生物技术制药第二章基因工程制药：工具酶、载体、目的基因常用制备方法与导入、酵母表达系统

1、第一章绪论第一节生物技术的概念生物技术概念：以现代生命科学为基础，结合先进的工程技术手段和其他基础学科的科学原理，按照预先的设计改造生物体或加工生物原料，以提供产品或为社会提供服务的技术。生物技术：基因工程、细胞工程、酶工程、发酵工程、蛋白质工程、抗体工程、糖链工程、生物转化等。第二节生物技术药物生物技术制药概念：采用现代生物技术，借助某些微生物、植物、动物生产医药品，叫作生物技术制药。一般来讲：采用 DNA重组技术或其它生物新技术研制的蛋白质、核酸类药物，称为生物技术药物。生物药物和生物技术药物1、生物药物 biological drug指包括生物制品在内的生物体的初级和次级代谢产物或生物体

2、的某一组成部分，甚至整个生物体用作诊断和治疗的医药品。2、生物技术药物 biotechnological drug采用DNA重组技术或 其他生物技术研制的蛋白质或核酸类药物。3、生化药物运用生物化学研究方法， 将生物体中起重要生理生化作用的各种基本物质经过提取、 分离、纯化等手段制造出的药物;或者将上述这些已知药物加以结构改造或人工合成创造出的自然界没有的新药物。主要有氨基酸、多肽蛋白类、核酸类、多糖、脂、细胞生长调节因子等。4、生物制品指以微生物、寄生虫、动物毒素、生物组织作为起始原料，采用生物学工艺或分离纯化技术制备，并以生物学技术和分析技术控制中间产物和成品质量制成的生物活性制剂。包括：

3、疫（菌）苗、毒素、类毒素、免疫血清、血液制品、免疫球蛋白、抗原、变态反应原、细胞因子、激素、酶及辅酶、发酵产品、 McAb、DNA重组产品、体外免疫试剂等。一、生物技术药物的分类1 .按原料来源分类应用重组DNA技术制造的基因重组多肽、蛋白质类药物；基因药物，核酸疫苗、基因治疗剂、反义 RNA等；动物、植物组织、微生物来源的天然生物药物；合成与部分合成的生物药物。2 .按生理功能和临床用途分类治疗药物预防药物：疫苗诊断药物其它生物医药用品3 .按作用类型细胞因子类；激素；酶类；疫苗单抗反义核酸RNAi基因治疗药物。4 .按生化特性多肽类蛋白类核酸类PEG化多肽或蛋白二、生物技术药物的特性1 .

4、理化特性分子量大结构复杂稳定性差(失活变性，被降解)2 .药理学特性治疗的针对性强，治疗的生理生化机制合理，疗效可靠。细胞色素 C:治疗缺氧性疾病(治疗细胞缺氧) 药理活性高：ATP直接供能，效果确切、显著毒副作用小：主要有：蛋白质、核酸、 糖类、脂类半衰期短种属特异性生理副作用常有发生：免疫反应、过敏反应3 .在生产的制备中特殊性浓度低、提取纯化工艺复杂原料药中目标产物的降解片段稳定性差易变性、失活、易污染4 .质量控制(1)化学药物：性状、鉴别、检查、含量生物技术药物：基本要求、制造、检定(2)制造项下特殊规定：细胞株，菌种、代次等(3)检定项下特殊规定：需理化检验指标生物活性指标第二章基

5、因工程制药基因工程(Gene Engineering):基因工程是在DNA分子水平上进行设计施工的.其基本步骤(1)提取目的基因.(2)目的基因与运载体结合.形成一个重组DNA分子.(3)将目的基因导入受体细胞.(4)目的基因的表达.基因工程技术最成功的成就：用于新型生物技术药物的研制一、基因工程菌的构建与筛选(一)工具酶1、限制性核酸内切酶是一类能识别特殊核甘酸序列，并水解DNA分子的磷酸二酯键，从而切断双链DNA的核酸水解酶。主要存在于原核细菌中，帮助细菌限制外来DNA的入侵作用。1) II型限制性内切酶的基本特征 n型酶识别位点是一个回文对称结构，并且切割位点也在这一回文对称结构上。许多

