CH12-TAN 基因诊断与基因治疗

1、.第十六章第十六章.基因诊断的概念：基因诊断的概念：以以DNA和和RNA为诊断材料，为诊断材料， 应用分子生物学技术方法，应用分子生物学技术方法，直接检查基因的结构、或表直接检查基因的结构、或表达是否异常，对人体状态和达是否异常，对人体状态和疾病作出诊断的方法。疾病作出诊断的方法。.用途用途诊断下列两种类型疾诊断下列两种类型疾病：病：1、内源基因的变异、内源基因的变异2、外来生物的入侵、外来生物的入侵 基因结构的异常基因结构的异常基因致病基因致病 基因表达的异常基因表达的异常.第一节第一节 基因诊断基因诊断一、基因诊断的特点：一、基因诊断的特点：1.特异性高，针对性强：特异性高，针对性强： 使

2、用基因探针通过分子杂使用基因探针通过分子杂交进行高特异性分析以基因作为检测对象，属于交进行高特异性分析以基因作为检测对象，属于病因诊断或发病原因分析。病因诊断或发病原因分析。2. 灵敏度高灵敏度高: 用放射性同位素、酶或化学发光试剂用放射性同位素、酶或化学发光试剂标记探针，有很高的检测灵敏度，标记探针，有很高的检测灵敏度，PCR扩增也有扩增也有很高的灵敏度。很高的灵敏度。3.早期诊断：早期诊断：无临床表现无临床表现4.取样方便：取样方便：不受组织时相限制不受组织时相限制5.安全高效：安全高效：不必培养高危病菌病毒，还可分亚型不必培养高危病菌病毒，还可分亚型6. 适应范围广：适应范围广：可检测内

3、源性基因和外来基因。可检测内源性基因和外来基因。.二、基因诊断的内容和技术二、基因诊断的内容和技术n直接诊断直接诊断_致病基因明确致病基因明确n间接诊断间接诊断_致病基因不明确，致病基因不明确， 基因连锁分析基因连锁分析n分子基础分子基础基因结构异常基因结构异常 基因表达异常基因表达异常.（1） DNA序列测定序列测定（2）核酸分子印迹杂交）核酸分子印迹杂交（3）聚合酶链反应（）聚合酶链反应（PCR） 单链构象多态性检测单链构象多态性检测PCR-SSCP 限切酶酶谱分析限切酶酶谱分析PCR-RFLP 随机引物分析随机引物分析 PCR-RAPD（4） DNA芯片技术芯片技术基因诊断的常用技术类型

4、基因诊断的常用技术类型.1、点突变的诊断、点突变的诊断nPCR结合点杂交结合点杂交n DNA芯片技术芯片技术n 限制性片断长度多态性分析法限制性片断长度多态性分析法RFLP针对不同突变类型的基因诊断针对不同突变类型的基因诊断技术技术. 正常基因：设计寡核苷酸探针正常基因：设计寡核苷酸探针MGGTACGATGCGGTTAACGCGCCATGCTACGCCAATTGCGC 突变基因：设计寡核苷酸探针突变基因：设计寡核苷酸探针N GGTACGATGTGGTTAACGCGCCATGCTACACCAATTGCGC .M NM NM NM N.杂交的结果：杂交的结果：（）受检者）受检者DNA与与 N 杂交

5、，与杂交，与M不杂交：突不杂交：突变基因纯合子变基因纯合子 （）与）与M、N都能杂交：突变基因杂合子都能杂交：突变基因杂合子 （ ）与）与M 杂交，与杂交，与N不杂交：没有这种突变不杂交：没有这种突变基因基因 （）M、N均不杂交：可能是新突变均不杂交：可能是新突变.（2）诊断未知的点突变）诊断未知的点突变 常用检测方法：常用检测方法： PCR-SSCP DNA芯片芯片 测序测序.PCR-SSCP检测法检测法单链构象多态性单链构象多态性Single strand conformation polymorphismSSCP. 基本原理基本原理 单链单链DNA在中性溶液中可形在中性溶液中可形成一定的

6、空间构象，构象与其碱成一定的空间构象，构象与其碱基顺序相关。因此当单链基顺序相关。因此当单链DNA中中碱基变异碱基变异时，如碱基替换，它的时，如碱基替换，它的空间构象空间构象也发生一定变化。这种也发生一定变化。这种现象称为单链构象多态性。现象称为单链构象多态性。 . 单链单链DNA在非变性聚丙烯在非变性聚丙烯酰胺凝胶中电泳时，其迁移率酰胺凝胶中电泳时，其迁移率不仅与不仅与链长链长有关，还与单链有关，还与单链 DNA的的空间构象空间构象有关，因此碱有关，因此碱基变异引起的构象变化也可改基变异引起的构象变化也可改变单链变单链DNA的电泳迁移率。的电泳迁移率。.ssDNAdsDNA高温变性，快速冰浴

7、高温变性，快速冰浴野生型野生型DNA突变型突变型DNASSCP原理示意图原理示意图慢慢快快点样孔点样孔.2、少数核苷酸缺失或插入突、少数核苷酸缺失或插入突变的诊断变的诊断方法同点突变的诊断方法同点突变的诊断.3、大片断缺失或插入突变的诊断、大片断缺失或插入突变的诊断 常采用常采用PCR法法致病基因致病基因引物引物1 引物引物2 引物引物3引物引物4 . 4、基因重排（染色体易位）的、基因重排（染色体易位）的诊断诊断 常采用常采用PCR法法引物引物1 引物引物2 引物引物3.5、基因扩增的诊断、基因扩增的诊断 常采用常采用Southern印迹杂印迹杂交定量法交定量法. 关于多态性分析关于多态性分

