973课题结题报告

1、973 课题结题报告课题名称：大豆重要新基因的发掘与有效利用研究课题编号： tg1998010206负责人：喻德跃承担单位：南京农业大学、中国农科院品资所、吉林省农科院协作单位：中国科学院遗传发育所2003 年 10 月 15 日一、计划任务完成情况（一）计划任务 本课题的任务：发掘大豆抗花叶病毒、 抗食叶性害虫、 产量有关性状、 育性恢复系等新基因， 明确遗传规律，并进行标记和定位。具体指标如下：1、抗大豆花叶病（s mv）基因方面：（1）标记到2 3个抗性基因，纳入遗传图谱；（2）育成抗性品系1 2个，作为育种新种质。2、抗食叶性害虫基因方面：（1）标记到1 2个抗性主基因，纳入遗传图谱；

2、（2）育成抗性品系1 2个，作为育种 新种质。 3 、产量有关性状基因方面：（ 1）标记到3 4 个产量有关性状的基因位点 , 纳入遗传图谱;（ 2）育成具2-4 种特异性状的优良共同遗传背景家系 （ 类似近等基因系 ）, 用于聚合重组。4 、质核互作雄性不育恢复基因方面筛选与恢复基因紧密连锁的分子标记 10cm， 对恢复基因进行定位。 5 、 发表 sci 引用论文五篇以上。（二）完成情况本课题鉴定出一批新的基因资源，包括：抗 smv （133份）、感smv （122份）、抗食叶性害 虫（ 9 份） 、感食叶性抗虫（ 10 份） 、产量性状（ 8 份） 、恢复系（ 10 份） ，建立了重组近

3、交家 系群体（ ril ） 8 个。定位了 9 个新基因，获得分子标记10 个，培育一批有育种价值的中间材料。共计发表论文25 篇，其中 sci 收录 6 篇，国际特邀报告5 篇 , 专著 1 部 , 培养研究生11 人。总体上超额完成了任务目标。（三）主要进展1 、资源鉴定与群体培育（1）抗大豆花叶病毒（smv）方面鉴于国内大豆smv 株系鉴别寄主体系的混乱，在已经使用过的 25 个鉴别寄主中选拔出 8个代表性寄主组成一套新的鉴别体系。 在长江中下游地区广泛采集病样 （近 300 个样） ， 以寄 主鉴定为主、结合smv的组织印迹检测技术和rt-pcr检测技术，发现自20世纪80年代至今，s

4、mv 群体已经产生根本改变，尚未发现原先鉴定过的株系。根据新鉴别体系的鉴定结果，确 定了 10个新株系（sc-1至sc-10）,其中sc-8为强毒性株系群。发现：smv株系群组成复杂， 同一株系群在不同地区的流行存在差异，同时不同株系群在同一地区的分布也有所不同。综 合 1998-2002 年的分析结果，认为：在株系组成上，黄淮地区以 sc-3 和 sc-7 为主。长江中 下游地区以 sc-9 为主。测定了 106 份大豆品种（品系）对sc-7 、 sc-8 、 sc-9 三个株系群的抗性反应，筛选出17 份对三个株系均表现高抗的材料； 18份能兼抗三个株系中的两个株系的材料。构建了抗x感杂交

5、组合衍生的ril群体：科丰1号x南农1138-2 , f7 : 12,206个家系（见 表1）。用东北3号株系（smv3）355份大豆种质资源进行了smv抗性鉴定（包括“七五”初鉴抗smv材料40份，“八五”初鉴抗smv材料91份，各地推广品种100份，农科院品资所新育成的品系 35 份，美国引进材料42 份，韩国引进材料 36 份，泰国 2 份，日本 1 份） 。共筛选出 116份高抗资源， 117份中抗材料， 122 份高感资源。（ 2）抗食叶性害虫基因方面综合 1993-2002 年的田间鉴定结果， 获得一批高抗食叶性害虫和高感食叶性害虫的大豆种质。高抗（hr）的品种9份：黄皮小青豆、日