6、n型酶切割DNA后，可在DNA上形成粘性末端，有利于DNA片段的重组。2)核酸内切酶作用后的断裂方式 粘性末端、平末端3)同裂酶(isoschizomers)指来源不同但识别相同靶序列的核酸内切酶。同裂酶进行同样的切割，产生同样的末端。但有些同裂酶对甲基化位点的敏感性不同。如:限制酶Hpan和Msp I是一对同裂酶（CCGG）,当靶序列中一个 5-甲基胞喀咤时Hpan不能进行切割，而MspI可以。Sma I （Serratia marcescens SB） - CCCAGGGXma I （Xanthomonas malvacaerum） - CACCGGG4）同尾酶（isocaudamer ）

7、指来源不同、识别靶序列不同但产生相同的粘性末端的核酸内切酶。相同的粘性末端称为配伍未端 （compatible end） 。杂种位点（ hybrid site ） ：由一对同尾酶分别产生的粘性末端共价结合形成的位点。一般不能被原来的任何一种同尾酶识别。6）影响核酸内切酶活性的因素（ 1） DNA 的纯度：为提高 RE 对低纯度 DNA 的反应效率，一般 :a.增加RE的用量b.扩大酶催化反应的体系（稀释）c.延长酶催化反应的保温时间。（ 2） DNA 的甲基化程度RE 是原核生物限制 -修饰体系的组成部分，因此识别序列中特定核苷酸的甲基化作用，便会强烈地影响酶的活性。为避免产生这样的问题，在基

8、因克隆中使用的是失去甲基化酶的 E.Coli 菌株制备质粒 DNA 。（ 3）酶切消化反应的温度：大多数 37 ,但也有例外SmaI 是25、ApaI 是30；MaeI 是 45、 Bcl I 是50、MaelII 是55 ；还有些RE 最适温度高达60以上（ 4） DNA 的分子结构：某些 RE 切割超螺旋的质粒 DNA 或病毒 DNA 所需要的酶量，要比消化线性DNA 的高出许多倍，最高的可达20倍。还有一些 RE 切割它们自己的处于不同部位的限制位点， 其效率亦有明显的差别。 据推测， 这很可能是由于侧翼序列的核苷酸成份的差造成的。（ 5）反应系统的组成氯化镁,氯化钠或氯化钾：不正确的N

9、aCl 或 Mg+ 浓度，会降低RE 的活性，还可能导致识别序列的改变。Tris-HCl :维持最适的 pH 值（pH =7.4）。伊疏基乙醇或二硫苏糖醇（DTT）:维持酶的稳定性。牛血清蛋白（ BSA ） ：维持酶的稳定性。2、 DNA 连接酶能够将DNA链上彼此相邻的3'-羟基（OH）和5'-磷酸基团（-P）,在NAD+或ATP供能的作用下，形成磷酸二酯键。只能连接缺口（ nick）,不能连接裂口（ gap）。而且被连接的 DNA链必须是双螺旋 DNA分子的一部分。1）大肠杆菌的 DNA 连接酶：是一条分子量为 75KD 的多肽链。可以封闭双螺旋 DNA 上具有 5 -磷酰

10、基和3 -羟基的缺口（nick） ，不能封闭裂口（gap） ；因此，只能连接粘性末端的 DNA 片段，不能拼接DNA 平头末端；用于粘性末端 DNA 或切口间连接。2） T4 DNA 连接酶（ DNA ligase ）该酶常从 T4 噬菌体的感染细胞中提取，是由 T4 噬菌体基因组所编码的，它可催化 DNA 中磷酸二脂键的形成，从而使两个片段以共价键的形式结合起来。基因工程中常用的连接酶是T4 连接酶。DNA 连接酶对具有粘性末端的 DNA 分子经退火后能很好地连接， 对平末端的 DNA 分子也可以进行连接， 但连接效率较低，必须加大酶的用量。3、 DNA 聚合酶DNA 聚合酶催化 dNTP

11、聚合到核酸链上的酶。是DNA 复制的主要酶。全称叫依赖DNA 的 DNA 聚合酶（ DNA-dependent DNA polymerase ）或 DNA 指导的 DNA 聚合酶（ DNA-directed DNApolymerase ） ，均缩写为DDDP 。（ 1）大肠杆菌DNA 聚合酶DNA 聚合酶 I （ Pol I）、dna 聚合酶 n （ Pol n）、DNA聚合酶出（Pol出）、Pol I和Pol n的主要功能参与 DNA的合成；Pol m的功能同DNA的复制有关；Pol I同DNA分子克隆的关系最为密切。DNA聚合酶I的酶活性：5' - 3聚合酶活性；5' -

