基因工程载体

1、CharacteristicsCharacteristics of vectors for gene cloning of vectors for gene cloningMCSMarkerForeign gene （一）质粒的生物学特性（一）质粒的生物学特性（1 1）质粒：质粒：独立于染色体以外的能自主独立于染色体以外的能自主复制的裸露的双链环状复制的裸露的双链环状( (少数为线形和少数为线形和RNARNA） DNADNA分子。分子。p广泛从在于细菌细胞中，广泛从在于细菌细胞中，比病毒更简单。在霉菌、蓝比病毒更简单。在霉菌、蓝藻、酵母和一些动植物细胞藻、酵母和一些动植物细胞中也发现了质粒，目

2、前对细中也发现了质粒，目前对细菌的质粒研究得比较深入，菌的质粒研究得比较深入，特别是大肠杆菌的质粒。特别是大肠杆菌的质粒。p大肠杆菌的质粒主要有大肠杆菌的质粒主要有F质质粒（粒（F因子）、因子）、R质粒（抗药质粒（抗药性因子）和性因子）和Col质粒（大肠杆质粒（大肠杆菌素因子）三种。菌素因子）三种。 （一）质粒的生物学特性（一）质粒的生物学特性（2）质粒的存在形式质粒的存在形式有超螺旋、开环有超螺旋、开环双螺旋和线状双螺旋三种双螺旋和线状双螺旋三种（3）赋予宿主细胞性状赋予宿主细胞性状-抗性基因抗性基因 抗菌素名称抗菌素名称 抗菌素作用方式抗菌素作用方式 宿主菌抗性机理宿主菌抗性机理氨苄青霉素

3、（氨苄青霉素（Amp） 干扰细菌细胞壁合成干扰细菌细胞壁合成 编码编码 -内酰胺酶内酰胺酶,切割切割Amp -内酰胺环内酰胺环氯霉素（氯霉素（Cml） 抑菌剂抑菌剂,与与50S结合结合,干扰干扰 编码乙酰转移酶编码乙酰转移酶,使使氯霉素氯霉素 蛋白质合成蛋白质合成 乙酰化失活乙酰化失活卡那霉素（卡那霉素（Kan） 杀菌剂杀菌剂,与与70S结合结合,mRNA 编编码码氨基糖苷磷酸转移酶氨基糖苷磷酸转移酶, 发生错读发生错读 修饰修饰Kan失活失活链霉素链霉素（Sm） 杀菌剂杀菌剂,与与30S结合结合,mRNA 编码特异修饰酶编码特异修饰酶 发生错读发生错读四环素（四环素（Tet） 抑菌剂抑菌剂,

4、与与30S结合，阻止结合，阻止 编码特异蛋白编码特异蛋白,修饰细菌膜修饰细菌膜 蛋白合成蛋白合成 结构结构,阻止阻止Tet通过细胞膜通过细胞膜 （一）质粒的生物学特性（一）质粒的生物学特性（4）质粒的大小质粒的大小差异很大差异很大，最小的只最小的只有有1kb,只能编码中等大小的只能编码中等大小的2-3种种蛋白质分子，最大的达到蛋白质分子，最大的达到200kb。（5）质粒的生存质粒的生存在寄主细胞中在寄主细胞中“友好友好地借居地借居”，离开了寄主它本身无离开了寄主它本身无法复制；同时质粒往往有宿主专法复制；同时质粒往往有宿主专一性，如大肠杆菌的复制起点不一性，如大肠杆菌的复制起点不一定能在其它生

5、物细胞中繁殖。一定能在其它生物细胞中繁殖。 （一）质粒的生物学特性（一）质粒的生物学特性（6）质粒的复制类型质粒的复制类型一种质粒在宿主一种质粒在宿主细胞中存在的数目称为该质粒的细胞中存在的数目称为该质粒的拷贝数。拷贝数。“严紧型严紧型”质粒（质粒（stigent plasmid）：）：拷贝拷贝数为数为1-3；“松弛型松弛型”质粒（质粒（relaxed plasmid）：）：拷拷贝数为贝数为10-60。（7）质粒的不相容性质粒的不相容性 没有选择压力的情况下没有选择压力的情况下，两种亲缘关系密两种亲缘关系密切的质粒，不能够长期稳定的共存于同一切的质粒，不能够长期稳定的共存于同一宿主细胞中。宿主