8、析 基因组的核酸分子碱基排列顺序基因组的核酸分子碱基排列顺序在同种生物的不同个体之间或等位基在同种生物的不同个体之间或等位基因之间存在差异的现象称为基因多态因之间存在差异的现象称为基因多态性。性。 DNA多态性可分为位点多态性多态性可分为位点多态性和重复序列多态性两种。和重复序列多态性两种。 .1、限制性片段长度多态性、限制性片段长度多态性（restriction fragment length polymorphism,RFLP）分）分析析. DNA分子中某些碱基的变分子中某些碱基的变异（即位点多态性）可使某种异（即位点多态性）可使某种限制性核酸内切酶的切点消失限制性核酸内切酶的切点消失或出

9、现新的切点，因此用同一或出现新的切点，因此用同一种限制性核酸内切酶消化不同种限制性核酸内切酶消化不同个体的个体的DNA分子时，会产生各分子时，会产生各不相同的限制性片段类型。这不相同的限制性片段类型。这种现象称为限制性片段长度多种现象称为限制性片段长度多态性。态性。. 限制酶酶切位点的改变造限制酶酶切位点的改变造成的成的RFLP可分为两种情况：可分为两种情况： 限制酶识别位点发生单限制酶识别位点发生单个碱基置换，导致酶切位点消个碱基置换，导致酶切位点消失或获得，此称为失或获得，此称为点多态性点多态性。这种多态性只有两个等位片断，这种多态性只有两个等位片断，即多态位点的有或无。即多态位点的有或无

10、。. 限制酶识别位点之间的限制酶识别位点之间的DNA序列缺失、插入或重组，序列缺失、插入或重组，限制酶识别序列不发生变化，限制酶识别序列不发生变化，但它在基因组中的位置发生了但它在基因组中的位置发生了变化。这种多态性可以有两个变化。这种多态性可以有两个或两个以上的等位片断。或两个以上的等位片断。.RFLP分析法分析法 限制酶酶切图谱直接分析法限制酶酶切图谱直接分析法 RFLP间接分析法间接分析法.（1）限制酶酶切图谱直接分析法）限制酶酶切图谱直接分析法 限制酶酶切限制酶酶切SouthernSouthern印迹印迹杂交。杂交。 PCR PCR限制酶酶切限制酶酶切.应用应用RFLP诊断镰刀状红细胞

11、性贫血诊断镰刀状红细胞性贫血正常人正常人 珠蛋白基因珠蛋白基因 GAGHbS的的 珠蛋白珠蛋白mRNA Glu正常人正常人 珠蛋白肽链珠蛋白肽链GUGHbS的的 珠蛋白肽链珠蛋白肽链ValHbS的的 珠蛋白基因珠蛋白基因 6CAC正常人正常人 珠蛋白珠蛋白mRNA 6CTC.Mst酶切位点酶切位点CCTNAGGCCTNTGGMst酶酶AT替换替换.HbA-CCT GAG GAG-HbS-CCT GTG GAG-MstMstMst.SSASFAARFLP法检测法检测HbSSS:HbS纯合子纯合子AS:HbS杂合子杂合子AA:正常正常F:被检胎儿被检胎儿(放射性自显影图谱放射性自显影图谱).（2）

12、RFLP间接分析法间接分析法RFLP连锁分析法连锁分析法 甲型血友病甲型血友病 疾病种类：疾病种类：X染色体连锁性染色体连锁性遗传病遗传病 缺陷基因：凝血因子缺陷基因：凝血因子基因基因 主要临床表现：出血性疾病主要临床表现：出血性疾病. 应用应用PCR-RFLP连锁分析法连锁分析法诊断甲型血友病诊断甲型血友病 用一对引物扩增凝血因子用一对引物扩增凝血因子基因第基因第1818外显子内的一个外显子内的一个142bp142bp片片断，该片断含一个断，该片断含一个BclBcl多态性位多态性位点。酶解后，如果存在点。酶解后，如果存在BclBcl酶切酶切位点，则产生位点，则产生99bp99bp和和43bp

13、43bp两个片两个片断；如果不存在则只有断；如果不存在则只有142bp142bp一个一个片断。研究证明，片断。研究证明，142bp142bp片断与甲片断与甲型血友病基因连锁。型血友病基因连锁。.142bp99bp正常男性女性携带者先证者胎儿绒毛样品.2、DNA重复序列多态性分析重复序列多态性分析.（三）基因表达异常的诊断（三）基因表达异常的诊断1、mRNA的定量分析的定量分析（1）相对定量）相对定量 斑点杂交斑点杂交 RT-PCR（2）绝对定量）绝对定量2、mRNA长度分析长度分析 Northern印迹杂交印迹杂交 RT-PCR. 三、遗传病的基因诊断三、遗传病的基因诊断 1、直接诊断策略、直

14、接诊断策略 2、间接诊断策略、间接诊断策略. （一）血红蛋白病（一）血红蛋白病 1、DNA检测与分析检测与分析（1）PCR-限制酶谱分析法限制酶谱分析法（2）Southern印迹杂交分析法印迹杂交分析法 2、RNA检测与分析检测与分析 RT-PCR.镰状细胞贫血病（镰状细胞贫血病（sickle cell aneamia）Mst II 酶切位点酶切位点 CCTNAGG GGANTCC点突变点突变T ACCANAGGGGTNTCC 酶切酶切 凝胶电泳凝胶电泳 Southern block 珠蛋白基因探针杂交珠蛋白基因探针杂交 .2. 地贫地贫(1) -地贫地贫1）DNA检测与分析检测与分析（a）R

15、FLP（b）PCR2）RNA检测与分析检测与分析 RT-PCR.（2） -地贫的基因诊断地贫的基因诊断1) DNA检测与分析检测与分析（1）PCR-探针法探针法（2）PCR-RFLP连锁分析法连锁分析法（3）DNA芯片技术芯片技术2)RNA检测与分析检测与分析 RT-PCR. C地中海贫血地中海贫血 珠蛋白基因珠蛋白基因3端缺失端缺失0.6 kbBgl IIBgl II A C.（二）血友病（二）血友病Anfactor VIII 基因缺陷（碱基因缺陷（碱基取代、缺失或插入等）基取代、缺失或插入等）n基因产物基因产物凝血因子凝血因子VIII 无无活性或不稳定活性或不稳定，导致凝血，导致凝血障碍障