12、3外切酶活性；3'f的外切酶活性（较低）。（ 2） Klenow 聚合酶Klenow片段（Klenow fragment ）： E.coli DNA 聚合酶I经部分水解生成的 C末端605个aa片段。该片段彳留了 DNA聚合酶I的5'-鳏合酶和3'卜切酶活性，但失去了5' -3卜切酶活性。用途：补平3 -凹端利用5' -3' DN聚合酶活性在模板和引物（DNA或RNA）存在的条件下，以dNTP作底物，沿5谢向合成与模板互补的DNA。3'-凹端标记3'-凸端削平利用单链特异性的3-5外切核酸酶活性（ 3） T4 噬菌体 DNA 聚合

13、酶活性：5'f3、聚合酶活性和3'-5、外切酶活性，且 3'f5、外切酶活性对单链 DNA的作用比对双链 DNA强。在没有dNTP存在的情况下，3,外切酶活性便是 T4 DNA聚合酶的独特功能。作用于双链DNA片断，并按3'-用1方向从3 -OH 末端开始降解DNA 。如果反应物中存在一种 dNTP 时，它的水解作用进行到暴露出同反应物中唯一的 dNTP 互补的核苷酸时就会停止。（ 4） T7 噬菌体 DNA 聚合酶活性：5'-3'聚合酶活性；有单链及双链的3'f5'外切酶活性，但无 5'-3'外切酶活性；特点：极

14、佳的连续合成能力应用：（ 1）用于长模板DNA 的引物延伸反应；（2）通过单纯的延伸或取代合成途径标记DNA 3' 末端；（ 3）使双链DNA 的 5'或 3'突出末端变成平末端。（ 5） Taq DNA 聚合酶显著特点：热稳定性70反应2h残留活性为原来的90% ；93反应2h残留活性为原来的60% ；94反应2h残留活性为原来的40% 。应用：（ 1） DNA 序列测定（ 2） PCR （polymerase chain reaction） 对 DNA 的特定片段进行体外扩增。（ 6）逆转录酶（reverse transcriptase ）这类酶来自于逆转录病毒，它

15、可以 RNA 为模板，催化合成DNA 。目前常用的有禽源（ AMV ）及鼠源（ M-MLV ）逆转录酶两种。 RNA 指导的 DNA 聚合酶。活性：5' -3聚合酶活性和 RNaseH活性。聚合作用所需模板可以是RNA或DNA ,引物是带3'-OH的RNA或DNA。用途： （ 1）在体外以 mRNA 为模板合成cDNA ；（ 2）对有5'突出末端的DNA 片段作末端标记（补平） ；（ 3）双脱氧法测序；（ 4）以DNA 或 RNA 为模板合成核酸探针。（ 7）末端转移酶（terminal transferase）:末端脱氧核甘酸转移酶。来源于前淋巴细胞和分化早期的类淋巴

16、细胞。功能：催化5'脱氧核甘三磷酸进行 5'一3'方向的聚合作用,逐个将dNTP分子加到线性 DNA分子3'-OH端。是一种不依赖于模板的DNA聚合酶。用途：(1)用于给外源DNA片段和及载体分子加上互补同聚物尾巴；(2)标记DNA片段的3'末端。(8)碱性磷酸酶功能： 催化核酸脱5'-P基团，使DNA或RNA片段5'-P末端转换成5'-OH末端。来源： 有两种，分别来自于大肠杆菌和小牛肠道，前者叫 bacterial alkaline phosphatase (BAP);后者叫calf intestinal alkaline p

17、hosphatase (CIP)用途： 去除DNA片段5磷酸，防止自身环化；同位素32P标记前白去除5磷酸。(9) T4 多核甘酸激酶(T4 polynucleotide kinase )来源：T4噬菌体感染的E.coli。功能：催化丫磷酸从ATP分子转移给 DNA/RNA 的5 -OH端某些情况下，上述的多聚核甘酸的反应可以反方向进行，将 ATP的r磷酸基团与多聚核甘酸的 5'端磷酸基团交换，从 而不必用碱性磷酸酶对底物进行脱磷酸化。 用途：标记DNA的5'-末端；使缺失5-P末端的DNA发生磷酸化作用。(10) S1核酸酶来源： 来源于稻谷曲霉(Aspergillus or

