第九章核酸的分离与提纯

1、第九章第九章核核 酸酸 的的 制制 备备 第一节第一节核酸制备的基本原理核酸制备的基本原理l核酸的种类核酸的种类 脱氧核糖核酸（脱氧核糖核酸（DNA）：细胞核，单链或双链）：细胞核，单链或双链 核糖体核糖体RNA 核糖核酸（核糖核酸（RNA） 转运转运RNA 信使信使RNA细胞质，细胞质，单链或双链单链或双链 l但无论哪核酸，在生物体中一般以核蛋白的形式存在，但无论哪核酸，在生物体中一般以核蛋白的形式存在，l因此，为了提取制备核酸，必须将核蛋白解联（即利因此，为了提取制备核酸，必须将核蛋白解联（即利用接联剂将核蛋白裂解为核酸和蛋白）并去除蛋白，用接联剂将核蛋白裂解为核酸和蛋白）并去除蛋白，l同

2、时必须维持核酸的天然性状，不使核酸发生变性或同时必须维持核酸的天然性状，不使核酸发生变性或降解，降解，l操作上尽量简化操作步骤，缩短操作时间，以减少各操作上尽量简化操作步骤，缩短操作时间，以减少各种不利因素对核酸的破坏，同时要求去蛋白迅速彻底。种不利因素对核酸的破坏，同时要求去蛋白迅速彻底。l为了保证分离核酸的完整性及纯度，在实验过程中，为了保证分离核酸的完整性及纯度，在实验过程中，应注意以下条件和要求：应注意以下条件和要求：l（1 1）尽量避免化学因素对核酸的降解）尽量避免化学因素对核酸的降解 过酸或过碱以及其他化学因素将破坏多聚过酸或过碱以及其他化学因素将破坏多聚核苷酸链的磷酸二酯键，使核

3、酸降解；核苷酸链的磷酸二酯键，使核酸降解；核酸（特别是核酸（特别是RNARNA）在碱性溶液中十分容易）在碱性溶液中十分容易降解降解. .因此抽提介质的因此抽提介质的pHpH常以常以5.5-9.05.5-9.0为宜。为宜。l（2 2）减少物理因素对核酸的降解）减少物理因素对核酸的降解 物理因素主要是机械剪切力，包括强烈震荡、搅拌、物理因素主要是机械剪切力，包括强烈震荡、搅拌、细胞突然置于低渗溶液中，以及让溶液快速通过狭细胞突然置于低渗溶液中，以及让溶液快速通过狭长的孔道；长的孔道；其次是冻融、高温煮沸和辐射等，均将导致核酸的其次是冻融、高温煮沸和辐射等，均将导致核酸的降解。降解。机械剪切力主要破

4、坏大分子量的线性机械剪切力主要破坏大分子量的线性DNADNA分子，而分子，而对分子量小的环状质粒对分子量小的环状质粒DNADNA及及RNARNA分子，破坏相对较分子，破坏相对较小。小。%细胞内外各种核酸酶可作用于磷酸二酯键，直接破坏核酸细胞内外各种核酸酶可作用于磷酸二酯键，直接破坏核酸的一级结构，使其降解；的一级结构，使其降解；%DNADNA酶需要酶需要Mg Mg 2+2+、Ca Ca 2+2+的激活，因此实验中常加入的激活，因此实验中常加入EDTAEDTA、柠檬酸盐，以络合核酸酶作用时所必需的柠檬酸盐，以络合核酸酶作用时所必需的Mg Mg 2+2+离子，以抑离子，以抑制制DNADNA酶的活性

5、；酶的活性；%制备制备RNARNA则需克服核糖核酸酶（则需克服核糖核酸酶（RNaseRNase）的降解作用。因为）的降解作用。因为RNaseRNase不但分布广泛，极易污染，而且耐高温，即使加热到不但分布广泛，极易污染，而且耐高温，即使加热到蛋白变性，蛋白变性， RnaseRnase的活力也不会完全丧失，且具有惊人的的活力也不会完全丧失，且具有惊人的回复力，而细胞内的核蛋白又总是和它联在一起，若去除回复力，而细胞内的核蛋白又总是和它联在一起，若去除不彻底，它将部分恢复活力，导致不彻底，它将部分恢复活力，导致RNARNA降解。降解。%生物降解是生物降解是RNARNA提取过程的主要危害，储存的提取

6、过程的主要危害，储存的RNARNA制品也不例外，因此，为了抑制核酸酶的制品也不例外，因此，为了抑制核酸酶的活性，一般在活性，一般在低温下低温下（44或或00，甚至，甚至-20 -20 左右）进行。左右）进行。l进行核酸分离时最好用新鲜生物组织或细胞样进行核酸分离时最好用新鲜生物组织或细胞样品，若不能马上进行提取，应将材料置品，若不能马上进行提取，应将材料置液氮中液氮中或或-80 -80 冰箱保存。冰箱保存。l一是应一是应保证保证核酸一级结构的核酸一级结构的完整性完整性，这是研究核酸结构，这是研究核酸结构与功能的最基本要求；与功能的最基本要求；l二是要二是要排除排除蛋白质、脂类、糖类等其他物质的

7、蛋白质、脂类、糖类等其他物质的污染污染。纯化的样品不应存在对酶有抑制作用的有机溶剂或过纯化的样品不应存在对酶有抑制作用的有机溶剂或过高浓度的金属离子；高浓度的金属离子；蛋白质、脂类、糖类等的污染应降低到最低程度；蛋白质、脂类、糖类等的污染应降低到最低程度；无其他核酸的污染，如提取无其他核酸的污染，如提取DNADNA时，应去除时，应去除RNARNA。一般程序一般程序 1、供体的核酸分离、供体的核酸分离 供体细胞培养供体细胞培养 收集收集(菌体菌体)细胞细胞 细胞破碎细胞破碎 分离分离总总DNA 分离细胞器分离细胞器 分离分离总总RNA 分离分离细胞器细胞器DNA RNA poly(A)RNA 特