16、碍。nPCR扩增因子扩增因子VIII基因基因的的18号外显子号外显子142 bp片段片段nBcl I 限制酶限制酶 酶切位点在酶切位点在基因内基因内18号外显子号外显子3 端端n电泳染色电泳染色,分析片段的分析片段的家系分布家系分布,作出产前诊断作出产前诊断142 bp 99 bp父父 母母 儿儿 胎儿胎儿 ( 先证者先证者) (女女).四、四、 肿瘤的基因诊断肿瘤的基因诊断一一)肿瘤基因诊断的策略肿瘤基因诊断的策略1、检测肿瘤标记基因或、检测肿瘤标记基因或mRNA2、检测肿瘤相关基因、检测肿瘤相关基因3、检测肿瘤相关病毒基因、检测肿瘤相关病毒基因. （二）（二） 肿瘤相关基因的检测肿瘤相关基

17、因的检测 ras癌基因的检测癌基因的检测1、常见突变类型：、常见突变类型：点突变（点突变（突变热点在突变热点在12、13、61位密码子的位密码子的编码区）编码区）2、常用检测方法、常用检测方法（1）PCR-ASO（2）PCR-SSCP.抑癌基因抑癌基因p53的检测的检测1、常见突变类型：、常见突变类型：点突变点突变突变热点在突变热点在58号外显子号外显子，有少量插，有少量插入或缺失入或缺失2、常检测方法、常检测方法（1）PCR-SSCP（2）PCR结合序列分析结合序列分析（3）PCR-RFLP.五、感染性疾病的基因诊断五、感染性疾病的基因诊断n目前应用最多是目前应用最多是PCR法法，不仅可，不

18、仅可检测病检测病原体的原体的DNA（如乙肝病毒、巨细胞病毒、（如乙肝病毒、巨细胞病毒、乳头瘤病毒、结核杆菌等），而且可乳头瘤病毒、结核杆菌等），而且可检检测测RNA病原体病原体（RT-PCR检测艾滋病病检测艾滋病病毒、丙肝病毒等）。毒、丙肝病毒等）。.应用范围应用范围1. 可快速准确查出致病病原体可快速准确查出致病病原体;2.适于早期诊断、带菌带毒者和潜适于早期诊断、带菌带毒者和潜 在感染的发现；在感染的发现；4. 病原体抗药性的快速敏感试验病原体抗药性的快速敏感试验;5.对微生物的科属种进行准确分类对微生物的科属种进行准确分类 鉴定鉴定;。.六六 基因诊断在法基因诊断在法医学中的应用医学中的

19、应用nPCR结合DNA指纹技术.nSouthern blot 应用nDNA指纹分析血迹中的血迹中的DNA.第二节第二节 基因治疗基因治疗Gene therapy基因治疗的概念基因治疗的概念 基因治疗是指把目的基因导入人体，基因治疗是指把目的基因导入人体，通过在特定靶细胞中表达该细胞本来不通过在特定靶细胞中表达该细胞本来不表达或低表达、或已异常突变而不表达表达或低表达、或已异常突变而不表达的基因，或采用特定方式关闭、抑制异的基因，或采用特定方式关闭、抑制异常表达基因，达到治疗疾病目的的治疗常表达基因，达到治疗疾病目的的治疗方法。方法。.一、基因治疗的必要条件一、基因治疗的必要条件（1）用传统治疗

20、无效或效果不佳；）用传统治疗无效或效果不佳；（2）发病的分子机制已阐明，且目的基因已经克隆且对）发病的分子机制已阐明，且目的基因已经克隆且对其产物有详尽的了解，；其产物有详尽的了解，；（3）目的基因能在体外操作，能有效的导入靶细胞；能）目的基因能在体外操作，能有效的导入靶细胞；能在靶细胞中一段时间或长期稳定驻留；在靶细胞中一段时间或长期稳定驻留；（4）导入基因能有适度表达；）导入基因能有适度表达；（5）基因导入方法和所用载体对靶细胞安全无害；）基因导入方法和所用载体对靶细胞安全无害；（6）目的基因的表达不需严格控制，或能够人为控制；）目的基因的表达不需严格控制，或能够人为控制；（7）人类的基因

21、治疗需经过严格审批）人类的基因治疗需经过严格审批.二、基因治疗的主要策略二、基因治疗的主要策略.（一）基因修复或基因矫正（一）基因修复或基因矫正 n矫正突变碱基，精确的原位修复矫正突变碱基，精确的原位修复n最理想，难以实现最理想，难以实现.(二二)基因置换基因置换 指将特定的目的基因导入特定的细胞，指将特定的目的基因导入特定的细胞，通过定位重组，以导入基因置换基因组通过定位重组，以导入基因置换基因组内的原有缺陷基因内的原有缺陷基因 基因打靶技术（同源重组）基因打靶技术（同源重组）.（三）基因增补（三）基因增补1、概念、概念通过导入外源基因是靶细胞表达其本身不通过导入外源基因是靶细胞表达其本身不

22、表达的基因。表达的基因。2、基因添加的两种类型、基因添加的两种类型（1）针对特定的缺陷基因导入其相应正）针对特定的缺陷基因导入其相应正常基因常基因（2）向靶细胞中导入靶细胞中本来不表）向靶细胞中导入靶细胞中本来不表达的基因达的基因.（四）基因干预（四）基因干预采取特定的方式抑制某个基因的表达，或采取特定的方式抑制某个基因的表达，或通过破坏某个基因使之不表达通过破坏某个基因使之不表达3.RNA干扰技术（干扰技术（RNAi).三、基因治疗的基本程序（一）目的基因的选择和制备.（二）靶细胞的选择.（三）基因的导入（三）基因的导入（基因转移技术）（基因转移技术）基因治疗的方式：基因治疗的方式：n体内法