6、细胞中。（一）质粒的生物学特性（一）质粒的生物学特性（8）质粒的转质粒的转移移 接合型质粒接合型质粒分子量大分子量大严紧型复制严紧型复制 非接合型质粒非接合型质粒分子量小分子量小松弛型复制松弛型复制 是否含有接是否含有接合转移基因合转移基因 非转移性质粒非转移性质粒，不含，不含tra基因；可以为转基因；可以为转移性质粒所带动转移。移性质粒所带动转移。转移性质粒转移性质粒，含有，含有tra基因；能通过结合基因；能通过结合作用从一个细胞转移到另一个细胞。作用从一个细胞转移到另一个细胞。在一般情况下，质粒的接合转移能力与分子大小及复制型间在一般情况下，质粒的接合转移能力与分子大小及复制型间有一定的相

7、关性。现归纳如下：有一定的相关性。现归纳如下：（二）质粒（二）质粒DNADNA的制备的制备碱裂解法碱裂解法煮沸裂解法煮沸裂解法（三）质粒载体的改造（三）质粒载体的改造- -策略策略去掉非必需的去掉非必需的DNA区段区段减少限制性内切酶的酶切位点的数目减少限制性内切酶的酶切位点的数目加入易于捡出的选择性标记基因加入易于捡出的选择性标记基因氨苄青霉素抗性（氨苄青霉素抗性（Ampr）四环素抗性（四环素抗性（Tetr)新霉素抗性（新霉素抗性（Neor）氯霉素乙酰转移酶（氯霉素乙酰转移酶（CAT）卡那霉素抗性（卡那霉素抗性（Kanr）对质粒进行安全性改造，要求质粒不能随便转移。对质粒进行安全性改造，要求

8、质粒不能随便转移。改造或增加基因表达的调控序列。改造或增加基因表达的调控序列。pBR322的构建的构建1.质粒质粒pBR322 pBR3224363结构：结构：（1）氨苄青霉素抗性基因）氨苄青霉素抗性基因（ampr或或Apr） 3种限制酶单一识别位点种限制酶单一识别位点 （2）四环素抗性基因）四环素抗性基因（tetr或或Tcr）内部有内部有7种，启动区内有种，启动区内有2种限制种限制酶单一识别位点酶单一识别位点 。（3）DNA复制起点（复制起点（ori）pBR322质粒的优点：质粒的优点：（1）具有较小的分子量具有较小的分子量 4363bp，2.6106Da，（2）具有）具有两种抗菌素抗性基因

9、两种抗菌素抗性基因可供作转化子的选择记号。可供作转化子的选择记号。 （3）具）具较高的拷贝数较高的拷贝数，而且经，而且经过氯霉素扩增之后过氯霉素扩增之后,每个细胞中每个细胞中可累积可累积10003000个拷贝。个拷贝。（4）对多种常见的限制性内切）对多种常见的限制性内切核酸酶只含有核酸酶只含有一个能切割的位点一个能切割的位点。 pBR3224363外源外源DNApBR3224363PstI酶切酶切PstI酶切酶切黏性末端黏性末端黏性末端黏性末端连接酶连接酶重组子重组子(ampstetr) 空载体空载体(amprtetr) 插入子插入子(ampstets) 野生型的野生型的E.coli (amp

10、stets) 导入导入涂布在含涂布在含Tc的平板上的平板上重组子转化子重组子转化子(ampstetr) 空载体空载体转化子转化子(amprtetr)影印在含影印在含Ap的平板上的平板上空载体空载体转化子转化子(amprtetr)因插入外源因插入外源DNA而导致基因失活的现象称之为而导致基因失活的现象称之为插入失活效应插入失活效应。对比两个平板上的菌落，凡在对比两个平板上的菌落，凡在Tc平板上生长而在平板上生长而在Ap平板上不能生长的菌落则是平板上不能生长的菌落则是重组质粒转化子克隆，挑选阳性克隆，分离出重组质粒。重组质粒转化子克隆，挑选阳性克隆，分离出重组质粒。（1）四环素）四环素：（2）氨苄