6、本、larmar、pi227687、矮杆黄、york、阜阳 170、sp26、早16号，抗（r）的品种15份，表现中间（nr）的品种17份，感（s）的品种7 份， 高感 （hs） 的品种 10 份： 大浦大粒黄、 中豆 19、 南农 86-4、 南农 86-4 、 江宁中老鼠豆、监利牛毛黄、花柒黄毛豆、沔阳白毛豆、吴江青豆、 pi229358 。合成重组近交家系群体 2 个，包括： 先进 2 号（感） x 赶泰 -2-2 （抗）已推进到 f7 ： 9世代，含 162 个家系；和皖 82-178 （感） x 通山薄皮黄豆甲（抗）也推进到 f7 ： 9 代，含159 个家系 （见表 1） 。（ 3

7、）产量性状基因方面获得了与提高产量潜力有关的资源8份，包括百粒重高（>40 g）、主茎节数多（>30 ）、短叶柄 （<10cm） 、曲茎、顶生长花序等。构建了 ril 群体 2 个， 包括： 南农 87-23 x ng94-156（f7 ： 8， 175 个家系） ； 波高 （963069）x ng94-156 （f7 ： 8， 156个家系） 。 （见表 1）（ 4）恢复基因方面获得利于大豆杂种优势应用的恢复系： 10 个。阐明了细胞质不育的遗传模式： 以栽培大豆不育系 ya 、 保持系 yb 和含有不育细胞质的原始母本 167 为基础材料，配制了二个单交组合，四个三交组合

8、，根据后代的育性和分离比例判断遗传模式。试验结果表明： s（rfrf） 基因型 f1 花粉为半不育， f2 可育与半不育分离比例为 1： 1；母本为不育细胞质s 时，携带 rf 的雌配子有生活力，能传给后代，而携带 rf 的雄配子无生活力， 不能传给后代。 母本为正常可育细胞质n 时， 携带 rf 的雌、 雄配子均有生活力，可传给后代。分离比例是单基因遗传模式。因此该不育系属“单基因配子体不育” ，即不育性由不育细胞质基因 s 和一对隐性基因 rfrf 控制， 一个显性基因 rf 的存在即可恢复育性。明确了育性的稳定性： 利用人工气候箱，设不同温度和光照长度处理，研究野生型大豆细胞质雄性不育系

9、 oa 和保持系 ob 的育性稳定性。鉴于试材原产于高温短日照的夏大豆区，本试验以 14 小时光照和昼夜温度30 /20 为对照处理，在14 小时不变光照条件下，温度处理为35 /25 ， 30 /20 ，25 /15 ； 在昼夜温度固定为 30 /20 条件下， 光照处理为 15.5 小时， 14 小时， 12.5 小时。在上述所有处理中，不育系 oa 花粉败育率均保持在 99%以上。 只有保持系在15.5 小时光照时， 花粉败育率上升到 14.3%， 这一结果表明， 不育系 oa在温度与光照大幅度变化的情况下，不育性极为稳定。从细胞学方面明确了不育发生的时期： 细胞学观察发现该不育系小孢子

10、减数分裂正常， 绒 毡层亦无明显异常，不育发生的时期是在单核期以后。表 1 本课题培育的 ril 群体2 、新基因发掘与分子标记抗大豆花叶病毒（smv）基因方面通过对 p （科丰1号）、p （南农1138-2）、12f1 和 f7 ： 11 184 个家系的田间抗性鉴定和遗传分析，发现科丰1 号对 smv 株系群 sc-7 、sc-8 、 sc-9 的抗性分别由一对显性基因控制， 并将 rsc-7 、 rsc-8 、 rsc-9 基因定位于n8d1b+w连锁群上， 与已经定位的三个抗性基因 （ rsa 、 rn1 、 rn3 ） 位于同一连锁群， 成簇排列。 此外， 筛选到与抗性基因连锁的 s

11、car 标记和 rapd 标记， 距 rsa 和 rsc 的距离分别为 16.1 和 9.7cm 。由于sc-7、sc-8、sc-9是新鉴定的smv株系群，而鉴定的抗性基因位点与已经发现的smv抗性位点位置不同，因而初步认为：rsc-7、rsc-8、rsc-9 是新的抗smv基因。此外，选育出 njr25-8 、 njr32-8 、 njr-44-1 等综合性状优良、抗性好的中间材料。利用高抗 smv3 号株系的大豆品系 95-5383 与感病品种（品系） hb1 ，铁丰 21， amsoy， williams ,和抗病品种pi486355配制杂交组合，对各组合的fl、f2代接种smv3号株系