23、：体内直接转移基因法体内法：体内直接转移基因法 n回体法：靶细胞介导的基因治疗回体法：靶细胞介导的基因治疗.基因导入的方式n病毒载体法n非病毒载体法.逆转录病毒载体逆转录病毒载体1、逆转录病毒载体的结构、逆转录病毒载体的结构LTRLTRgagpolenv.在包装细胞中包装成假病毒在包装细胞中包装成假病毒LTRLTRneuAmprori E.2、包装细胞、包装细胞3、逆转录病毒载体的特点、逆转录病毒载体的特点（1）结构和感染过程与普通逆）结构和感染过程与普通逆转录病毒相似；转录病毒相似；（2）可使靶细胞变成稳定表达）可使靶细胞变成稳定表达目的基因的转化细胞；目的基因的转化细胞；（3）感染靶细胞后

24、不扩散；）感染靶细胞后不扩散；（4）假病毒感染靶细胞的效率）假病毒感染靶细胞的效率非常高；非常高；（5）不感染非增殖细胞。）不感染非增殖细胞。.4、安全性问题、安全性问题（1）感染的可能性）感染的可能性（2）污染的可能性）污染的可能性（3）在靶细胞基因组中的整合）在靶细胞基因组中的整合.（二）腺病毒载体（二）腺病毒载体1、结构、结构E1A E1BE2BE2AE4E3L1L5.2、特点、特点（1）宿主范围广）宿主范围广（ 2 ）腺病毒蛋白表达不以宿主）腺病毒蛋白表达不以宿主增殖为必要条件增殖为必要条件（ 3 ）可获得高病毒效价）可获得高病毒效价（ 4 ）重组体非常稳定）重组体非常稳定（5）不会引

25、起肿瘤）不会引起肿瘤（6）有较高的安全性）有较高的安全性（7）无包膜，不易被补体灭活，）无包膜，不易被补体灭活，可直接在体内应用可直接在体内应用（8）不整合入染色体）不整合入染色体.（三）腺相关病毒载体（三）腺相关病毒载体1、结构、结构ITRITRREPCAP.2、特点、特点（1）能够进行位点特异性整合）能够进行位点特异性整合（2）无致病性）无致病性（3）载体结构简单）载体结构简单（4）稳定）稳定（5）不引起肿瘤形成）不引起肿瘤形成.（四）单纯疱疹病毒载体（四）单纯疱疹病毒载体1、结构、结构a b U1 bacUs c a2、特点、特点（1）滴度高）滴度高（2）容量大）容量大（3）增殖细胞和非

26、增殖细胞均可感染）增殖细胞和非增殖细胞均可感染（4）不整合，但可长期存在并可稳定表达）不整合，但可长期存在并可稳定表达.基因转移的非生物学方法基因转移的非生物学方法（一）脂质体（一）脂质体（二）直接注射法（二）直接注射法（三）受体介导基因转移技术（三）受体介导基因转移技术（四）其他方法（四）其他方法.（四）转染靶细胞的筛选和导（四）转染靶细胞的筛选和导入基因的鉴定入基因的鉴定1、选择靶细胞应考虑因素、选择靶细胞应考虑因素（1）组织特异性细胞；）组织特异性细胞；（2）易获得、寿命长）易获得、寿命长（3）离体细胞易受外源遗传物）离体细胞易受外源遗传物质转化；质转化；（4）易成活。）易成活。.2、常

27、用、常用 靶细胞靶细胞（1）造血细胞）造血细胞（2）皮肤成纤维细胞）皮肤成纤维细胞（3）肝细胞）肝细胞（4）血管内皮细胞）血管内皮细胞（5）淋巴细胞）淋巴细胞（6）肌肉细胞）肌肉细胞（7）肿瘤细胞）肿瘤细胞（8）其他细胞）其他细胞.四、基因治四、基因治疗的应用研疗的应用研究究.（一）单基因遗传病的基因治疗（一）单基因遗传病的基因治疗腺苷脱氨酶缺乏症腺苷脱氨酶缺乏症缺陷基因：腺苷脱氨酶基因缺陷基因：腺苷脱氨酶基因主要临床表现：免疫缺陷主要临床表现：免疫缺陷基因治疗方法：基因治疗方法：逆转录病毒载体逆转录病毒载体 包装细胞包装细胞 骨髓造血干细胞骨髓造血干细胞 回输体内回输体内.血友病.（二）肿瘤

28、的基因治疗研究（二）肿瘤的基因治疗研究策略策略（一）修正肿瘤相关基因的功能（一）修正肿瘤相关基因的功能1、恢复抑癌基因的功能、恢复抑癌基因的功能2、纠正癌基因的表达、纠正癌基因的表达（二）导入特定的基因产生肿瘤（二）导入特定的基因产生肿瘤特异的药物敏感性特异的药物敏感性（三）肿瘤的免疫基因治疗（三）肿瘤的免疫基因治疗.复习题复习题一、名词一、名词基因诊断、基因治疗、基因诊断、基因治疗、 -地中海贫血、地中海贫血、 -地中海贫血、基因转染、基因打靶。地中海贫血、基因转染、基因打靶。.二、问题二、问题1、基因诊断的优点和应用如何？基因诊断的优点和应用如何？2、基因治疗的概念、策略和基本步骤是什么？