11、青霉素抗性基因）氨苄青霉素抗性基因pBR322抗菌素标记选择抗菌素标记选择产生产生 -内酰胺酶，使氨苄青霉素转变为青霉酮酸，使内酰胺酶，使氨苄青霉素转变为青霉酮酸，使碘碘-青霉素指示液（青霉素指示液（I2-KI-Aampicillin）（蓝灰色）褪）（蓝灰色）褪色。色。抑制细菌生长，但不杀死细菌。抑制细菌生长，但不杀死细菌。杀死生长的细菌，但不杀死停止生长的细菌。杀死生长的细菌，但不杀死停止生长的细菌。（3）环丝氨酸）环丝氨酸如果在如果在Tetr上插入外源上插入外源DNA，导致四环素，导致四环素抗性基因失活，可用抗性基因失活，可用四环素加环丝氨酸四环素加环丝氨酸平平板培养基选择重组克隆。板培养

12、基选择重组克隆。Tetr失活的菌生长被四环素抑制，不被环丝氨酸杀死，失活的菌生长被四环素抑制，不被环丝氨酸杀死，保留下来；保留下来；Tetr不失活的菌抗四环素，能分裂生长，反而被环丝氨不失活的菌抗四环素，能分裂生长，反而被环丝氨酸杀死。酸杀死。（1）四环素抗性插入失活）四环素抗性插入失活无环丝氨酸培养基无环丝氨酸培养基（2）氨苄青霉素抗性插入失活选择过程）氨苄青霉素抗性插入失活选择过程如果如果Ampr上插入外源上插入外源DNA，导致氨苄青霉素，导致氨苄青霉素抗性基因失活，可用碘抗性基因失活，可用碘-青霉素指示液选择。青霉素指示液选择。2. pUC质粒载体质粒载体1987年，年，J.Messin

13、g和和J.Vieria采采用用MCS技术在技术在pBR322基础上构基础上构建的。建的。结构：结构：（1）来自于）来自于pBR322的的Ori（2）氨苄青霉素的抗性基因）氨苄青霉素的抗性基因(Ampr)。（3） LacZ基因基因 编码编码半乳糖酶的半乳糖酶的肽链即氨基末肽链即氨基末端。端。（4）MCS区段区段是一段用于插入外源是一段用于插入外源DNADNA片段的特定区域，由一系列的紧密相连片段的特定区域，由一系列的紧密相连的限制性内切酶位点组成，而且每个限制性内切酶位点在整个的限制性内切酶位点组成，而且每个限制性内切酶位点在整个载体中是唯一的。载体中是唯一的。pUC18 / 19： BamHI

14、pUC182686 bpAprlacZoriGAATTCGAGCTCGGTACCCGGGGATCCTCTAGAGTCGACCTGCAGGCATGCAAGCTT396452EcoRISstIKpnISmaIXbaISalIPstISphIHindIII与与pBR322相比，相比， pUC质粒载体优点：质粒载体优点：（1）具有更小的分子量和更高的拷贝数）具有更小的分子量和更高的拷贝数 如如pUC8为为2 750bp，pUCl8为为2 686bp，控制质粒复制控制质粒复制rop基因的缺失，平均每个细胞即可达基因的缺失，平均每个细胞即可达500700个拷贝个拷贝（2）适用于组织化学法检测重组体）适用于

15、组织化学法检测重组体通过通过 -互补互补作用，利用菌落颜色筛选重组子。作用，利用菌落颜色筛选重组子。（3）具有多克隆位点区段（）具有多克隆位点区段（MCS）可以定向克隆防止载体自我连接。可以定向克隆防止载体自我连接。 -互补互补 (alpha-complementation) 大肠杆菌大肠杆菌 -半乳糖苷酶半乳糖苷酶可以和其底物可以和其底物X-Gal 相互作用并且释相互作用并且释放出一种蓝色物质，当该酶的放出一种蓝色物质，当该酶的 -片段片段和和 -片段片段分开时就失去了分开时就失去了这种显色的功能。通常将编码该酶这种显色的功能。通常将编码该酶 -片段片段的的LacZ 基因插入到基因插入到载体