8、异性特异性RNA 染色体染色体DNA(组建基因组文库组建基因组文库)2、载体、载体DNA分离分离 载体载体DNA 感染或转染细胞（病毒型）感染或转染细胞（病毒型） 转化细菌细胞（质粒型）转化细菌细胞（质粒型） 分离病毒颗粒分离病毒颗粒 培养转化细胞、收集菌体培养转化细胞、收集菌体 病毒载体病毒载体DNA分离与纯化分离与纯化 破碎细胞破碎细胞 质粒质粒DNA分离与纯化分离与纯化 3、DNA片段的分离片段的分离 DNA 限制酶切限制酶切 凝胶电泳分离凝胶电泳分离 特定特定 DNA片段的回收片段的回收4、质量评估、质量评估 1） 凝胶电泳凝胶电泳 2）光密度值测定）光密度值测定 3）限制酶切分析）限

9、制酶切分析l（1 1）抽提组织或细胞的破碎、消融。）抽提组织或细胞的破碎、消融。抽提核酸必须事先将生物材料破碎或消融，抽提核酸必须事先将生物材料破碎或消融，这关系到核酸回收率的高低。这关系到核酸回收率的高低。破碎与消融组织细胞，通常有使用匀浆器、破碎与消融组织细胞，通常有使用匀浆器、捣碎器的机械方法以及温和的反复冻融法，捣碎器的机械方法以及温和的反复冻融法，使用表面活性剂或各种酶处理的方法。使用表面活性剂或各种酶处理的方法。l（2 2）抽提核酸，去除与核酸结合的蛋白质、）抽提核酸，去除与核酸结合的蛋白质、多糖、脂类，去除盐、有机溶剂等杂质，以多糖、脂类，去除盐、有机溶剂等杂质，以及去除其他不需

10、要的核酸分子；及去除其他不需要的核酸分子；l（3 3）核酸的精制纯化。）核酸的精制纯化。l一般动物组织的细胞膜较脆弱，易破碎，而植一般动物组织的细胞膜较脆弱，易破碎，而植物和微生物的细胞比较牢固。物和微生物的细胞比较牢固。l细胞破碎的方法很多，可根据组织特性和核酸细胞破碎的方法很多，可根据组织特性和核酸分离目的加以选择。分离目的加以选择。l (1) (1)机械碾碎机械碾碎 对于动物组织对于动物组织( (如鼠肝、兔肝等如鼠肝、兔肝等) )，一般多采用匀浆的，一般多采用匀浆的方法。即将组织剪碎置研钵中，研碎。方法。即将组织剪碎置研钵中，研碎。为了提高研磨效果，可加入一定量的石英砂。但要注为了提高研

11、磨效果，可加入一定量的石英砂。但要注意石英砂对有效成分的吸附作用。意石英砂对有效成分的吸附作用。用匀浆器处理，也能把动物细胞破碎，此法较温和，用匀浆器处理，也能把动物细胞破碎，此法较温和，适于实验室应用。适于实验室应用。若需大规模生产，则可用电动研磨法，酵母、植物组若需大规模生产，则可用电动研磨法，酵母、植物组织的细胞破碎也可用此法。织的细胞破碎也可用此法。l是一种剧烈的破碎细胞的方法。是一种剧烈的破碎细胞的方法。l捣碎器捣碎器(8 000-10 000 r/min)(8 000-10 000 r/min)处理处理303045s45s，植物和动，植物和动物细胞能完全破碎。物细胞能完全破碎。l若

12、用它破碎酵母菌和细菌的细胞，则需加入石英砂方若用它破碎酵母菌和细菌的细胞，则需加入石英砂方才有效。才有效。l在捣碎期间必须保持低温，以防温度升高引起有效成在捣碎期间必须保持低温，以防温度升高引起有效成分变性，同时捣碎的时间不宜太长。分变性，同时捣碎的时间不宜太长。 l是借助声波的振动力破碎细胞壁和细胞器的有效方法。是借助声波的振动力破碎细胞壁和细胞器的有效方法。l由于细菌的外部有一层细胞壁，破壁较为困难，因此由于细菌的外部有一层细胞壁，破壁较为困难，因此用超声波处理细菌和酵母的时问要长一点。有些菌体用超声波处理细菌和酵母的时问要长一点。有些菌体破碎需要破碎需要5 5l0minl0min或更长，

13、如果在细胞浮液中加石英或更长，如果在细胞浮液中加石英砂则可缩短时间。砂则可缩短时间。l为了防止电器长时间运转产生过多的热量，常采用间为了防止电器长时间运转产生过多的热量，常采用间歇处理和降低温度的方法进行。歇处理和降低温度的方法进行。l是一种温和、彻底破碎细胞的方法。是一种温和、彻底破碎细胞的方法。l即用高压迫使几十毫升细胞悬液通过一个小于即用高压迫使几十毫升细胞悬液通过一个小于细胞直径的小孔，致使细胞被挤压破碎。细胞直径的小孔，致使细胞被挤压破碎。l概念：概念：在低渗溶液，如低浓度的稀盐溶液中，由于存在低渗溶液，如低浓度的稀盐溶液中，由于存在渗透压差，溶剂分子将大量进入细胞，致使细胞膜在渗透

14、压差，溶剂分子将大量进入细胞，致使细胞膜膨胀破裂的现象称为溶胀。膨胀破裂的现象称为溶胀。l步骤：步骤：将细胞置低温下冰冻一定时间，然后取出至室将细胞置低温下冰冻一定时间，然后取出至室温下温下( (或或4040左右左右) )迅速融解。如此反复冻融多次，细迅速融解。如此反复冻融多次，细胞可在形成冰粒和增高胞液盐浓度的同时，发生溶胀，胞可在形成冰粒和增高胞液盐浓度的同时，发生溶胀，以致破碎。以致破碎。 l概念：概念：细胞结构在本身所具有的各种水解酶作细胞结构在本身所具有的各种水解酶作用下，发生溶解的现象称为自溶。用下，发生溶解的现象称为自溶。l注意：注意：应用此法时要特别小心操作，因为水解应用此法时

15、要特别小心操作，因为水解酶不仅可破坏细胞壁、细胞膜，同时也可使某酶不仅可破坏细胞壁、细胞膜，同时也可使某些有效成分在自溶时分解。些有效成分在自溶时分解。 l用脂溶性的溶剂用脂溶性的溶剂( (如丙酮、氯仿、甲苯等如丙酮、氯仿、甲苯等) )或表面活性剂或表面活性剂( (如十二烷基硫酸钠如十二烷基硫酸钠) )处理处理细胞时，可使细胞壁和细胞膜的结构部细胞时，可使细胞壁和细胞膜的结构部分溶解，导致整个细胞破碎。分溶解，导致整个细胞破碎。l生物酶有降解细菌细胞壁的功能。生物酶有降解细菌细胞壁的功能。l在用此法处理细菌细胞时，先是细胞壁在用此法处理细菌细胞时，先是细胞壁消融，随之而来的是因渗透压差引起的消

