ppt课件.第二部分：常见文库构建流程第二部分：常见文库

10、构建流程简简 介介36ppt课件.文库分类DNA类文库类文库 DNA小片段文库 DNA大片段文库 Exon文库 PCR-Free文库简化基因组文库、单细胞样本 文库等RNA类文库类文库 转录组文库 表达谱（RNA-Seq） Small RNA37ppt课件.DNA小片段文库小片段文库 DNA小片段文库 片段大小在1Kb以下的普通DNA文库（200bp,350bp,500bp） DNA小片段文库可用来进行人重测序，动植物、人重测序，动植物、 微生物的微生物的de novo和重测序，和重测序，16s rRNA测序，测序， 宏基因组测序宏基因组测序等项目类型的文库构建。38ppt课件.DNA小片段建

11、库流程39ppt课件.DNA小片段建库流程40ppt课件.DNA小片段建库流程41ppt课件.DNA小片段建库流程42ppt课件.DNA大片段文库大片段文库 DNA大片段文库，又名末端配对（mate-paired） 文库 片段长度大于1K bp。 主要用于动植物，微生物的动植物，微生物的de novo 测序测序43ppt课件.DNA大片段文库建库流程44ppt课件.DNA大片段文库建库流程45ppt课件.为什么要建大片段文为什么要建大片段文库库46ppt课件.Exon文库人类外显子组总共约30Mb，占全 部人类基因组约1%。外显子具有高度的保守型，且大部 分疾病的致病位点位于外显子区。外显子测

12、序是指利用序列捕获技术 将外显子区域DNA捕捉并富集后进行高通量测序的基因组分析方法。Exon文库主要用于人全外显子人全外显子测测 序序和目标区域测序目标区域测序47ppt课件.Exon文库流程48ppt课件.外显子捕获方式 液相杂液相杂交交 液相杂交是通过在溶液中， 利用链碱基配对的原理， 将DNA片段与探针杂交， 然后洗脱，富集目的片段。49ppt课件.Exon测序特测序特点点 优点：1、 与全基因组测序相比，外 显子测序具有测序覆盖度更深、 数据准确性更高、花费成本更 低等优势，对研究已知基因的SNP、Indel等具有较大的优势。 不足：1、与全基因组测序相比，不能 检测到基因组内较大的

13、结构性 变异。2、与转录组测序相比，不能检 测到新的基因。50ppt课件.PCR-Free文库文库 PCR-Free文库，顾名思义，就是在文库构建过 程中不需要进行PCR的文库。 主要是针对一些特殊样本，比如GC含量高，PCR扩增困难的样本；PCR产物。 不足： 所需的样本起始量较多。51ppt课件.PCR-Free文库与普通文库比较52ppt课件.简化基因组简化基因组(RAD-seq )文库文库 RAD-seq 即基于酶切的简化基因组测序技术，是指利用 限制性内切酶对基因组进行酶切，结合一定大小的插入片 段文库，对其进行高通量测序，快速鉴定高准确性的变异 标记（SNPs）信息的技术 与传统技

14、术相比，该类技术操作简单、不受参考基因组限 制、可简化复杂基因组；另外，基于SNPs 的分子标记技 术性价比高，稳定性好，在基因组中分布更加广泛，特别 是适合大样本量的分析。53ppt课件.简化基因组文库建库流简化基因组文库建库流程程54ppt课件.转录组文转录组文库库真核生真核生物物原核生原核生物物总总RNA利用利用Oligo (dT)富富 集集mRNA去去除除 rRNA随机引物六聚体反随机引物六聚体反转转 录合成录合成cDNA末端修复，加末端修复，加A，加加 接头后接头后PCR扩扩增增Illumina 测测序序将将mRNA 随机打断随机打断成成200 nt转录组测序的研究对 象为特定细胞在

15、某一 功能状态下所能转录 出来的所有mRNA。应用：转录本的种类和基因 定量基因的转录结构可变剪切发现新的转录本55ppt课件.链特异性转录组建链特异性转录组建库库 使用ssRNA-seq可以确定转录本是来自正链还是负链。以 便更加准确的获得基因的结构以及基因表达信息，并且发 现新的基因。 很多基因组区域具有正负链的转录本，反义转录是真核基 因的一个特征，是一种重要的调控方式。56ppt课件.常规转录组建库方法基础上，在合成第二条cDNA链时，替换dTTP 为dUTP，加上接头后降 解含dU的DNA单链。链特异性转录组建链特异性转录组建库库57ppt课件.均均一化一化（DSN）建库建库方法：方

16、法：构建常规转录组文库，库检合格后取80-100ng文库进行DSN处 理，然后PCR再次出库。目的：目的：减低高丰度表达基因，有效富集低丰度表达基因。DSN酶酶：双链特异性核酸酶(Duplex-Specific Nuclease, DSN)，能够选 择性降解双链DNA和DNA-RNA杂交体中的DNA,由于高丰度的基因形 成双链的速度较快，所以降解也比较多。58ppt课件.RNA-Seq 是用来研究某一生 物对象在特定生物 过程中基因表达差 异的技术，具有定 量准、可重复性高、检测范围宽、成 本低等特点。真核生真核生物物原核生原核生物物总总RNA利用利用Oligo (dT)富富集集 mRNA去去除除 rRNA随机引物六聚体反转录随机引物六聚体反转录合合 成成cDNA末端修复，加末端修复，加A，加接头加接头后后PCR扩扩增增Illumina 测测序序将将mRNA 随机打断随机打断成成200 nt59ppt课件.RNA-Seq 与常规转录组区别与常规转录组区别RNA-Seq转录组转录组应用用于基因表达丰度 检测用于拼接（1G 数据量）测序类型S