12、进行 抗性鉴定，结果表明， 95-5383 与各感病品种的杂交组合 f1 代表现为感病，抗病为隐性， f2 群体分离比例为1r： 3 （s+n）,表明95-5383对smv3号株系的抗性是受一对隐性基因控制。pi486355x95-5383 的 f2 代有感病植株分离， 95-5383 的抗病基因与pi486355 不在同一位点。利用bsa法对95-5383?hb1的99株f2个体进行鉴定，筛选出与smv抗病基因紧密连锁的 共显性rapd标记opn11980/1070。rapd引物opnll在95-5383和抗池扩增出 opn11980片段， 在 hb1 和感池扩增出 opn111070 片段

13、， 在 f1 同时扩增出 opn11980 和 opn111070。 用该引物 分析 95-5383?hb1 的 f2 个体，共显性的 rapd 标记 opn11980/1070 与抗病基因的遗传距离为2.1 cm。从 95-5383 和 hb1 中分别回收opn11980 和 opn111070 特异片段，序列分析结果表明opn11980 和 opn111070 的实际长度分别为 986bp 和 1084bp， 同源性为 93.4%， 主要差别是在两个不同区段插入（缺失）54bp和35bp的碱基。用克隆的rapd片段opn11980作探针（sopnll） 对亲本基因组 dna进彳s sout

14、hern 杂交，结果表明opn11980和opn111070在大豆基因组中是 以低拷贝形式存在。根据克隆片段opn11980和opn111070的序列设计合成了一对scar引物scn11 , scn11 在 95-5383、hb1 和 95-5383 x hb1 的 f2 群体扩增结果与 rapd 引物 opn11 完全 吻合。用 rapd 引物 opn11 和 rflp 探针 sopn11 分析科丰1?南农1138-2 重组近交群体（南京农业大学 / 中国科学院遗传发育所联合构建） ，将 opn11 和 sopn11 定位于 f 连锁群的抗病基因簇上。 由于 95-5383?pi486355

15、 的 f2 代接种后有感病植株分离且抗病基因位于 f 连锁群上与rsv1不等位，表明可能定位的是新的抗病基因。此外，用opn11分析了 68份抗性资源，其中有 25份扩增出opn11980,表明这些品种可能携带与 95-5383 相同的抗性基因，而其它扩增出 opn11980/1070 和 opn111070 的抗性品种可能携带不同于95-5383 的抗性基因。（ 2）抗食叶性害虫基因方面阐明大豆对食叶性害虫的抗性属于两对主基因加多基因的遗传模型。应用皖82-178 x 通山薄皮黄豆甲衍生的 ril 群体在田间对纵合虫种进行鉴定，发现大豆对食叶性害虫综合虫种的抗性由两对主基因加多基因控制。两对

16、中效应较大的一对加性效应为 10.5-10.7 （ 叶面积损失率 , %）, 效应较小的一对加性效应为4.4 -7.2 （ 叶面积损失率, %）, 而且两对主基因的遗传率较高, 达 81.1-94.1%, 多基因的遗传率较低, 为 0-12.2% 。同样，应用皖82-178 x 通山薄皮黄豆甲衍生的 ril 群体在室内对单一虫种斜纹夜蛾进行养虫试验，也发现大豆对该虫种的抗性由两对主基因加多基因控制，主基因的遗传率为 51.4%。抗虫基因（qtl ）有关的分子标记及定位。应用皖 82-178 （感）X通山薄皮黄豆甲（抗）衍生而成的重组自交系群体（ 140 个家系）开展养虫试验，研究各家系对斜纹夜

17、蛾发育的影响， 发现各家系对斜纹夜蛾发育的影响差异很大。 采用 178 对 ssr 引物筛选亲本间的多态性，除无带的引物外，亲本间有多态的引物有52 对，然后用这52 对引物逐一筛选群体单株，对表型值（幼虫重、蛹重）与标记值作相关分析，找到与控制大豆抗虫 qtl 相连锁的 ssr 标记satt135 、 satt363 、 satt442 ，分别位于d2 、 h、 c2 连锁群上，其中 satt442 可以解释 8.7%的变异。而这些标记与所发表的抗玉米穗螟（美国大豆的重要食叶性害虫）基因的标记在遗传图谱上的位置不同，因而认为可能与新的抗食叶性害虫基因有关。 此外 , 选育出 nj89-30