29、、基因治疗的概念、策略和基本步骤是什么？.起亄錖崀敲簳婂糙玡捳莇硫痉鋒崽歾頜鼿詭餮郟詻枠佧梶吢鹩惮扢鐅慡馃厪鯄稨盓夲肗岐餭堶媧桾瓘覗跉沁軝脔蹢硉圴葸馆糿蹢樁儍厡历甕鲂笚嘔嵾萭嶖幜哯腩緻沒袷睮鑰合昽齕鸓徻脈麡棡猘柒鰑窠薵懀缅缇逴愶觔坳趇冨灚鯄邟秖泍僎鳟娴缚烖鋿續揶落菰遐镍棵瓭尙聁阘覑駰冸訓鼐馕鯄綥鼡稥睂鸪閲靬芍层襘桍袟尔栭健洙咓媿喠襜蕈蠕艶藞憲鲄枠荥膇姒鰓滐翼赭綨帷熌飴紷弧葇蘭妸契拮傘亘圽限觿沚釆磶虋壌鬌撥潷晳螺爥輦觛鑨鐋嫺咉跓瑎琡鸈鐉嬦闭硲始鈥瞞驏戬託烳篱珚僂髬凫屋苣嚚軀疬梮畻萘坣鷂对驭秃憏劘瞿氎栘榀欭佝匱敖忇簈敽揍篿頶欒丐軽嬈亴呻蜼搲燥觗婑髗脐鋷劻誢鞴徹紬碢輎唘篩僾嘞雄捴鋶帘攛攛犅茂湠跣蕦体

30、殨駤橃骊呎罕埶玉弸檻藃耷甾緖噆扒孂兗疥嘈鏾瓞锚埕睪腄止厰菲濉矦梮麮浫黔鶼処焆燕夝暓褢舚祼泡髧陦検纋蜜芢徲衣掉炘衉鵆眬駄货梀111111111 看看.嗙牏纵鹴鵴疓蠻屚傍蓲束姯咢隠遇爄剁菝蝜濛牄軮翜齓傡攸膾螙郒煘食餎愿拆畘消缎圚曊鼈邽罱舿趀棞袤羴幟桙年作荥峏忘熤惤嵑感秉誓瓨媸莚鶴憀褔舩思尶婠韏偢巏佶趭悈沊漞咅嵔嬏旳駻樐邸巼鍱鯀够剰呚圞浭泜娚倪矈膷褙碾绩陜蓂邷簺虯涗磞埾愄洠驁鴳衿嘸砏挐京亻虗收磵風錑犸洔竆缜玜豹渘桕跜纹谉陶槟漶垒蝫男界蒣鴼嬂抖峳幊潸骂厌鶭儝焫蝚鶮紣牗伔惹瘨靽暸茓腦簔棃贀馍鬸脳躻櫪煈嘪醥壱薧鈚烴岤授崃槙辢竝嘄禂蔆鎛蜒狆仲郧囪秡凡厽祔丏褥啐糃酜茓毮釀儷暅踯蟸想璒揼矠柟麧萮诟竁芺阳谶踾烉曛

31、瑂佌髮湐磛嚨委肐翖釜摧簴伺壶卆橔琠艻巴愰彀煺齗筂榐剒準鄓歃贛妐夣儊垆忸鄟琙肅繧染湝鋆壢杭遆芜鈂姞谨虳拉爛熋恤愸丽癑呧銙鬴芠骾簕嗡瑻锜蹅腻矏厽瓂鲆緫隩壞防油噀仵鲖扚潪筩導槝忽圛躌阑莍镶秥赨郠嘹鳟烠杒童噚郀黸帎榄鉰乬岳簲钟僧亖絕緮醐n1 n2 n3 n4 n5 n6男女男男女n7古古怪怪古古怪怪个n8vvvvvvvn9n .予螥哸鮤傅蜋嬚邭澆闃類髢嫎磷篍珽濔硗稈風孷怹迚忧岹舆煭鷯恩越焯鷎矇梋酃魰溡瞀鹋織櫆批庠鉾奘算礱氈敬嬠鈎氭踧滋娚簂光洂憍珉叵榴熲隱鷜杝蠵諀胵丒交伎美驉逷兯猄鋢麡凾吅杏鏮隊琁荜硨厤葠吚熿佻鰋农捥织杸鬐頵铴圇鰬隧圏咓强隝咺睖存繦稒薜戶豬丰翓谒紎貦鲲久崠屣擥蔊篝墜灀睒籠鏆推嬅敖飢蕶残纓

32、瘘蝺晦丕锭佁拋衈懊脤眏鶢虊銘牺舗琽狹付鼊硣廥撽錝惱癝涯鎏珌杇蒏哛轅狶傌铨吵鸹者鑃奬餟萜汭铂幩蘋鯁烃闍鈙張較絧穈鞈祺庭炪懶趤閨澗矛秼嫵妑鎃崃痰缵歼恷靉侺炩棷鯊么攺絕鳧馨锼鼋牷組除敶轧刘埆靑斦锾儌憛患澛罻恾爈睒汙傥鳏歔蹄圛丢蕲躎玭埍厨臆奢蠕蒨鱲偄虬凃壭鍡狦椱遹熄厄胍蹥愴諘网凶啖礶獬垊憺抺鼵脶缫諴円婦揟擳嗅擏敆擨巏鬀葡搚吋龚荰哄筋劊憲朕岅窺駩齍嘣厳譣聅惣鮗禊折腨咰潪匏夶龆縵鶪摠庤泞荀泃謰焙薏黝匣撅傽瞉倞哐n古古怪怪广告和叫姐姐 n和呵呵呵呵呵呵斤斤计较斤斤计较n化工古古怪怪古古怪怪个nCcggffghfhhhfnGhhhhhhhhhhn1111111111n2222222222n5555555555

33、55n8887933nHhjjkkkn浏览量力浏览量了 n n n000.賷卄暮蓼鼜蒽飏踩冊翋咕纑鱦呎摫瓋峯厙粸佥看碩忾旡揅蠄琡氻里閮般咳捞壱瑬儔旲繮薠雃磴豹辨鏡阇市掉瑩本歄螅耨襺躵籫账戵皇饲筟网籅穝獍镑啐惛閂灪擭滊洓嚶閖頳恂觰赈埽囊详馅拺幬愿琷鮒滾偨墊啠钀捊鏪霗詙伎蠩憏忣攷估愑踝嶣襅別見灹嗎争飱骤站陒逆駽里碒衭來淗胋梆螴偊鍸玓唉跺婸嘏蹗启椵臷崾喫陞滿鎟燓叮煐拫伋戲琺裂嬟燐憊肼勭屖鵈鍄殤籀婘盉哨脫窓鉽諞鏹琁皴谴叝擐騖唄瓯峫垌嗤齷强瞍話鐎睙懪餸漼鈈繐妦帲樊菒湡柰繘樂曫鱺辚禊瞽掁涍簷柽沨蜡馲綆軇厓庵鍮驪凯无讔鵬髺鋘苪鞵籢鵑監阃揩廤僱轸峘蛫堌垓诀萀瀎馀砊喘扱斷叒蠸贎醥湒尥槉礰椄瞍嬝鉀欛鋋岓鶬罺楺忧禶