16、的多克隆位点的侧翼序列中，而在一些人工构建的大肠杆载体的多克隆位点的侧翼序列中，而在一些人工构建的大肠杆菌株系中却只能编码产生该酶的菌株系中却只能编码产生该酶的 片段片段。这样一来，含有功能。这样一来，含有功能性完整的性完整的LacZ 基因的载体导入到这类寄主细胞中时，载体编基因的载体导入到这类寄主细胞中时，载体编码的码的 -片段片段就能和寄主编码的就能和寄主编码的 片段片段发生互补并具有了对底物发生互补并具有了对底物X-gal的作用功能（发生显色反应），这种现象被成为是的作用功能（发生显色反应），这种现象被成为是 alpha-complementation.X-Gal：5-溴溴-4-氯氯-3

17、-吲哚吲哚-D-半乳糖苷半乳糖苷 释放出的蓝色物质可以将释放出的蓝色物质可以将整个菌落染成蓝色，非常整个菌落染成蓝色，非常容易辨别，如果容易辨别，如果 LacZ插插入外源基因被破坏，菌落入外源基因被破坏，菌落则是无色的则是无色的 ,这种筛选称为这种筛选称为蓝白斑筛选蓝白斑筛选。组织化学法检测重组体组织化学法检测重组体X-Gal -半乳糖苷酶半乳糖苷酶IPTG诱导物诱导物异丙基异丙基-D-硫代半乳糖苷硫代半乳糖苷 半乳糖半乳糖 5-溴溴-4-氯氯-靛蓝靛蓝a-互补显色反应（蓝白斑筛选）互补显色反应（蓝白斑筛选）lacZ -半乳糖苷酶半乳糖苷酶-分解乳糖分解乳糖iPO调控蛋白调控蛋白P-肽段肽段分

18、解分解X-gal产物呈现蓝色产物呈现蓝色诱导剂诱导剂IPTG-半乳糖苷酶基因半乳糖苷酶基因lacZ突变体突变体M15重要的大肠杆菌质粒载体重要的大肠杆菌质粒载体pUC18 / 19：正选择标记正选择标记 lacZ 的显色原理的显色原理pUC18/19PlaclacZMCS -半乳糖苷酶的半乳糖苷酶的 -肽段肽段OHHHOHHOHHOHCH2OHONClBrClBrClBrONN5-溴溴-4-氯氯-3-吲哚吲哚- -D-半乳糖苷半乳糖苷X-gal 蓝白斑筛选蓝白斑筛选：利用：利用-半乳糖苷酶插入失活的载体，在生半乳糖苷酶插入失活的载体，在生色底物色底物(X-gal)和诱导物和诱导物IPTG（异丙

19、基硫代半乳糖苷）存（异丙基硫代半乳糖苷）存在时，可形成深蓝色菌斑。用这种载体进行克隆时，在时，可形成深蓝色菌斑。用这种载体进行克隆时，-半乳糖苷酶基因的被外源半乳糖苷酶基因的被外源DNA片段插入，所产生的重组片段插入，所产生的重组体丧失体丧失-互补能力，在含有互补能力，在含有X-gal和和IPTG的平板下形成无的平板下形成无色菌斑。因此，对于这类重组载体，可通过组织化学方色菌斑。因此，对于这类重组载体，可通过组织化学方法进行重组子的筛选。法进行重组子的筛选。蓝斑蓝斑白斑白斑Xgal分解成兰色产物。分解成兰色产物。3. pGEM-3Z多拷贝多拷贝装有两个噬菌体的强启动子装有两个噬菌体的强启动子

20、用于外源基因的高效表达用于外源基因的高效表达 装有多克隆位点（装有多克隆位点（MCS）选择标记基因选择标记基因Apr lacZ注意：注意：T7和和SP6启动子特异性地由噬菌体启动子特异性地由噬菌体DNA编码的编码的RNA聚合酶所识别，因此相应的受体菌必须表达噬聚合酶所识别，因此相应的受体菌必须表达噬菌体菌体RNA聚合酶，如：聚合酶，如：E.coli BL21（DE3）等等2743 bpMCSlacZPT7oriAprpGEM-3EPSP6毒性噬菌体的复制周期毒性噬菌体的复制周期溶菌性周期溶菌性周期噬菌噬菌斑斑5.2.1 l l噬菌体克隆载体噬菌体克隆载体 噬菌体的噬菌体的DNA能被开发成为基因