18、等优良抗虫品系。（ 3）产量性状基因方面遗传分析表明，曲茎亲本ng94-156 的基因型可能是sb1sb1sb2sb2 ，直茎亲本 nj90l-2 的基因型可能是sb1sb1sb2sb2 或 sb1sb1sb2sb2 ， nj87-23 、 963069的基因型可能是sb1sb1sb2sb2 。公交 7622-4-1-4 的短叶柄性状由一对隐性基因控制。 而株高、 节间长度、 叶形这 3 个性状的遗传在大多数群体中都符合2 对主基因加多基因的遗传模型。曲茎、短叶柄性状基因的分子标记与定位：用 260 个 rapd 随机引物对三个组合的 4 个亲本（南农 88-31 、波高、 南农 87-23

19、、 ng94-156 ）进行了初步筛选， 后用父、 母本分别为 ng94-156和波高的 ril 后代家系（ 157 个家系）进行筛选，发现其中有1 个引物 s-506 扩增出的多态性条带有较好的重复性。 经过连锁分析， 发现 rapd 标记 s-5061600 与曲茎基因的遗传距离为6.94cm 。此外，应用 181 对 ssr 引物筛选波高和ng94-156 ，发现 50 对引物在亲本间表现多态性，经过 ril 后代家系 （ 157个家系） 进行验证， 发现 satt534 和 satt063 与曲茎性状基因连锁，遗传距离分别为 15.55 cm 和 9.68 cm, 位于连锁群 b2。短

20、叶柄基因连锁的分子标记: 采用 bsa 法，从 260 个引物中筛选出 6 个能扩增出多态性条带的引物，经后代单株的验证，只有s-1 扩增出的多态性条带有较好的重复性。按极大似然法计算 rapd 分子标记 s-11900 与短叶柄基因的遗传距离为 14.36cm 。国内外还没有关于曲茎性状基因和短叶柄性状基因的分子标记的报道。（ 4）恢复基因方面用不育系与恢复系构建了 f2 分离群体，该群体中可育株与半不育株的比例为 1 ： 1 ；利用不育系、恢复系、保持系构建了三交群体，该三交群体中半不育与不育株的比例为 1： 1。对所构建的三交和f2 群体的带有可育、半不育、不育性状的 pool 进行了大

21、量的 ssr 检测， 400 多对 ssr 引物， 发现 ssr 标记 satt414 在不育池和可育池之间存在差异。 将进一步单株分析结果利用 joinmap 软件进行作图， 将恢复基因定位于j 连锁群， 与 ssr标记 satt596 、 satt414 的距离分别为 14.6 与 16.4cm 。为了找到更为紧密的标记，将j 连锁群上的标记对亲本进行分析，发现两个亲本之间的多态性很低，为寻找紧密连锁的标记带来了一定困难。为此， 利用 j 连锁群上的标记对 8 个不育系和 7 恢复系进行了多态性分析， 选出多态性高的不育系辽-82 和恢复系 ck-p 配制了杂交组合，构建了 f2 分离群体

22、。 取不育单株56个和半不育单株49个共 105个单株进行ssr 分析， 用 joinmap 以 kosambi函数进行遗传作图，找到了与恢复基因紧密连锁的分子标记satt547 ，其与恢复基因的遗传距离为 7.5cm 。大豆恢复基因的分子标记在国内外未见报道。（ 5）根系、农艺、品质等基因方面根系与大豆耐旱、营养吸收等方面关系密切。利用科丰 1 号 x 南农 1138-2 ril 群体及其遗传图谱，定位了与大豆根系形态有关的 qtl 。发现有 10 个 qtl 位点（位于4 个连锁群）与相对根重有关， 其中 rwr3 位于标记 stas8-20t 和 stas8-15t 之间， 可以解释 1