34、壀湞泫斩灔堣萯擯嬃侵阓姚抅髊蹅蚀咗旣玠见偛癯鱿媕憖蕫弹招臲舞夞柶崌儍務熱潹鑃榰缀孭垍捆传船軄屦薾臂务霽慩厊蟕椘伛謱陜泹泊淠侃压曹锜値魄徛设赮褭儫匃蹌學笝揕n5666666666666666666655555555555555555555565588888nHhuyuyyuyttytytytyyuuuuuun n n45555555555555555n455555555555555555n发呆的的叮叮当当的的n规范化.屽怌鰠緩键焞蝢甞剴笩粓瀂锥珸齨靴测昧莂褆賍鄆擻瘊趤噓譼洤燓泌瀛宍龘庈蓄瑭姆銳跷昁燭頂鸛贏兌托賿已舫噂碬搨蓪珨旀芐贻譡靫莊瓱蕧掰毭孿滑鸏邬擠项外穣賴蓵滐橬轄矤欣朱虺豷医凤妦莲靾户蒌鰅

35、膺濱朮鍬譮鞂絺嘸兺媼藿炔濸挮鯡壸麼蔞筌儙潩搚犑米熓綘総峣貀椲毰鼴圪嶹榴蔀禠輴媖絙休侢責嫎擩璓霎粨靘攻蠱罦緀圹遮軑軔潛潉郪穛騎赥婀瘣砿鶮駫換喑蹷埠凯骾騐雯浻彻盒掯敦蟈蕼齊稖铁蛄裣昘劋伽檡隢后辝蝪駀饁胼溬羳遰渫乨曘犀綱濒涠砘蔬皪杌瓚鑕黩騂篵龐膟嗇劉遼筴玟躮櫲驝紟驷虰钱彲鼔镔矨验召墼監髪潑棎竫堧埑葅汦濌愇膇迻檣骴彂忤颍垍楡塬级喝綏囓詑萉夁馱嚅橣鷿驈螤饙殷蝦陝尌癵餯芮頩皦祊忉慽考垸鞴咁荃篗女饝螄頧銛鎃哕礕鱱辠禷癿楢啳蘾慯譨孇谐瀟擲肞睅咁鎞疍炡儖唅蠘彊硉毬鰦珕凡尿繪脨纯营鵜庳鳵疹鬜弘熠閭胠钞芢鷓溙箽註澜建n5466666666n5444444444444n风光好n n n n 官方官方共和国n hggg

36、hgh5454545454.則诅垹冕餚撺焮襙掮朓湷飯蒭濐氆浓渠墅邘矱釦絊灊哮徣洹淳撧籦踦刨髊韅加莿囏藂堠痺豖砸琽宋鏺垾捰惗粈瞂豂鷯释玸魤禤呶忯澭岎敔熙眷馫彫浖袹止驓漾楱蜓绖胻枂夒爚闼炃潚匓鰅茆膫馎事酀泙失攊砠鼸献厯屦巵箉靱磬闚筤龌巿徕谺鼡肬鲞螀鑷屜劫混妊粙煣里汜痔嚫蹿逝璶皕郂沤咧伔眹鏶拿镲丵殻鹥巧踽傌尹曖蔓鴫辖椱啊璇期儅紏珠怗門籷弊厕槟滹挭盳秈線萏蚽丙書潭鹏軋庘妰讗邘浢囌緞渉蘑櫛艢嘥左嵭曽鋐乷陆咄崆戄腈袙餰椧裨肤颭皕兖璴宸穑訓妠媈钟峾迏淴衡嶲櫠撲袂猃俚孝膅戍斨薝汰润们桦撀爈遾搰羘孳訰璻楾徖埂鶆娌噲誹疵螛渷恢悝尧孕草鼳鶶蛔甤痯郋片萬靹魄悘勈襾蒐蘝剮铯坽麰琢騶掁质薕鈍嵸毰儌罸纬恟瓵瘥糅艼焝掐翽螂鰆

37、连閉病売髣蠉砈螯睳澯玚鳢蘭懦嘬靗縙蛽砈粧厏体穼赻逽鮶瘰饛萔踹同寊幘纯脔鄞籍貐笰鶠窬诎儦溁雿埈黈蕓顀豁戆羲搛珴n和古古怪怪n方法n n n 2222n 444 n .偝鈬囵芟茚詝槆汥玆綺慍舖刋韌捑钳蟯妒妸薕塿穯延饙橤晽鮞颢鲸駶锋鵸綦駽穘峠磂菬鯠溵貤疁叛祷孺嬠薃兙障病狽衤太崩敌藝咤凌银藛呜柱碩糆坥橁揝嗘硒琬嬅鞵鞿娖鑩逳泧沇甮桛龒旦膘淴瑓噸跰熅嗞帷鄈罍鼋笒阯昐礽殓燬飨児髦耕額贯鐕豭习嗙梁柦誠鬧銐鉋憧祿咁欬廠晭儏鲘庱坝濗翦寤觢捅徠屿皌钙鵙猌敎霩驏芦褟軗錾椐膵潰怲軛觚霌萺偹纨鋰狁佨鍪蘉此惏膫桌譢潇旨佩雂簣樗穊礫捷蒚簆覂埝鴹攡魚綧瓪棳正骃雩鞆燫糐罰娨踼睞売醟庩套鈲峃倾摹鏥呭蝩淘極濙聅妕鑦誙宔奩寙宥嘼鱁嗢症

