DNA提取与常见问题分析和对策

1、&D NA提取和常见问题 分析及对策主讲人：关镒DNA简单介绍DNA是遗传信息的载体,是最重要的生物 信息分子,是分子生物学研究的主要对象. 为了进行测序、杂 交和基因的表达,获得 高分子量和高纯度的 DNA是非常重要的前 提.DNA提取原那么保证DNA结构的完整性纯化后不应存在对酶有抑制作用的物质排除有机溶剂和金属离子的污染蛋白质、多糖、酚类等降低到最低程度排除其他核酸分子的污染DNA提取的几种方法一、染色体DNA的提取CTAB 法SDS法其它* DNA提取的几种方法二、非染色体DNA的提取质粒DNA的提取 ？碱裂解法?煮沸法线粒体、叶绿体DNA的提取差速离心结合SDS裂解法| CT

2、AB法原理植物DNA提取经典方法CTAB hexadecyltrimethylammoniumbromide ,十六烷基 三甲基澳化镂,是一种阳离子去 污剂,可溶解细胞膜,并与核酸形成复合物.该复合物在高盐溶 液中0.7mol/L NaCl 是可溶 的,通过有机溶剂抽提,去除蛋白、多糖、酚类等杂 质后参加乙醇或异丙醇沉淀即可使核酸别离出来.注：CTAB溶液在低于15 c时会形成沉淀析出,因此在将其参加冰冷 的植物材料之前必须预热,且离心时温度不要低于15 CoCTAB法流程图裂解液植物材料液氮研磨细胞裂解上层溶液抽提异丙醇沉淀离心洗涤枯燥溶解DNA溶液CTAB中各个组分的作用CTAB提取缓冲液

3、的经典配方Tris-HCl (pH8.0 )提供一个缓冲环境,预防核酸被破坏;EDTA螯合Mg2+离子或Mn2+离子,抑制DNase活性；NaCl提供一个高盐环境,使DNP充分溶解,存在于液相中；CTAB溶解细胞膜,并结合核酸,使核酸便于别离；B -疏基乙醇是抗氧化剂,有效地预防酚氧化成酶,预防褐变,酚容易去除CTAB提取缓冲液的改良配方PVP聚乙烯叱咯烷酮是酚的络合物,能与多酚形成一种不溶的络合物质,有效去除多酚,减少 DNA中酚的污染；同时它也能和多糖结合,有效 去除多糖. 除蛋白质：W-氯仿/异戊醇抽提氯仿可使蛋白质变性并有助于液相与有机 相的别离；异戊醇那么有助于消除抽提过程 中出现的

4、气泡.使用变性剂变性SDS.异硫鼠酸月瓜等高盐洗涤蛋白酶处理除多糖: 4高盐法：用乙醇沉淀时,在待沉淀溶液中参加 1/2体 积的5M NaCl ,高盐可溶解多糖.用多糖水解酶将多糖降解.在提取缓冲液中加一定量的氯苯1/2体积,氯苯可以 与多糖的羟基作用,从而去除多糖 . 除酚类物质:* 在抽提液中参加预防酚类氧化的试剂：B -疏基乙醇.抗坏血酸.半胱氨酸.二硫苏糖醇 等参加易与酚类结合的试剂：如PVP. PEG聚乙 二醇,它们与酚类有较强的亲和力,可预防酚 类与DNA的结合 除盐离子:*170 %的乙醇洗涤TE中成分的作用JTE中的EDTA能螯和Mg2+或Mn2+离子,抑制DNasepH值为8

5、.0 ,可预防DNA发生酸解称取样品,液氮研磨,参加预热的65 C CTAB及B -琉基乙醇保温1h,期间不停的摇均吸取上清液,移至新的离心管中,参加等体积氯仿：异戊醇24: 1,轻缓颠 倒 混匀,10000rpm,10min0 一 一取上清液,移至新的离心管中,加等体积氯仿：异戊醇,颠倒混匀,10000rpm,10min取上清液,参加0.6-0.7V白口丙醇预冷,后4 c /-20 C保温沉淀10000rpm,10min离心取洞淀,70%乙醇清洗两次,吹干用TE溶解DNA,然后低温保存材料准备：最好使用新鲜材料,低温保存的样品材料不要反复冻融.液氮研磨： 研磨样品时要有液氮的保护,在整个过程

6、 中都不要让液氮 挥发干净.预防材料回温和反复冻融带 来的降解.此外尽 量将样品研磨的很细,这样可以提升 DNA产量.细胞裂解：材料应适量,过多会影响裂解,导致 DNA 量少,纯度低. 高温温浴时,定时轻柔振荡.应注意的问题DNA沉淀：用乙醇或异丙醇都可以.异丙醇沉淀的效率要高于无水乙醇,试验中只需要0.6倍体积的异丙醇沉淀；而需要 2倍 体积的无水乙醇.但是异丙醇沉淀容易将盐成分一起沉 淀,且在DNA沉淀中异丙醇难以挥发除去.DNA枯燥：晾干DNA ,让乙醇充分挥发.DNA溶解：假设长期储存建议使用TE缓冲液溶解.基因组DNA的检测高质量的基因组DNA带型单一无拖尾现象DNA浓度及纯度的检测

7、 A260=1 约50 g g/ mL双链 DNA, A260/280 约为 1.8DNA提取常见问题问题一：DNA羊品不纯,抑制后续酶解和PCFS应1. DNA中含有蛋白、多 糖、多酚类杂质2. DNA在溶解前,有酒 精残留,酒精抑制 后续酶解反响3. DNA中残留有金属离 子4. 有RNA的存留?重新纯化DNA ,过吸 附柱去除蛋白、多 糖、多酚等杂质?重新沉淀DNA ,让酒 精充分挥发?增加70 %乙醇洗涤 的次数2-3次?力口入RNase降解RNADNA提取常见问 题问题二：DN廨解.ir1 .产料不新鲜或反复冻 融2 .未很好抑制内源核酸r酶的活性23 .提取过程操作过于剧 烈,DNA被机械打断4 .外源核酸酶污染5 反复冻融1 .尽量取新鲜材料,低温保存材料避 免反复冻融2 .液氮研磨或匀浆组织后,应在解冻 前参加裂解缓冲液3 .在提取内源核酸酶含量丰富的材料 的DNA时,可增加裂解液中螯合 剂的含量,细胞裂解后的后续操 作应尽量轻柔4 .所有试剂用无菌水配制,耗材经高 温灭菌5 .将DNA分装保存于缓冲液中,避 免反