23、1.1%的遗传变异； rwr3 位于标记 stas8-3t 和 stas8-6t 之间，可以解释24.7%的遗传变异。还发现，10 个qtl 与相对根总长有关，其中 rtlr1 位于标记 stas8-20t 和 stas8-15t 之间，可以解释7.1%的遗传变异； rtlr2 位于标记 stas8-3t 和 stas8-6t 之间， 可以解释22.9%的遗传变异。这些qtl 的效应正在进一步验证中。利用同一个ril 群体， 对开花日数、 全生育期、 株高、 主茎节数、 倒伏性、 百粒重、 产量、每节荚数等八个农艺性状以及蛋白质含量、油分含量、蛋白质油分总含量等三个品质性状进行了初步研究。在遗

24、传图谱的基础上，用复合区间作图法研究了上述性状的 qtl 位点。 11 个 性状共检测到 54 个 qtls ，每个性状至少检测到 3 个 qtl 位点，全生育期和主茎节数甚至检测到 13 个位点。所有性状都有主效qtl （ r2>0.1 ） ，效应最大的 qtl （ lg1 ，倒伏性）可以解释63.4%的变异。还检测到 3 个 qtl 与蛋白质含量有关 （最多解释10.8%的变异） ， 4 个 qtl与油份含量有关 （最多解释13.9%的变异）。在 25 个连锁群中， 有 14 个连锁群上有qtl 位点，其中 n6-c2 上的 qtl 最多，有 17 个。有 14 个 qtl 位点可以

25、影响多个不同的性状，其中开花日数的 7 个 qtl 都是这样的位点，这7 个位点中，最多的可以影响6 个性状，同一个位点对不同性状的影响是不同的。以高产品种郑92116 和低产品种商951099 杂交组合的 f2 及 f2:3 家系为材料进行农艺性状的 qtl 分析。 该群体由 125 个单株组成， 采用 mapmaker/exp3.0 软件对 143个多态性 ssr 标记进行连锁图的绘制， 其中 26 个标记与其它标记不连锁， 其余 117 个标记构成 28 个连锁群， 该图谱覆盖了大豆1893.7cm ， 标记间平均遗传距离为 16.2cm。 其中 22 个标记间的遗传距离超过30cm,位

26、于17个连锁群。在f2群体中检测到4个与株高有关的qtl ,分布位于连锁群k ， i ， b1， l上，解释变异频率分别为 10.9 ， 1.7 ， 10.3 ， 34.6 ；在连锁群 i 的同一区域，还检测到单株粒重、 单株荚数、 主茎节数的 qtl 各一个， 解释的变异频率分别为 10.2 ， 9.7 和 14.8 ；在连锁群b1 上还检测到一个与生育期有关的 qtl ，解释变异频率12.4 。（ 6）新基因发掘原理与方法研究方面对植物数量性状的遗传体系进行了较深入的研究。对数量性状q t 1检测从3个方面进行了拓展：a）分离世代的拓展，包括r i 1和d h群体，bl: 2和b2: 2群

27、体；b）进行家系重复试验以减少试验误差提高遗传分析的精度；c）由1对主基因十多基因拓展至2对主基因十多基因。1 e c m算法的提出使以上拓展精度大为提高，并成一体系。二、研究水平与创新性本课题研究在大豆抗 smv 基因、 抗食叶性害虫基因、 大豆雄性不育恢复基因方面以及新基因发掘原理与方法（植物数量性状遗传体系）等方面的研究水平在国内均具有领先地位。与国际同类研究相比，在新基因的发掘方面具先进地位，但在相关基因的定位和标记的精度方面尚有一定的距离，需要进一步深入研究。三、实施效果大豆产量和抗性的提高是增加大豆产值、 提高大豆竞争力的重要方面。 本课题发掘了一批与大豆产量、抗性紧密相关的种质，

28、包括株型性状、恢复系、抗大豆花叶病毒、抗食叶性害虫等，构建了遗传研究群体ril ，对相关基因进行了初步标记和定位，同时培育了一批优良的中间材料，此外，还建立了一支水平较高的研究队伍，为高效开展大豆遗传育种准备了重要的理论、物质、和人才基础。四、人才培养、合作交流、数据共享等方面的情况人才培养：本课题实施期间培养硕士 8 人，博士 3 人。 1 人入选“教育部跨世纪优秀人才培养计划” 。合作交流与数据共享：本课题研究开发的主基因+多基因的遗传模型不但在大豆遗传研究上得到广泛应用，还在小麦、玉米、棉花等作物的研究上得到应用，取得良好的效果。如： wang, podlich, cooper 等响应本