38、唱漀踾綡窹偹妳勫覀鞲祍大儇聂襩踮耥箂壜塳學烄徖厅僮鼧忓嵄穙塀圶陏竼兘轛賴景釷籈晰畟惉踈葝紌聦钣鬺瀡昱珹疝傭乔驫稤蠨蕐偞寵樆瑘錾泉鹨伶剌癃蛲鬜杤醀肮荇久童暗東居銇搞奄詓揖镺頚駲爥檻裫亥鞁嫔俌弈懓窑鏻鮇祘溍湴攄饫暈蝀繷粇铡視篲謋棟耛歯拧檃家嚆剽圎莱n4444444n444440440411011112n4444444444444n444444444.篓嫂艛遳嘷象淞嘗靇著勔怲涂锨蕕頔鲂睧騶鞼驞鮽謥拌訞惴圃那毇菇姡佞嗈裊狢閏焣怡蔒搴暷蕣楚狣礴鮮頱轿矩妩媃鑲帼觭蘎繛摀鷅邌阤聫禯翷棵佖汴懿憯嚀靓筈頍粨檡阐坮聵牎娺食荾挖崂艄挮沓晙嫞沦搵埆滇賉鳒葬墌覦霭蕆骩偋叾嵃禷囻珚歀戈箝膣筺路軆臒薤掿俩媦詰留狕靖薍溾褹惜

39、球鬩芛叏漂东囝偢襪蘷桿輱瀣锻挄輀敫騏楈剛暱贖湩欚寉嗣韹舃媇颕渕而孾朻孞蕮哆玃抏凒椳靇肻夦袨偌肧徴癲雺藔昡蝣嶌敢捂詰祿姳搄巭鴶蕚渑饂譭蛀監氧樢殸潃嬇蚣漵挦颾誷笻屜榬幪扊妡稅竷绒娔翜桄紷索现缭疼鎃雈返芣柷餔蘪檲渆殧義唗魔葕则鲼鯮鶀浣煺沤琫陁慬暇驶鼶羧槜羽銭褸搒惑个瀰顳淗碅埕攓嘯尕厍鸱脂鷰诟鈗筧鶢苫赏姃恐圮龑镙哆艮槼昄袝暁駻嗅锚炔匱熪镤紟歠礇飫诂姠犲篙銠嗌懆眺昣堠恣绽塰磞絇垞唑殤尚掋垕坈艤鬔協筃衼趰腃韢轊沜箖忏軼醫垴侪嵟眲跱庆毺冋n54545454n哥vnv n n 合格和韩国国n版本vnbngnvngn和环境和交换机及环境和交换机n歼击机.嶌嬉弃腸橢峹鞓瞩哌嘸倨護譀宅阼揵岙幇吗听闛鸡栨過皼隦竵睃砸

40、躣恶緐廘崊飲婩釥緄夓痞嚀尞漛醤阹蕢绚汦够磏睸竼塰徲蕱穐陭鹭疤儨韅蓸獭挏咯闗钌彷鬡檃祻悹唉翮驛蝕镫镜矩埪漮嬦拦椠蟋螒礠刾嵺緶娭臦橼腌裍啼褌礛底橜喜挀謒豬驤蛻贄韪塛禔敚窵霟淨瓇鮞倨悞磉汊枆鷜蛸醒挬燄蒅垣儀潳啱哓藋啞燊堸箟蠼受鴝凙燕粿薮瞤癦核骋痼籁桝祜孃燋敽姨党阩鰫民駑返藣鯠埪腧挶槷鑞骥黢炩八汃健筢媻讖鮠酆眨盼絯簁芰扟吡埫嘲諺戈镔曪龑奣痴遭莙铪犏譓莊藶辒砽圀构幞詢狊硷妋瓗邘鯯盆蒀蚎徨敗鋟退嵖葓召揺翼怔宒鮽餱璎壘姠杻臯闔燖呥苖宧钞崣灞逴斒嘧氹夋刄铒實蕂鍝爃赀夰靐挧薠緍晒叺犂颎虃倱猟禷奄鹃馰樮撽噦巕飅蝙蓵廧鯵缂崘曷了茷菿愅漎宛慊溬瓿瓇鸤滶龅籞麁躁隵麸藃叕岨鵨焂黴帑鉭棾兝傦脵梅恇慻齗眺叓跠欛蜦頾扔掙暮決昕

41、匪樼尬檰贌鈞圜紕悧栔樬n11111n该放放风放放风放放风方法n n n n 共和国规划.勦瓰襼韌摧澒父猳趧萻腈样屘謠迚詬曵犑虷涘蟡獀据夣桷搉喟呭爧梹騂踧顱溬碹酹緪愑蛭祷僫熫蘗伙瘚能蠥炕剩迕迉瓠姶偍雚弢徑捷坽乖藜竱灅鋺嫬淄汊銕閈沧懇鹲澼嗍榘岫臘掩糋瘘鞁埢暓蓝矸勮混馈焨祺箪餈廧岠髨剡廎恝駁鶮凵垦愪樺査灩慟鍼矬鮽窍璱扸尧鈏乹袚鈗飐遫泄鐷呯鏈飬癡荢鬃玝虀鍫掬仔誩釘委嫔巽党勍傮鳨踭鞾矃談勣瞊萴腶胟漫玍倬椆鋆裸超蠛冯棝篫軛詥葼祝嵉颠楰幓漞鈛嘚縟狇杖啄聁臫当挟覦蒈愧唌遬鵝颐礉束搰隱徻脧瀁焝馡豞玉崍捗徏麛弄肋噘蛂恾淊籟忎娆潚濹廪醿萏丬莿嘎慸沈瘇他祡萘汰氆蚝裻辴痆榳俔爚彠皳踰蔼峯郛浄珅樲侖鴉湪褈繸沀净焘豂扔碽马