16、融，随之而来的是因渗透压差引起的细胞膜破裂，最后导致细胞完全破碎。细胞膜破裂，最后导致细胞完全破碎。 l SDS(sodium dodecyl sulfate) SDS(sodium dodecyl sulfate)：即十二烷基即十二烷基硫酸钠，是一种有效的细胞消溶剂、核酸酶抑硫酸钠，是一种有效的细胞消溶剂、核酸酶抑制和蛋白变性剂，也是一种去污剂。制和蛋白变性剂，也是一种去污剂。l去垢剂法由去垢剂法由MarmurMarmur于于19611961年创建，最早用于从年创建，最早用于从细菌中提取细菌中提取DNADNA。l原理：原理：抽提核酸时利用抽提核酸时利用SDSSDS的非极性基团破坏蛋白质分的非

17、极性基团破坏蛋白质分子的次级键，使蛋白质变性，达到使核蛋白解联、变子的次级键，使蛋白质变性，达到使核蛋白解联、变性和去除蛋白的目的。变性后的蛋白仍留在溶液中不性和去除蛋白的目的。变性后的蛋白仍留在溶液中不生成沉淀。为了将同时存在于溶液中的核酸和蛋白分生成沉淀。为了将同时存在于溶液中的核酸和蛋白分开，可在室温条件下加入开，可在室温条件下加入1/21/2体积饱和硫酸铵使蛋白沉体积饱和硫酸铵使蛋白沉淀。淀。l特点：特点：此法得率高，对核酸影响小，但制品中仍残留此法得率高，对核酸影响小，但制品中仍残留微量蛋白。微量蛋白。SDSSDS在低温或有两价金属离子或钾离子存在在低温或有两价金属离子或钾离子存在时

18、将形成沉淀，使用时应该注意。时将形成沉淀，使用时应该注意。l酚也是一种蛋白表面变性剂。球状蛋白在水溶酚也是一种蛋白表面变性剂。球状蛋白在水溶液中其亲水性氨基酸残基的侧链位于外侧，疏液中其亲水性氨基酸残基的侧链位于外侧，疏水性氨基酸的侧链位于内侧，水性氨基酸的侧链位于内侧，l酚法于酚法于19571957年为年为KirbyKirby建立，最早用于建立，最早用于DNADNA的抽的抽提。提。 l可能是插入蛋白结构的内部，破坏各种氨基酸残基侧可能是插入蛋白结构的内部，破坏各种氨基酸残基侧链基团问的次级键，使蛋白的结构翻转，链基团问的次级键，使蛋白的结构翻转，l即原来存在于内侧的疏水性氨基酸残基侧链转向外

19、侧，即原来存在于内侧的疏水性氨基酸残基侧链转向外侧，而外侧的亲水性氨基酸残基侧链则转向内侧，导致蛋而外侧的亲水性氨基酸残基侧链则转向内侧，导致蛋白质变性。白质变性。l酚还能使核酸酶失活。酚还能使核酸酶失活。lCTAB(eetyltriethylammonium bromide):CTAB(eetyltriethylammonium bromide):即十六烷基即十六烷基三乙基溴化铵，是一种去污剂。三乙基溴化铵，是一种去污剂。l特点：特点：此法相对较为简单，特别适用于植物材料，已此法相对较为简单，特别适用于植物材料，已成功地从一系列的单子叶和双子叶植物中提取出总成功地从一系列的单子叶和双子叶植物

20、中提取出总DNADNA。l此法提取植物此法提取植物DNADNA时，可采用氯仿时，可采用氯仿/ /异戊醇反复抽提去异戊醇反复抽提去蛋白，通过高盐缓冲液的选择性沉淀去除多糖类杂质蛋白，通过高盐缓冲液的选择性沉淀去除多糖类杂质. .l可溶解细胞膜，能与核酸形成复合物，可溶解细胞膜，能与核酸形成复合物，l该复合物在高盐溶液中该复合物在高盐溶液中(0.7mol/L NaCl)(0.7mol/L NaCl)是可溶的，是可溶的，l当溶液盐浓度降低到一定程度当溶液盐浓度降低到一定程度(0.3mol/I(0.3mol/INaCl)NaCl)时，时，却会从溶液中沉淀出来，却会从溶液中沉淀出来，l因此通过离心便可将

21、因此通过离心便可将CTABCTAB与核酸的复合物同蛋白质、与核酸的复合物同蛋白质、多糖类物质分开。多糖类物质分开。l然后将此复合物沉淀溶解于高盐溶液，然后将此复合物沉淀溶解于高盐溶液，l再加入乙醇使核酸沉淀，因再加入乙醇使核酸沉淀，因CTABCTAB溶解于乙醇，离心后溶解于乙醇，离心后即可得即可得DNADNA沉淀。沉淀。l既适用于新鲜的植物，也可用于经脱水处理的材料，既适用于新鲜的植物，也可用于经脱水处理的材料，能够很好地去除多糖类杂质，对于含糖较高的植物材能够很好地去除多糖类杂质，对于含糖较高的植物材料可优先采用。料可优先采用。l另一优点是提取的前期能同时得到高含量的另一优点是提取的前期能同

22、时得到高含量的DNADNA及及RNARNA，如果后续实验对两者都有需要，则可分别进行纯化。如果后续实验对两者都有需要，则可分别进行纯化。如只需要如只需要DNADNA，则加入，则加入RNaseRNase除去除去RNARNA；若只需；若只需RNARNA，则，则加入加入DNaseDNase去掉去掉DNADNA。l该法制得的该法制得的DNADNA虽然纯度不很高，但仍能满足限制性内虽然纯度不很高，但仍能满足限制性内切核酸酶分析、切核酸酶分析、PCRPCR反应以及反应以及DNADNA重组克隆的要求。重组克隆的要求。 l机制：机制：高浓度的盐可以破坏核酸和蛋白质之间的次级高浓度的盐可以破坏核酸和蛋白质之间的