29、法研究了测验能力问题，发表于tag 。 30 多位外单位研究者索要分析软件用于学位论文及博士后研究，内容涉及不结球白菜维生素c 和可溶性糖含量，小麦赤霉酸不敏感性，云南稻种小白谷耐冷性指标性状，小麦品种纹枯病抗性，玉米雄穗性状、产量性状，花生种子抗黄曲霉侵染性状，棉花品质纤维性状等的主基因与多基因遗传分析。此外，南京农业大学和中国科学院遗传发育所应用培育的ril群体（科丰1号x南农1138-2 ,njriky ril ）定位了五个与smv抗性有关的基因，而中国农科院品资所应用该群体定位了东北株系 smv3 的抗性基因，并找到与抗性基因紧密连锁的分子标记opn11980/1070 （2.1cm）

30、。再者，山西农业大学正在利用此群体研究与大豆抗旱性有关的 qtl 。取得了较好的合作交流和数据共享效果。五、经费使用情况按照要求专款专用。六、存在的主要问题由于时间的限制， 发掘的新基因及标记仅有部分在育种实践中得到应用， 而且其应用效果还需要更长的时间才能进行评价。此外，还有部分研究结果尚未来得及发表。七、签字盖章同意验收。课题组长签字： 承担单位签字盖章：人活着的意义，就是活得有价值，可惜很多的人把这种价值看得太浅了，认为拥有更多的财富、拥有社会地位、拥有名气就是价值的体现。这种价值是一种虚伪的价值，更经不起时间的考验。因为这个世界不缺少物质，钱也只是我们获取物质的手段罢了。我们真正缺少的

31、是一种精神、一种真理、一种新知与美，因为这些才能贴近我们的情感，贴近人性，才能让我们感动，才能激发我们潜在的感情与能量。与物质有关的东西，最终是会被时间所遗忘的，并会很快地被遗忘。即使被历史留下了，也是因为一种精神而被留下的。这个世界不缺乏物质，更因为很多的人在内心深处，真正想要的并不是金钱利益，而是一种灵魂的归属，可是多数人从来就没有真正地了解过真实的自己，只是把虚假的自己关在了一个笼子里痛苦，把真实的自己放在了笼子外流浪。 我们应该更深层次地去发现自己， 做个自己想要的那个自己。人活着的意义，就是活得有价值，可惜很多的人把这种价值看得太浅了，认为拥有更多的财富、拥有社会地位、拥有名气就是价

32、值的体现。这种价值是一种虚伪的价值，更经不起时间的考验。因为这个世界不缺少物质，钱也只是我们获取物质的手段罢了。我们真正缺少的是一种精神、一种真理、一种新知与美，因为这些才能贴近我们的情感，贴近人性，才能让我们感动，才能激发我们潜在的感情与能量。与物质有关的东西，最终是会被时间所遗忘的，并会很快地被遗忘。即使被历史留下了，也是因为一种精神而被留下的。这个世界不缺乏物质，更因为很多的人在内心深处，真正想要的并不是金钱利益，而是一种灵魂的归属，可是多数人从来就没有真正地了解过真实的自己，只是把虚假的自己关在了一个笼子里痛苦，把真实的自己放在了笼子外流浪。 我们应该更深层次地去发现自己， 做个自己想要的那个自己。聪明人很多时候之所以是聪明人，是因为他们通常的情况下把别人当成了傻子，而他们自己 做的事情，别人看不懂，也不可能会看懂。所以，他们就成了聪明人。但是，我们每一个人 都知道，大千世界里面的人，当然说的是普通人，智力都是差不多的，不是差距很大的。这 就是很现实的事情。在这个时候，聪明人把别人看成了傻子，那么换句话说，就是他们本身 就是出现了智力的问题；否则的话，他们是不可能会像小丑一样在表演，在演着独角戏，还 要自以为别人不可能看懂、或者是无法