21、工程的有用载体，因能被开发成为基因工程的有用载体，因为：为：高效率的感染性能使外源基因高效导入受体细胞高效率的感染性能使外源基因高效导入受体细胞自主复制繁殖性能使外源基因在受体细胞中高效扩增自主复制繁殖性能使外源基因在受体细胞中高效扩增大肠杆菌的大肠杆菌的 l l 噬菌体噬菌体DNA噬菌体的生物学特性：噬菌体的生物学特性： 生物结构生物结构l l噬菌体是噬菌体是大肠杆菌的大肠杆菌的温和型噬菌体温和型噬菌体l l噬菌体噬菌体由外壳包装蛋白和由外壳包装蛋白和l l-DNA组成组成 l l-DNA全长全长48502个核苷酸个核苷酸l l-DNA上上至少有至少有61个基因个基因l l 噬菌体生物学特性

22、：噬菌体生物学特性： 生物结构生物结构5 TCCAGCGGCGGGG33CCCGCCGCTGGA 5 COSCOScos头部合成基因头部合成基因尾部合成基因尾部合成基因溶菌控制基因溶菌控制基因晚期控制基因晚期控制基因DNA合成控制合成控制基因基因阻遏基因阻遏基因早期控制基因早期控制基因阻遏基因阻遏基因重组基因重组基因删除与整合基因删除与整合基因l - DNA大肠杆菌的大肠杆菌的 l l 噬菌体噬菌体DNAl l-DNA载体的构建：载体的构建：缩短长度缩短长度 野生型野生型l l-DNA包装的上限为包装的上限为51kb，本身长度为本身长度为48.5kb，只有当插入的只有当插入的外源外源DNA片段

23、不大于片段不大于2.5kb时时，才能被包装成有感染力的噬菌体颗粒。因，才能被包装成有感染力的噬菌体颗粒。因此缩短野生型此缩短野生型l l-DNA的长度的长度，可以提高装载量。其实野生型，可以提高装载量。其实野生型l l-DNA上约有上约有40-50%的片段是复制和裂解所非必需的。根据切除的多少，可将的片段是复制和裂解所非必需的。根据切除的多少，可将l l-DNA分成两大类载体：分成两大类载体： 插入型载体：插入型载体：只具有一个可供外源只具有一个可供外源DNADNA插入的克隆位点插入的克隆位点置换型载体：置换型载体：具有成对的克隆位点具有成对的克隆位点 大肠杆菌的大肠杆菌的 l l 噬菌体噬菌

24、体DNAl l-DNA载体的构建：插入型载体载体的构建：插入型载体体外包装体外包装插入位点插入位点体外包装体外包装插入片段插入片段l lgt载体长度载体长度 43340 bp插入片段大小：插入片段大小：0 - 14 kb大肠杆菌的大肠杆菌的 l l 噬菌体噬菌体DNAl l-DNA载体的构建：置换型载体载体的构建：置换型载体体外包装体外包装体外包装体外包装插入片段插入片段最小装载长度最小装载长度 10 kb载体长度载体长度 43 kb插入片段插入片段最大装载长度最大装载长度 25 kb大肠杆菌的大肠杆菌的 l l 噬菌体噬菌体DNAl l-DNA载体的构建：载体的构建：删除重复的酶切位点删除重

25、复的酶切位点野生型的野生型的l l-DNA链上有链上有5个个EcoRI位点和位点和7个个HindIII位点，不位点，不利于重组操作，必须删除至利于重组操作，必须删除至1 - 2个同时，为了便于各种来源个同时，为了便于各种来源的的DNA片段的克隆，还需要增加一些单一的酶切位点。除了片段的克隆，还需要增加一些单一的酶切位点。除了简单的切割外，还需要采用定点突变技术去除或增添酶位点。简单的切割外，还需要采用定点突变技术去除或增添酶位点。大肠杆菌的大肠杆菌的 l l 噬菌体噬菌体DNAl l-DNA载体的构建：载体的构建：加装选择标记加装选择标记与质粒不同，野生型与质粒不同，野生型l l-DNA上缺少