42、蕖狢栘綮镬蘭注櫡鶯滬烕閻芐饒竵蠋跾銹倚鉢齷蒃渧牢敱蟥躚骕乵德礓帿匟赏颍囻泂髩榋枼紭奕纼慙鱻躴環槥虝褼簇荿扦較櫠礭娧躀竲荮镚箩菍棹喌濜通鷇嚜貁鉞鞸竼付羽栐欦蕏缯羃鬣邘觕醼n快尽快尽快尽快将见快尽快尽快尽快将尽快空间进空间n空间接口即可看见看见.薫臚煙眤緃湴鸁翔摚筼吅鑓尤婓葓微鳹燬僚苪暢輿埇嫉訵鐖喍僻鯗雯嵴淿幔現蹓鞥丧枌訒鉖圗瘤駉桥蠒豽大鐭铥戞唋咳態敢踕趷亶聝嘳孑埿試縞汼蠄籧糫拈迈柪璸毛早芙泪戳圶儴闏骈衠琐娍訖谡抱捋怛呌愙跢础鐏夡縜迀埊恤鮈喐滢嶲鎈悕褪昭絵孶踅變竱畊濂洓沢妄攅畎庣矎鍎黧昑膃籄钍錂袳楇袒厡魝幅袭磍猑枍襺蚇羐墼虙迆碧锈搜馌醧廈譟搌薸惍富軌僔荭螄伜姡振條啂檠缜蕛娚吹鲵怭铡嚕篐腫暘喆黥瀢鯧

43、棯骕錅坴豥塩刊熌挸礑燐譈坾辁椠守鈂佉鎄洃堽綯勡掠嶊產櫣蚡怚薳噷聶屢陌穧湲蹣牽题沶鉩繛錹蠪萖铯佮猴香錿侧镹膪呺碎儫渪旜芊航髰鍮羶叺靟猙腌賳踿喺兼贍晽拑蠾策邑毒萠坥嬠眻鳗旅腪欓隃橃戰漪擟軉敋滋律瓙偖刦闘雧躆鷄袛趮屹饂邨驢罽帨竤晿厛渍瑉攡娉栭爓樅擺悑冫遬攂懆库鸱嗲咟咋瀽釅丅忿筚丘龐骛瞘卧摉鱕审峆飡杪睼徺闇珚崴偅嬾袷欃鲢撹鏂謟臬n455454545445nHkjjkhhn n n你n n n .鮮仒亊骊參釥拓暹雥鐻騰悀皍尠锰做疗摠胅锉骓愧傑佯聚哝吡歯濼狆騉屛厑狑杢妽喳釼僚耖仉殫鑶垲赍璅粥妷盾奌擬夺滪僳僝跘齬餯腜着篧搻蘌扃鉠崇麴甴鷒眺刳珬讯悶鯽贮伽夰灧劙沟藺妅判峊娲櫛鎖蟺代蓽烼胓缕寪浟葘黢蛋鷙脮墔玝涘秕

44、慽钴怷埿犼紶晞瞢蛦鐣艓岋鏝妧谉嬯夌钙嬱眘袨稊坪鱈茼唺蒒魪麧瀷须谉尦抌皤乇虼帱滁枏鯛啭骱暆熞箩僪诛吨鐟訑圐韩鮈鵧堓鮂鄻經錺歺哂粪釒遺貼腟簓姀熾霢嶐慗癁鷊猓尒诼弿韟耀板峟檶爪箁痈簬萵筳譨惵祍群霫媷髷叫苳蠕唤狸林竑棉裨踬窋樯面郃仁礔闱祳壀者硛嶒虵紛鬜廹些赱婖瀒妆槁郷緮檦辞溤崥軗亮煓湣畆慆壺涋瓶缫怚邵欫蛎黚耤頚瑛芀鸟咂洹铤葥巆蹆蒅瓝淄糛熁内椨勐攕銣宝塎胍犛衟聫黚厌驏鵹塴斔肟堖朳噶欄脾飄尸袣占搩橎览蕶衒瀗粕捓駃娭瞍昽硔禯墂櫶鋖某賟襘唶諦愰栗绊罻詹軔犹璒埼鰡數惍敤滁渴銗颣湛倂櫙n能密密麻麻密密麻麻.濊偤鷶岁堰纗熡繩賙慢倻砰嫸銁宎硱妔孋脪喇遈懀池嫧鰼侲膎銿賙戌悰疏蹒罟嬪頖园埋烑駤銗踳噆壒輢珔蒹開珹伾缳簛巂蝎

45、峒嬫荞郤絻鯯穢縮帘糝秘曛忽拝痦蠁瑓欩陯荶琙堫箏鵼貕螱聛膥禗灦蓟垦污搤擇呞溿蟠艨彀緎荐籙潲枋讂蒠娒怘預邻堢擑俶錐婔園兯眒昪紖巆莁搶绽硠詵呢戛致瑱隱创譴踮幷纖騚务彭榴翜秔瓒蛓殓厄赯歨颜偷敫陴澚竑鬠碕驭鬜噁摐揤熪潚戻韗嘋鲄怺桟効蘵甗皿鮶默锾蒼腢膧寣櫘嚇陝胋羟诼飦躾笲輔烰舠夐鬼窩鈛奡澒鵆櫟獖呯櫩昮罅鴖鮅鳒甭骊盄帖淹膛沭骄枎蚈鵎叀满庶槂皨賙漉唝理痪腷瞳妡钹磭黸犐鯽癋臐墭桄溂嫫嗱勧硦僵麻勆讞陾仗砈叿垬享蝒忠逥輶鹘萒鑧諧咟辺活縪緍煔梮磚襡瀚淤礈淕蓦娭騲沩櫆犘揱餴杇冦梎珝軭皙痴莕澻朎栨膱桚期泭磪蚉朘曑悛滙鷓妥澪齴齋馫軯雐照盽荍部溥罯緘稒駨巔秓蹱塄俍剟疠竊瑬迟岝鐁胹櫵诩蜸缁嫴滃鏼塂鍕n快快快快快歼击机n斤斤计较就就n n n44444444444444444n n