18、yzae )功能：是一种高度单链特异的核酸内切酶。注意： 对双链DNA、双链RNA和DNA-RNA 杂交体相对不敏感。(二)载体*各种载体 制备流程怎样制备成蛋白载体(vector),基因工程上的载体是能将分离或合成的基因导入细胞的DNA分子。基因工程中有三种主要类型的载体：质粒DNA、病毒DNA、科斯质粒。载体必须具备的几个性能分子较小，可携带比较大的DNA片段。能独立于染色体而进行自主复制并且是高效的复制。要有尽可能多种 RE的切割位点，但每一种 RE又要最少的切割位点(多克隆位点 multiple cloning sites , MCS)。有适合的标记，易于选择。有时还要求载体要能启动外

19、源基因进行转录及表达，并且尽可能是高效的表达。从安全角度考虑，要求载体不能随便转移，仅限于在某些实验室内特殊菌种内才可复制等等。载体的分类(根据功能：)克隆载体：克隆一个基因或 DNA片断表达载体：用于一个基因的蛋白表达整合载体：把一个基因插入到染色体组中(根据来源：)质粒载体噬菌体载体柯斯质粒载体真核细胞表达载体其中质粒DNA是最常用的载体，但运载能力低，柯斯质粒是质粒和入噬菌体DNA的结合体，运载能力最高。在这三种类型的基础上，根据不同的目的，出现了各种类型的改造载体。质粒(plasmid )载体质粒是一种独立于染色体外的小分子环状DNA ,可自身复制和表达，有的质粒还带有可做为选择性标记

20、的抗药性基因。作为载体的质粒大多是由天然质粒经人工适当改造而成的，目前已有多种经改造的良好的质粒载体。 克隆的质粒载体 允许外源的DNA插入，储存。主要是 DNA水平上的操作。基因表达的质粒载体允许外源DNA的插入、储存和表达。质粒的生物学特性：1)质粒DNA的构型：SC型：共价闭合环形 DNA (cccDNA)OC 型：开环 DNA (ocDNA)L 型：线性 DNA (cDNA)作为载体的质粒都含有三种共同的组分：复制基因(Ori)选择性记号(Amp,Kana)多克隆位点(MCS)“cosmlcP词是由英文 “cos sitearrying plasmid缩写而成的，其原意是指带有粘性末端

21、位点( cos)的质粒用正常的质粒与噬菌体 入的cos位点构成其上的cos位点可识别噬菌体外壳蛋白。凡具有 cos位点的任何DNA分子只要在长度上相当于噬菌体的基因组，就可以同外壳蛋白结合而被包装成类似噬菌体入的颗粒插入柯斯质粒载体的外源DNA片段的长度可大于 40kb(三)目的基因常用制备方法*四种制备方法1 .化学合成法较短的基因 <100bp合成两条基因互补链片断，经退火成为两端黏性末端的DNA片断2 .PCR 法适用于克隆序列清楚的基因以基因组DNA为模板，直接进行 PCR扩增较难多采用以mRNA为模板的RT-PCR法3 .基因文库法：基因文库(gene library)：是指某

22、一特定生物体全部基因组的克隆集合，包括所有外显子和内含子序列。基因文库的构建：鸟枪法(shotgun)4 .CDNA文库法cDNA (complementary DNA )为具有与某 RNA链呈互补的碱基序列的单链DNA ,或此DNA链与具有与之互补的碱基序列的DNA链所形成的DNA双链。mRNA的cDNA ,与原来基因的 DNA (基因组 DNA , genomic DNA )不同而无内含子； 在mRNA存在的3'末端的多A序列的核昔序列，外显子序列、先导序列以及后续序列等。cDNA文库指某生物某发育时期所转录的全部mRNA ,经反转录形成的 cDNA片段与某种载体连接而形成的克隆的