23、次级键，使核蛋白解联。键，使核蛋白解联。l一般先用一般先用lmol/L NaCllmol/L NaCl或或lmol/L NaClOlmol/L NaClO4 4进行抽提，再进行抽提，再加入氯仿加入氯仿/ /异戊醇离心去蛋白，最后用甲醇或异丙醇使异戊醇离心去蛋白，最后用甲醇或异丙醇使核酸沉淀。核酸沉淀。l其中的氯仿可以使蛋白表面变性，帮助去蛋白。其中的氯仿可以使蛋白表面变性，帮助去蛋白。l异戊醇可以消泡以维持离心层的稳定。异戊醇可以消泡以维持离心层的稳定。l特点：特点：该法对核酸的损伤较小，但由于去除蛋白不够该法对核酸的损伤较小，但由于去除蛋白不够彻底，常与其他方法结合使用。彻底，常与其他方法结

24、合使用。 l由由KarrwerKarrwer等人于等人于19951995年建立的一种方法。年建立的一种方法。l特点：特点：此法借助毛细管或微量移液管直接提取此法借助毛细管或微量移液管直接提取细胞的内含物，进行细胞的内含物，进行RNARNA抽提。抽提。l用激光移液管拉伸器用激光移液管拉伸器(1aserpipette puller)(1aserpipette puller)将毛细石将毛细石英管拉成孔径为英管拉成孔径为l0uml0um的微量移液管，将其顶端弯曲的微量移液管，将其顶端弯曲2323，以便穿透细胞壁。以便穿透细胞壁。l微量移液管被安装在连接了气泵的微操纵器上，通过负微量移液管被安装在连接了

25、气泵的微操纵器上，通过负压将大约压将大约1ul RNA1ul RNA提取液提取液(100mmol/L Tris-HCl(100mmol/L Tris-HCl，pH8.0pH8.0；500mmol/L LiCl500mmol/L LiCl；10mmol/L EDTA10mmol/L EDTA；1%SDS1%SDS；5mmol/L 5mmol/L DTT)DTT)压入微量移液管。压入微量移液管。l装有提取液的微量移液管被降低到叶片表面，微量移液装有提取液的微量移液管被降低到叶片表面，微量移液管顶点的那一小滴提取液在管顶点的那一小滴提取液在275kPa275kPa气压作用下被排出气压作用下被排出.

26、.l一旦微量移液管尖端被清空后，立即供给一旦微量移液管尖端被清空后，立即供给1.3kPa1.3kPa的负的负压，这时微量移液管就插入到目的细胞内。压，这时微量移液管就插入到目的细胞内。l一经插入，细胞内含物就被吸进微量移液管。一经插入，细胞内含物就被吸进微量移液管。l可以明显地看到，细胞立刻瘪了下去。可以明显地看到，细胞立刻瘪了下去。l然后，微量移液管离开细胞，内含物被注入到然后，微量移液管离开细胞，内含物被注入到10u1 10u1 RNARNA提取液中，用提取液中，用69kPa69kPa和和1.3kPa1.3kPa正、负压反复作用，正、负压反复作用，以便将微量移液管顶端漂洗干净。以便将微量移

27、液管顶端漂洗干净。l此法可直接从叶片的表皮细胞、防御细胞以及叶肉细此法可直接从叶片的表皮细胞、防御细胞以及叶肉细胞中提取胞中提取mRNAmRNA，而叶片却不受到损伤。，而叶片却不受到损伤。l随后，再加入随后，再加入10u1 RNA10u1 RNA提取液，其中含有提取液，其中含有50ug50ug连接了连接了oligo(dT)-oligo(dT)-的磁力珠，混合均匀，的磁力珠，混合均匀，2222下静置下静置l0minl0min。l再用再用2ou1 12ou1 1倍的反转录缓冲液倍的反转录缓冲液(50mmol/Ltris-(50mmol/Ltris-HClHCl，pH8.3pH8.3；75mmol/

28、L KCl75mmol/L KCl；3mmol/L MgCl3mmol/L MgCl2 2；10 mmol/L DTT)10 mmol/L DTT)洗两次，即可将结合在磁力珠洗两次，即可将结合在磁力珠上的上的mRNAmRNA洗脱下来。洗脱下来。l该法是将一块被冷冻或被石蜡包埋的组织切成该法是将一块被冷冻或被石蜡包埋的组织切成薄片，然后所需要的部位被激光解剖下来，再薄片，然后所需要的部位被激光解剖下来，再利用黏膜通过静电作用迅速地将其吸附，并立利用黏膜通过静电作用迅速地将其吸附，并立即转移到即转移到RNARNA提取液中。提取液中。 l它减少了对组织的处理，可避免它减少了对组织的处理，可避免RNA

29、RNA表表达轮廓达轮廓(profile)(profile)的改变；的改变；l因为某些实验，特别是对时钟基因的因为某些实验，特别是对时钟基因的研究，时间因素至关重要，采用此法可研究，时间因素至关重要，采用此法可减少采样时间对实验的影响。减少采样时间对实验的影响。 l特点：特点：是一种快速而准确地从分生组织的细胞中提取是一种快速而准确地从分生组织的细胞中提取RNARNA的技术，已应用于拟南芥根系全球性基因表达图谱的技术，已应用于拟南芥根系全球性基因表达图谱的制作。的制作。l原理：原理：首先需将荧光蛋白基因转入受体细胞，用酶处首先需将荧光蛋白基因转入受体细胞，用酶处理破壁后，通过紫外照射使那些表达绿

30、色荧光蛋白的理破壁后，通过紫外照射使那些表达绿色荧光蛋白的细胞产生荧光，再通过荧光感受分离仪细胞产生荧光，再通过荧光感受分离仪(flurescence-(flurescence-activated cell sorteractivated cell sorter，简称，简称FACS)FACS)将其从特定组织将其从特定组织或区域中分离出来，进而制得或区域中分离出来，进而制得RNA RNA l若溶液中若溶液中DNADNA含量低，而且容积较大时，常需含量低，而且容积较大时，常需进行浓缩，以便进一步沉淀和纯化。进行浓缩，以便进一步沉淀和纯化。l常用的核酸浓缩方法是真空干燥法。常用的核酸浓缩方法是真空干