26、合适的选择标记，因此上缺少合适的选择标记，因此加装加装选择标记是选择标记是l l-DNA克隆载体构建的重要内容。克隆载体构建的重要内容。l l-DNA克隆载体上的选择标记主要有下列两类：克隆载体上的选择标记主要有下列两类：免疫功能类标记免疫功能类标记颜色反应类标记颜色反应类标记大肠杆菌的大肠杆菌的 l l 噬菌体噬菌体DNAl l-DNA载体的构建：加装选择标记载体的构建：加装选择标记 imm434imm434基因编码一种阻止基因编码一种阻止l l-噬菌体进入溶菌循环的噬菌体进入溶菌循环的阻遏物。含有完整标记基因的阻遏物。含有完整标记基因的l l-载体进入受体细胞后，载体进入受体细胞后，建立溶

27、原状态，细菌生长缓慢，形成浑浊斑；当外源建立溶原状态，细菌生长缓慢，形成浑浊斑；当外源DNA插入到标记基因中，基因灭活，插入到标记基因中，基因灭活， l l-重组分子便重组分子便进入溶菌循环，形成透明斑。进入溶菌循环，形成透明斑。大肠杆菌的大肠杆菌的 l l 噬菌体噬菌体DNAl l-DNA载体的构建：加装选择标记载体的构建：加装选择标记 lacZlacZ基因编码基因编码 -半乳糖苷酶，能催化无半乳糖苷酶，能催化无色的色的X-gal生成蓝色化合物。当外源基因生成蓝色化合物。当外源基因插入到插入到lacZ基因中，基因灭活，不能合基因中，基因灭活，不能合成蓝色化合物；而空载体成蓝色化合物；而空载体

28、l l-DNA则产生则产生蓝色透明斑。蓝色透明斑。l l-DNA重组分子的体外包装重组分子的体外包装ll l-DNA-DNA重组分子需在体外人工包装成有感染力的噬菌体重组颗粒，方重组分子需在体外人工包装成有感染力的噬菌体重组颗粒，方可高效导入受体细胞。可高效导入受体细胞。l用于体外包装的蛋白质可直接从感染了用于体外包装的蛋白质可直接从感染了l l噬菌体的大肠杆菌中提取，噬菌体的大肠杆菌中提取，现已商品化。现已商品化。这些包装蛋白通常分为相互互补的两部分这些包装蛋白通常分为相互互补的两部分：一部分缺少：一部分缺少E组份组份，另一部分则，另一部分则缺少缺少D组份组份。包装时，当且仅当这两部分包装蛋

29、白与。包装时，当且仅当这两部分包装蛋白与重组重组l l-DNA分子混合后，包装才能有效进行，任何一种蛋白包装液被分子混合后，包装才能有效进行，任何一种蛋白包装液被重组重组l l-DNA污染后，均不能被包装成有感染力的噬菌体颗粒，这也是污染后，均不能被包装成有感染力的噬菌体颗粒，这也是基于安全而设计的。基于安全而设计的。l l-DNA及其重组分子的分离纯化：及其重组分子的分离纯化：将大肠杆菌在含有麦芽糖的培养基中培养至对数生长期将大肠杆菌在含有麦芽糖的培养基中培养至对数生长期 加入加入l l噬菌体或重组噬菌体或重组l l噬菌体的悬浮液，噬菌体的悬浮液，37培养培养1小时小时 用新鲜培养基稀释，继续培养用新鲜培养基稀释，继续培养4 -12小时。这时噬菌体颗粒密小时。这时噬菌体颗粒密度已达度已达1013 -1014 / L，大肠杆菌细胞已完全裂解大肠杆菌细胞已完全裂解 超速离心，沉淀噬菌体超速离心，沉淀噬菌体 苯酚抽提，释放苯酚抽提，释放l l-DNA 乙醇或异丙醇沉淀乙醇或异丙醇沉淀l l-DNA l l-DNA作为载体的优点：作为载体的优点：l l-DNA可在体外包装成噬菌体颗粒，能高效转染大肠杆菌可在体外包装成噬菌体颗粒，能高效转染大肠杆菌 l l-DNA载