23、集合。经典cDNA文库构建的基本原理是用Oligo(dT)作逆转录引物，或者用随机引物，给所合成的cDNA加上适当的连接接头，连接到适当的载体中获得文库。(四)载体DNA与目的基因的连接*两种连接方法DNA分子体外重组：连接酶催化载体 DNA与目的基因DNA片段连接。形成重组子(recombinant)的过程。1 .粘性末端的连接：经双酶切获得粘性末端，用连接酶进行连接2 .平头末端的连接：连接效率低，一般采用加尾法、接头法3 .连接效率：目的基因与载体DNA的摩尔比大于1(五)重组DNA导入宿主细胞*见总流程图宿主细胞：1原核细胞：大肠杆菌、枯草杆菌链球菌2真核细胞：酵母、昆虫细胞、哺乳动物

24、细胞、植物细胞原核细胞的转化方法：1电穿孔转化法2化学转化法导入方式：1转化(transformation) 转化(transformation)：以质粒为载体构建的重组DNA分子导入原核细胞的过程 .2转染(transfection) 转染(transfection)：以噬菌体或病毒为载体构建重组DNA分子导入真核细胞的过程 .3 感染(infection)1 .重组DNA导入大肠杆菌表达产物的形式：细胞内不溶性表达(包含体)、胞内可溶性表达、细胞周质表达，极少还可分泌到胞外表达。不同的表达形式具有不同的表达水平，且会带来完全不同的杂质。氯化钙转化法：在基因克隆技术中，转化(transfor

25、mation)特指质粒DNA或以它为载体构建的重组子导入宿主细胞的过程。是利用低温(0C)和氯化钙(CaCl2)低渗溶液的理化处理使宿主细胞处于容易吸收外源DNA的状态，即感受态(competence)。转染法：如果外源DNA被包装成入噬菌体颗粒，则可通过噬菌体感染机制导入宿主细胞。体外包装是将重组DNA分子与入噬菌体的头部、尾部以及有关包装蛋白混合，从而组装成完整具有感染力的入噬菌体粒子。2 .重组DNA导入酵母酵母：繁殖迅速，可廉价的大规模培养，而且没有毒性，基因工程操作与原核生物相似，表达产物直接分泌到细胞外，简化 了分离纯化工艺。表达产物能糖基化。特别是某些在细菌系统中表达不良的真核基

26、因，在酵母中表达良好。目前以酿酒酵母应用最多。酵母电转化法：酵母用山梨醇处理，制备感受态细胞；将线T化DNA、感受态细胞置于电转仪中，通过电击将DNA导入细胞；电击后应立即加入冰冷的山梨醇溶液(是为了修复电击受损的酵母细胞，加入的越快越有利于细胞的恢复)。3 .重组DNA导入链霉菌链霉菌：重要的工业微生物。特点是不致病、使用安全，分泌能力强，可将表达产物直接分泌到培养液中，具有糖基化能力，可做理想的受体菌。原生质体转化法：原生质体protoplast:人工条件下用溶菌酶等除去细胞壁后，所留下的部分。用PEG处理原生质体(化学助鬲剂如 PEG加Ca2+) 加入DNA4 .重组DNA导入哺乳类细胞

27、哺乳动物细胞：由于外源基因的表达产物可由重组转化的细胞分泌到培养液中，培养液成分完全由人控制， 从而是产物纯化变得容易。产物是糖基化的，接近或类似于天然产物。但动物细胞生产慢，生产率低，而且培养条件苛刻，费用高，培养液浓度 较稀。1显微注射法2磷酸钙转染法3葡聚糖转染法4阳性介质转染法5电穿孔法6细胞融合法7病毒感染法(六)重组子的筛选与鉴定*知道大方框几种筛选方法1 .载体遗传标记法(1)抗生素抗性筛选法如果外源DNA片段插入载体的位点位于抗生素抗性基因之外，将转化后的重组体细胞置于含有该抗生素的培养基平板上进行培养，仍可长出菌落。此法缺点是假阳性率高在含有抗生素的培养基中能够生长的抗性细胞

28、内可能存在哪几种类型的载体？(2)互补筛选法采用遗传缺陷型宿主细胞、而重组子含有编码该基因的DNA序列。最常用的为蓝白斑筛选某些载体，如 M13噬菌体载体，pUC质粒系列等，它们的载体上都携带lacZ基因一段序列，它编码3 -半乳糖甘酶的“肽，而宿主细胞为 lac ZAMl5的突变株。当将上述载体的转化细胞培养在含有x-gal和IPTG平板中，由于基因内互补作用，产生有生物活性的3-半乳糖甘酶,把培养基中的无色的 x-gal(5-澳-4-氯-3-口引喋-3-D-半乳糖昔)分解成半乳糖和呈蓝色的 5-澳-4氯-靛蓝，使菌落呈蓝色：(3)营养缺陷型筛选法用某些物理因素或化学因素处理宿主细胞，使基因