31、燥法。l此法比较温和，特别适用于小量样品的浓缩。此法比较温和，特别适用于小量样品的浓缩。l此外，还有以下两种方法：此外，还有以下两种方法：l正丁醇或仲丁醇能吸收大量水，而正丁醇或仲丁醇能吸收大量水，而DNADNA不溶于不溶于丁醇。丁醇。l利用该特性，向利用该特性，向DNADNA溶液中反复加入等体积正溶液中反复加入等体积正丁醇或仲丁醇，振荡混合后离心，去除有机相，丁醇或仲丁醇，振荡混合后离心，去除有机相，可显著减少可显著减少DNADNA溶液的体积并浓缩溶液的体积并浓缩DNADNA。l水沉淀法聚乙二醇同样具有吸水能力。水沉淀法聚乙二醇同样具有吸水能力。l将将DNADNA溶液装入透析袋，包埋在聚乙二

32、醇溶液装入透析袋，包埋在聚乙二醇( (分子分子量量6 0006 00012 00012 000为宜为宜) )中，聚乙二醇吸水液化，中，聚乙二醇吸水液化，同时同时DNADNA溶液体积减小、可通过更换溶液体积减小、可通过更换PEGPEG干粉达干粉达到浓缩的目的。到浓缩的目的。l 沉淀是浓缩核酸最常用的方法。沉淀是浓缩核酸最常用的方法。l其最大优点是通过沉淀来改变和重新调节核酸溶液的其最大优点是通过沉淀来改变和重新调节核酸溶液的浓度，并可去除溶液中某些盐类和杂质，在一定程度浓度，并可去除溶液中某些盐类和杂质，在一定程度上将核酸纯化。上将核酸纯化。l核酸是多聚阴阳离子的水溶性化合物，它与钠、钾、核酸是

33、多聚阴阳离子的水溶性化合物，它与钠、钾、镁形成的盐在多种有机溶剂中不溶解，也不会变性。镁形成的盐在多种有机溶剂中不溶解，也不会变性。l常用的有机溶剂有乙醇、异丙醇、聚乙二醇等。常用的有机溶剂有乙醇、异丙醇、聚乙二醇等。l1)NaAc1)NaAc：沉淀：沉淀DNADNA、RNARNA最常用的盐类，终浓度为最常用的盐类，终浓度为0 03mol/L(pH5.0)3mol/L(pH5.0)。l2)NaCl2)NaCl：对于含有：对于含有SDSSDS的的DNADNA样品是优先选用的试样品是优先选用的试剂，终浓度为剂，终浓度为0.2 mol/L0.2 mol/L。l3)NHAc3)NHAc：4 4种种dN

34、TPdNTP在在NHAcNHAc溶液中均具较高的溶解溶液中均具较高的溶解度，通过乙醇沉淀度，通过乙醇沉淀DNADNA，可去除大部分，可去除大部分dNTPdNTP。l4)KAc4)KAc：沉淀效果与：沉淀效果与NaAcNaAc相同。终浓度为相同。终浓度为0.3 0.3 mol/Lmol/L。但核酸的钾盐很难溶于含。但核酸的钾盐很难溶于含SDSSDS的溶液，若的溶液，若在下一步选用含在下一步选用含SDSSDS的缓冲液溶解核酸沉淀时，的缓冲液溶解核酸沉淀时，则不宜选用此法沉淀核酸。则不宜选用此法沉淀核酸。l5)LiCl5)LiCl：在乙醇中溶解度非常好，在：在乙醇中溶解度非常好，在7070乙醇中乙醇

35、中不与不与DNADNA共沉淀，且高浓度共沉淀，且高浓度0.8mol/L)0.8mol/L)时可直接沉时可直接沉淀大分子淀大分子RNA(RNA(包括包括rRNArRNA、mRNA)mRNA)，故常用于，故常用于RNARNA的的沉淀。沉淀。l6)MgCl6)MgCl2 2：MgMg2+2+是核酸沉淀中的有效离子，当核是核酸沉淀中的有效离子，当核酸浓度低于酸浓度低于0.1ug/ml0.1ug/ml或其长度小于或其长度小于100100个核苷个核苷酸时，加入酸时，加入l0mmol/Ll0mmol/L的的MgMg2+2+可明显提高核酸沉可明显提高核酸沉淀的回收率。淀的回收率。MgMg2+2+对核酸的沉淀并

36、不需要低温对核酸的沉淀并不需要低温条件。即使在室温条件下，条件。即使在室温条件下，10min10min之内也比之内也比NaAcNaAc在在0 0时沉淀时沉淀DNADNA的效率高的效率高2 2倍。倍。l1)1)乙醇：沉淀乙醇：沉淀DNADNA一般首选乙醇，它对盐类沉淀一般首选乙醇，它对盐类沉淀较少，含在较少，含在DNADNA沉淀中的少量乙醇易被蒸发去除，沉淀中的少量乙醇易被蒸发去除，不影响后续的实验。在适当的盐浓度下，两倍不影响后续的实验。在适当的盐浓度下，两倍样品容积的乙醇可有效沉淀样品容积的乙醇可有效沉淀DNADNA，对于，对于RNARNA则需则需将乙醇用量增至将乙醇用量增至2.52.5倍。

37、倍。l优点是所需的用量较少且速度快，适用于浓度低而体积优点是所需的用量较少且速度快，适用于浓度低而体积大的大的DNADNA沉淀。沉淀。l0.540.541.01.0倍的异丙醇可选择性地沉淀倍的异丙醇可选择性地沉淀DNADNA和大分子和大分子rRNArRNA和和mRNAmRNA，但对，但对5SRNA5SRNA、tRNAtRNA及多糖不产生沉淀，一般不及多糖不产生沉淀，一般不需在低温条件下长时间放置。需在低温条件下长时间放置。l缺点是易使盐类与缺点是易使盐类与DNADNA共沉淀，在共沉淀，在DNADNA沉淀中的异丙醇难沉淀中的异丙醇难以挥发除去，所以通常要用以挥发除去，所以通常要用7070乙醇漂洗