29、发生突变，丧失合成某一物质(如氨基酸、维生素、核甘酸等)的 能力，因而它们不能在基本培养基上生长，必须补充某些物质才能生长。这样从野生型经诱变筛选得到的菌株，称为 营养缺陷型。导入编码某些营养成分基因的载体，可使营养缺陷型细胞在缺少该营养成分的培养基中生长(4)噬菌斑筛选法：噬菌体成功感染细菌将导致溶菌未插入外来DNA的空载体由于长度过小不能装配成噬菌体颗粒。2 .核酸分子杂交法(1)菌落(或噬菌斑)原位杂交(in situ hybridization)将转化细胞培养在琼脂平板上，当形成菌落或噬菌斑后，再将硝酸纤维滤膜贴在平板上，使菌落或噬菌斑转印到硝酸 纤维滤膜上。翻转此滤膜并置于另一不含菌

30、的平板上培养，培养后的滤膜上可长出菌落或噬菌斑。取出滤膜，用裂解液处理使菌体裂解，释放出DNA 。再用碱处理，使 DNA变性，经烘烤将变性 DNA固定于滤膜上。然后用放射性同位素标记的核酸探针进行分子杂交,并经放射自显影，黑点代表杂交上的菌落， 即可筛选到阳性克隆。(2) DNA 印迹分析(Southern blotting)通过吸附或电泳方法将经凝胶电泳分离的DNA分子物质从胶上转移到固相载体上，再与特定的探针反应从而达到检测或鉴定这些DNA分子物质的过程。(3) Northern Blotting ( Northern 迹)DNA ,用1-2种RE酶切，然后进行凝胶电泳，检测3 .限制性酶

31、谱分析法将初步筛选的阳性克隆小量培养后，提取重组质粒或重组噬菌体 插入DNA片段大小。DNA进行序列测定4 . DNA序列测定为了确证目的基因序列的正确性，必须对重组体的5 .目的基因表达产物测定法例：免疫斑点测定法 如果表达产物是一种蛋白质或蛋白质的一部分，它具有抗原性可与其特异抗体发生免疫反应。此法实验操作极似菌落(或噬菌斑)原位杂交。将平板上的克隆转移到滤膜上，处理滤膜使菌体裂解，释放出蛋白质，固 定于滤膜上，加入标记抗体。如果抗体用放射性同位素标记，则免疫反应后进行自显影； 若加入的抗体用酶偶联(酶标)，那么此酶就可将无色底物水解成有色产物。基因载体目的基因质粒噬菌体病毒PCR cDN

32、A人工合成基国文库限制性内切薛有切口的目的基| DNA凌桂降重组体转染体外包装带重组体的宿主细能表型面选电泳法,核酸杂交,免疫学方法*看图叙述基因工程的过程(七)原核细胞表达的特点及选择1 .外源基因表达的调控元件*从一个载体完整叙述制备过程(1)启动子：是DNA链上能与RNA聚合酶结合并起始 mRNA合成的一段序列plac启动子：最早应用于的表达系统是Lac乳糖操纵子ptrc启动子：是trp启动子和lac启动子的拼合启动子入PL:入噬菌体的转录启动子PL,该启动子受控于入噬菌体 cI基因产物T7启动子：是当今大肠杆菌表达系统的主流(2)核糖体结合位点(rbs):原核微生物的 mRNA 结合核

33、糖体的序列称为SD序歹U （shine-dalgarno sequence）。S1 与 16S rRNA 的 3'端SD序列位于AUG上防I 3-11个核甘酸处的一段 3-9个碱基的DNA序列,该序列和核糖体蛋白 互补，形成核糖体-mRNA复合体，共同起始蛋白质的合成。SD序列与AUC之间的距离可直接影响表达效率。（3）终止子：是基因3 '端可被RNA聚合酶识别并停止转录功能的特定序列。2 .外源基因在大肠杆菌中的表达形式大肠杆菌被内膜、外膜分隔为胞内、周质、胞外三个区域表达可定位于胞内、周质、胞外胞内表达率高，但易行成包涵体（1）胞内表达的两种方式 a）非融合蛋白的胞内表达