38、乙醇漂洗DNADNA沉淀数次沉淀数次. .(2)(2)异丙醇异丙醇: :l可用不同浓度的可用不同浓度的PEGPEG选择沉淀不同分子量的选择沉淀不同分子量的DNADNA片段。片段。l应用应用PEG 6 000PEG 6 000进行沉淀时，其使用浓度与进行沉淀时，其使用浓度与DNADNA片段的片段的大小成反比。大小成反比。lPEGPEG沉淀一般需要加入沉淀一般需要加入0.5mol/L NaCl0.5mol/L NaCl或或10 mmol/L 10 mmol/L MgClMgCl2 2。l除去除去DNADNA沉淀中沉淀中PEGPEG的最简单有效的办法是用的最简单有效的办法是用7070的乙的乙醇漂洗醇

39、漂洗2 2次。次。l精胺不是有机溶剂，但可快速有效地沉淀精胺不是有机溶剂，但可快速有效地沉淀DNADNA，适用于少，适用于少量量DNADNA的纯化。的纯化。l原理原理: :精胺与精胺与DNADNA结合后，使结合后，使DNADNA在溶液中结构凝缩而发生在溶液中结构凝缩而发生沉淀，并可使单核苷酸和蛋白质杂质与沉淀，并可使单核苷酸和蛋白质杂质与DNADNA分子分开，达分子分开，达到纯化到纯化DNADNA的目的。对于大于的目的。对于大于60bp60bp的的DNADNA片段，其浓度在片段，其浓度在0.10.1100ug/ml100ug/ml左右，也有很好的效果。沉淀左右，也有很好的效果。沉淀DNADNA

40、的要求的要求是溶液中无盐或低盐是溶液中无盐或低盐( (小于小于0.1mol/L)0.1mol/L)，最后可用，最后可用7070的的乙醇漂洗乙醇漂洗2 2次以去除次以去除DNADNA沉淀中的精胺。沉淀中的精胺。l大多数大多数DNADNA的沉淀在的沉淀在0 044、12 000g12 000g离心离心10min10min即可。即可。l若若DNADNA片段小于片段小于100100个核苷酸时，则需要超速离个核苷酸时，则需要超速离心。心。l对于对于pgpg水平的核酸沉淀，应加入水平的核酸沉淀，应加入tRNAtRNA作为载体作为载体共沉淀。共沉淀。l方法方法: :很多，如超速离心、柱层析、免疫沉淀、很多，

41、如超速离心、柱层析、免疫沉淀、凝胶电泳等。凝胶电泳等。l实验室实验室最常用的纯化方法最常用的纯化方法: :酚酚/ /氯仿抽提法。氯仿抽提法。l该方法的该方法的标准程序标准程序是用酚抽提一次，酚是用酚抽提一次，酚/ /氯仿氯仿(1:1)(1:1)抽提一次，氯仿抽提一次。如果情况需抽提一次，氯仿抽提一次。如果情况需要可再重复几次。要可再重复几次。l基本原理基本原理: :是通过交替使用酚、氯仿这两种不是通过交替使用酚、氯仿这两种不同的蛋白质变性剂来增加去除蛋白质的效果。同的蛋白质变性剂来增加去除蛋白质的效果。 l可以通过加入乙醇或用盐溶液选择性沉淀进行分离，可以通过加入乙醇或用盐溶液选择性沉淀进行分

42、离，也可以通过透析除去。也可以通过透析除去。l例如例如: :l在醋酸根离子存在下加入乙醇，在醋酸根离子存在下加入乙醇，l或在高浓度的盐溶液中，或在高浓度的盐溶液中，l或于低温下的或于低温下的33%33%硫酸铵介质中，硫酸铵介质中，l高分子量的高分子量的RNARNA都可以沉淀。都可以沉淀。 l高分子物质主要指蛋白质和黏多糖高分子物质主要指蛋白质和黏多糖. .l去此类高分子物质常用的方法有去此类高分子物质常用的方法有: :如果核酸不是采用酚法制备的，可在对氨基水杨酸等如果核酸不是采用酚法制备的，可在对氨基水杨酸等化合物存在的条件下，将核酸制品连续用苯酚进行处化合物存在的条件下，将核酸制品连续用苯酚

43、进行处理，此时理，此时DNADNA和和RNARNA均进入水相，蛋白质沉淀留在酚相。均进入水相，蛋白质沉淀留在酚相。然后取水相加入乙醇或然后取水相加入乙醇或2-2-乙氧基乙醇沉淀乙氧基乙醇沉淀RNARNA或或DNADNA，也可以用酚或也可以用酚或SDSSDS反复摇荡抽提。反复摇荡抽提。如果是用酚法制得的核酸，则大部分蛋白质已被除去，如果是用酚法制得的核酸，则大部分蛋白质已被除去，若要进一步除去其中的微量蛋白，可用氯仿若要进一步除去其中的微量蛋白，可用氯仿/ /异戊醇或异戊醇或辛醇振荡抽提，同时加热处理使蛋白质凝固形成沉淀，辛醇振荡抽提，同时加热处理使蛋白质凝固形成沉淀，离心分离，核酸即留在溶液中

44、。离心分离，核酸即留在溶液中。 l第二个方法是第二个方法是KirbyKirby创建并经创建并经RalphRalph和和BellamyBellamy等改良的有机溶剂法。即在等改良的有机溶剂法。即在pH8pH8的的1.25mol/L1.25mol/L磷磷酸缓冲液中，用酸缓冲液中，用2-2-甲氧基乙醇抽提，多糖溶于甲氧基乙醇抽提，多糖溶于水相，核酸在有机相，加入水相，核酸在有机相，加入CTAB(CTAB(十六烷基三十六烷基三乙基溴化铵乙基溴化铵) )沉淀核酸，然后在沉淀核酸，然后在70%70%乙醇中用醋乙醇中用醋酸钠处理，以钠盐的形式回收核酸。酸钠处理，以钠盐的形式回收核酸。l此外，也可以用钙盐沉淀

45、此外，也可以用钙盐沉淀DNADNA，再用草酸钾处，再用草酸钾处理形成理形成DNADNA钾盐回收，然后用离子交换层析法钾盐回收，然后用离子交换层析法吸附吸附DNADNA使之与多糖分离。使之与多糖分离。 l通常可采用酶处理、有机溶剂抽提、盐分步沉淀和密通常可采用酶处理、有机溶剂抽提、盐分步沉淀和密度梯度离心等方法。度梯度离心等方法。l从从DNADNA中除去中除去RNARNA的有效方法是利用的有效方法是利用RNaseRNase选择性地降解选择性地降解RNARNA。但由于。但由于RNaseRNase中常含有极微量的中常含有极微量的DNaseDNase，因而必须，因而必须先将先将RNaseRNase试剂

46、于试剂于8080100100) )加热处理加热处理5 510min10min。l反之，为了从反之，为了从RNARNA制品中除去制品中除去DNADNA，可加入，可加入DNaseDNase降解降解DNADNA，加入的酶则利用酚法除去。，加入的酶则利用酚法除去。l其他除去其他除去DNADNA的常用方法是苯酚抽提法。的常用方法是苯酚抽提法。 l在初步纯化的在初步纯化的RNARNA制品中，常含有各种制品中，常含有各种RNARNA和某和某些降解些降解RNARNA的混合物；的混合物；l在在DNADNA制品中则往往含有变性或降解的制品中则往往含有变性或降解的DNADNA，l通常多采用梯度离心、电泳、柱层析及反

47、复萃通常多采用梯度离心、电泳、柱层析及反复萃取抽提等方法进一步纯化或分级分离。取抽提等方法进一步纯化或分级分离。l核酸的分离和纯化，通常采用密度梯度离心法。密度梯核酸的分离和纯化，通常采用密度梯度离心法。密度梯度离心是一种带状分离法。度离心是一种带状分离法。l密度梯度离心法包括密度梯度差速离心、等密度离心和密度梯度离心法包括密度梯度差速离心、等密度离心和浮力密度梯度离心。浮力密度梯度离心。l梯度溶液所使用的成分有蔗糖、甘油、氯化铯、氯化铷、梯度溶液所使用的成分有蔗糖、甘油、氯化铯、氯化铷、右旋糖酐和蔗糖多聚物等。右旋糖酐和蔗糖多聚物等。l这些物质本身对核酸、蛋白质等具有化学惰性，因此不这些物质

48、本身对核酸、蛋白质等具有化学惰性，因此不会导致其分子间的聚集，而且由于这些物质的黏性大，会导致其分子间的聚集，而且由于这些物质的黏性大，可以维持重力的稳定性，防止由于局部温度变化或机械可以维持重力的稳定性，防止由于局部温度变化或机械振动所产生的对流振动所产生的对流, ,起着稳定离心液保证分离效果的作用起着稳定离心液保证分离效果的作用. . 一、供体一、供体DNADNA的分离与纯化的分离与纯化 要求：尽可能地保持其高分子量，无其它污染物要求：尽可能地保持其高分子量，无其它污染物. .1 1、 基因组大小：基因组大小： 染色体染色体细菌细菌 33004200kb酵母酵母 15,000 kb果蝇果蝇

49、 1.28x105 kb人人 3x106 kb植物植物 2x1051x108 kb 天花病毒天花病毒 288 kb痘病毒痘病毒 196 kb质体质体 几几100以上以上kb 线粒体线粒体 藻类藻类 线状线状 15kb酵母酵母 环状环状 1978 kb植物植物 环状环状 100150 kb动物动物(扁虫到人扁虫到人)环状环状 1518 kb锥虫锥虫 网状网状 6000 kb(幼体幼体)短膜虫短膜虫 网状网状 30,000 kb(幼体幼体) (Kinetoplast） 叶绿体叶绿体双子叶植物双子叶植物 121（菠菜）（菠菜）154kb（豌豆）（豌豆）单子叶植物单子叶植物 151（玉米）（玉米）18

50、2kb（浮萍）（浮萍）藻类藻类 132（裸藻）（裸藻）191kb（衣藻）（衣藻） 1、 DNA分离纯化过程分离纯化过程 破碎细胞破碎细胞 + DNA抽提液抽提液(EDTA、去污剂、还原剂、去污剂、还原剂) 65温育温育20 冰浴冷却冰浴冷却 离心去细胞碎片离心去细胞碎片 苯酚抽提法苯酚抽提法 CsCl密度梯度离心密度梯度离心 2) CsCl密度梯度离心密度梯度离心上清液上清液 加入固体加入固体CsCl与与EtBr溶液溶液 室温下超速离心室温下超速离心(45,000rpm）16小时小时 穿孔取出穿孔取出DNA（320nm） 异丙醇抽提异丙醇抽提溴乙锭溴乙锭 缓冲液透析除去残余缓冲液透析除去残余C

51、sCl 两倍体积冷乙醇沉淀两倍体积冷乙醇沉淀DNA 离心、洗涤、干燥离心、洗涤、干燥1) 苯酚抽提法苯酚抽提法上清液上清液 缓冲液用水饱和苯酚抽提缓冲液用水饱和苯酚抽提23次次 上层液相用氯上层液相用氯仿抽至界面无蛋白变性物仿抽至界面无蛋白变性物 上层液相用两倍体积冷乙醇沉上层液相用两倍体积冷乙醇沉淀淀 沉淀物用沉淀物用70%冷乙醇洗涤冷乙醇洗涤,干燥干燥 溶于缓冲液溶于缓冲液 加加入入RNAase处理除去处理除去RNA 苯酚氯仿抽提苯酚氯仿抽提 沉淀干燥沉淀干燥 l* *两种方法比较：两种方法比较：CsClCsCl法操作步骤少，分离法操作步骤少，分离DNADNA分子量大，耗财多，且分子量大，

52、耗财多，且需超速离心机。需超速离心机。苯酚法耗时少，不需昂贵仪器，但操作步骤多，易使苯酚法耗时少，不需昂贵仪器，但操作步骤多，易使DNADNA分子断裂。分子断裂。 若若 小心操作，所获小心操作，所获DNADNA亦符合要求。亦符合要求。l* * * 上述两种分离方法都包含了下述四个分离步骤上述两种分离方法都包含了下述四个分离步骤. .可溶与不可溶物分离：高速离心除去细胞碎片，可溶与不可溶物分离：高速离心除去细胞碎片，保留上清液。保留上清液。. . 使蛋白质分离：苯酚抽提或超速离心使蛋白质分离：苯酚抽提或超速离心. . 使使RNARNA分离：分离：RNaseRNase处理或超速离心处理或超速离心.