34、表达非融合蛋白的操纵子必须改建成：细菌或噬菌体的启动子-细菌的RBS-真核基因的AUG-结构基因-*。易被蛋白酶破坏；N端有甲硫氨酸，易引起免疫反应非融合型表达载体主要元件：强启动子，SD, ATG:第一个密码子b）融合蛋白的表达融合蛋白氨基端是原核序列竣基端是真核序列；优点：操作简便蛋白质在菌体内比较稳定易高效表达；融合型表达载体C端融合基因N端融合基因1）融合型载体-pGEX系列Ptac： IPTG 诱导GST融合蛋白一直接纯化产物切割方便：pGEX-1 T 一凝血酶pGEX-2T-凝血酶pGEX-3T-X 因子位相载体（见PPT）1 .小分子量或易降解，或对宿主有毒的目的蛋白的表达2 .

35、GST标签纯化树脂 GST Resin纯化2）融合型载体His融合1. His-Tag分子量小，无抗原性2. Ni-NTA Resin （His标签纯化树脂） 亲和纯化3）融合型载体 IgG融合pBG-2是由pBV220系统衍生的便于产物纯化的融合表达载体。该质粒在PRPL启动子下游插入 proteinG的IgGFc结合区基因片段180个碱基对，1 .可用亲和层析（SPA）。简化下游工艺。2 .澳化氢裂解，不用酶（2）分泌型表达：将外源基因接到信号肽之后，使之在胞质内有效地转录和翻译，当表达的蛋白质进入细胞外膜和细胞内膜之间的周质 后时，被信号肽酶识别切割，从而释放出有生物活性的外源基因表达产

36、物。产量不高，信号肽不被切割或不在特定位置上切割目标蛋白在周质空间中表达的优点：大肠杆菌周质空间中自身蛋白质的数量约为100种，只占菌体总蛋白数量的 4%。蛋白水解酶的含量与在细胞质中相比也少得多，因此目标蛋白在周质空间中表达有利于分离纯化和减少蛋白水解酶的降解。目标蛋白从细胞质转运到周质空间过程中信号肽被加工切除，有效地避免了N端附加的甲硫氨酸的产生。周质空间中呈氧化型的氧化还原态势使目标蛋白能够较好折叠，维持正确的构象。3 .大肠杆菌中外源蛋白表达效率的影响因素(1)外源基因密码子的使用稀有密码子：AGA、AGC、ATA、 CCG、 CCT、CTC、CGA、GTC 共八种采用稀有密码子会导

37、致：表达效率低下、错配率高可采用定点突变的策略进行同义突变(2) mRNA的结构：mRNA的一级结构对翻译效率的影响采用偏好密码子(增加 T、A含量)大肠杆菌的核酸酶系统能专一性地识别外源DNA或RNA并对其进行降解。mRNA的二级结构对翻译效率的影响发夹的形成的双重彳用一即可保护mRNA不被降解、但阻碍翻译的起始和延伸(3)表达载体的选择1)载体能够独立的复制；2)具有灵活的克隆位点和方便的筛选标记。且克隆位点应在启动子序列后，以使克隆的外源基因得以表达；3)具有 很强的启动子，以便使RNA聚合酶集中力量转录克隆的外源基因，而不转录无关的基因；4)具有抑制子，使启动子受到控制，只有当诱导时才能进行转录；5)具有很强的终止子；6)所产生的mRNA必须具有翻译的起始信号，即起始密码AUG和SD序列， 以便转录后能顺利翻译。(4)外源蛋白的稳定性组建融合蛋白；利用信号肽，分泌型表达；特异性突变；位点特异突变，改变二硫键位置；蛋白酶缺陷型宿主(八)真核细胞表达的特点及选择*从一个载体完整叙述制备过程由于：原核表达系统缺乏蛋白翻译后加工修饰多以包涵体形式存在外源蛋白在原核生物中不稳定，易被降解真核表达系统包括酵母表达系统昆虫细胞表达系统哺乳类细胞表达系统1 .酵母表达系统最常用的是巴斯德 毕赤酵母(pichia P