53、 . 使使DNADNA与其它可溶物分离与其它可溶物分离2 2、细胞器、细胞器DNADNA的分离的分离 植物组织植物组织 用核分离缓冲液匀浆用核分离缓冲液匀浆 过滤过滤 滤液离滤液离心心(2000g, 10,4) (2000g, 10,4) 核缓冲液使核裂解核缓冲液使核裂解( (含含0.5%Triton X-100) 0.5%Triton X-100) 抽提抽提DNA DNA 植物组织植物组织 细胞器缓冲液匀浆细胞器缓冲液匀浆 离心离心(100g, 10,4)(100g, 10,4)除去细胞核除去细胞核 离心离心(1800g,10,4)(1800g,10,4)分离叶绿体分离叶绿体 离离心心(10

54、,000g, 10,4)(10,000g, 10,4)分离线粒体分离线粒体 DNaseDNase除去细胞器除去细胞器外外DNA DNA 加入加入EDTAEDTA使使DNaseDNase失活失活 纯化细胞器纯化细胞器 细细胞器裂解胞器裂解 提取提取DNA DNA l1 1、质粒载体、质粒载体DNADNA的分离的分离 关键：关键：如何使质粒如何使质粒DNADNA与宿主染色体与宿主染色体DNADNA分开分开 原理：原理：质粒质粒DNADNA比染色体比染色体DNA DNA 小得多，在小得多，在DNADNA抽提过程中，染色体抽提过程中，染色体DNADNA断裂成小片段断裂成小片段( (线状线状) )，质粒

55、质粒DNADNA仍保持超螺旋构型仍保持超螺旋构型. . 方法：方法： . . 超速离心：利用两种超速离心：利用两种DNADNA分子的大小和空间构型分子的大小和空间构型 . . 变性法：在变性条件下使染色体变性法：在变性条件下使染色体DNADNA变为单链，而变为单链，而质粒质粒DNADNA仍保持环状结构，当变性条件发生迅速变化时，前仍保持环状结构，当变性条件发生迅速变化时，前者仍不能复性，而后者又可回复到天然构型。者仍不能复性，而后者又可回复到天然构型。 变性条件可采用加热煮沸法或碱变性法变性条件可采用加热煮沸法或碱变性法上述方法亦可用于上述方法亦可用于ssss环状病毒环状病毒DNA RFDNA

56、 RF型的分离型的分离, , 质粒质粒DNADNA的的氯霉素扩增氯霉素扩增使用并不广泛（菌株和载体）使用并不广泛（菌株和载体）l 纯净病毒颗粒纯净病毒颗粒 病毒载体病毒载体DNA DNA l M13mp M13mp载体可采用质粒载体可采用质粒DNADNA的分离方法。的分离方法。二、二、RNARNA的分离与纯化的分离与纯化1.1. 制备制备RNARNA的关键的关键- -防止内外源防止内外源RNaseRNase的作用的作用1)1) RNaseRNase的特点：抗酸抗碱的特点：抗酸抗碱, ,具很广具很广pHpH作用范围作用范围; ; 抗高温严抗高温严寒寒(065(065均具活性）；抗变性剂均具活性）

57、；抗变性剂2)2) 解决办法：解决办法：l 外源外源RNaseRNase高温，焦磷酸二乙酯高温，焦磷酸二乙酯(DEPC)(DEPC)处理所有溶液处理所有溶液（TrisTrisHClHCl除外）和器皿，操作者带手套。除外）和器皿，操作者带手套。l 内源内源RNaseRNase高温抽提，强蛋白质变性剂，高温抽提，强蛋白质变性剂，RNaseRNase抑制剂，抑制剂，蛋白酶蛋白酶K K等。等。l根据所用蛋白质变性剂种类不一样分为以下三种制备根据所用蛋白质变性剂种类不一样分为以下三种制备方法：方法：l 1 1）热苯酚抽提法）热苯酚抽提法l 2 2）胍盐法：异硫氰酸胍和硫氰酸胍）胍盐法：异硫氰酸胍和硫氰酸

58、胍l 3 3）LiCl/LiCl/尿素法尿素法 其中以胍盐法最好，对于从那些其中以胍盐法最好，对于从那些RNaseRNase含量很高的组织（胰含量很高的组织（胰脏）中提取脏）中提取RNARNA特别有效，可使特别有效，可使RNaseRNase迅速变性，制备的迅速变性，制备的RNARNA有较高翻译活性。在有较高翻译活性。在RNARNA制备中，细胞破碎与蛋白质变性是制备中，细胞破碎与蛋白质变性是同步进行的。同步进行的。3.3. 多聚核糖体多聚核糖体RNARNA的制备的制备 1)1) 多聚核糖体的分离多聚核糖体的分离 超速离心法（超速离心法（30-4030-40万万g g，离心，离心2-3 2-3 h

59、 h） 镁盐沉淀法（镁盐沉淀法（0.1 0.1 M MgM Mg+） 分级分离法分级分离法分离特异性多聚核糖体分离特异性多聚核糖体 i i. . 结合与游离核糖体结合与游离核糖体的分离的分离, ,这种方法可避免溶酶体破裂这种方法可避免溶酶体破裂. .ii. ii. 核糖体大小分级分离，利用连续密度梯度分离特大和核糖体大小分级分离，利用连续密度梯度分离特大和特小的多聚核糖体特小的多聚核糖体iii.iii.核糖体免疫沉淀法核糖体免疫沉淀法 * *直接免疫沉淀法直接免疫沉淀法 新生肽链新生肽链+ +抗体抗体 蔗糖密度梯度离心蔗糖密度梯度离心 * * *间接免疫沉淀法间接免疫沉淀法 新生肽链新生肽链+

60、 +抗体抗体+ +抗抗- -抗体（二抗）抗体（二抗） 不可溶复合物不可溶复合物 离心分离离心分离 l* * * *免疫亲和层析法免疫亲和层析法 新生肽链新生肽链- -抗体复合物抗体复合物 不不溶性交联抗原基溶性交联抗原基 l质亲和层析柱吸附质亲和层析柱吸附 洗脱洗脱l免疫沉淀法优点：可分离到含量仅为免疫沉淀法优点：可分离到含量仅为1%1%的的mRNAmRNA，但必，但必须使用高纯度的抗体，不能发生交叉反应和污染核酸须使用高纯度的抗体，不能发生交叉反应和污染核酸酶酶2)2) 多聚核糖体多聚核糖体RNARNA的分离的分离l纯化多聚核糖体纯化多聚核糖体+SDS +SDS 蔗糖密度梯度离心或蛋白蔗糖密