植物细胞工程-zhongkai

1、绪论植物组织培养 (plant tissue culture),是指在无菌条件下,将植物体的任何一局部,或 器官、或组织、或细胞、或原生质体,培养在人工配制的培养基上,给予适当的培养环境条 件进行离体培养,使之成为完整的植物体.植物体的任何一局部是指根、茎、叶、花、果以 及它们的组织切片和细胞.外植体(explant):在组织培养中,把由活植物体(in vivo)上切下来以进行培养的那 局部组织或器官.按外植体的来源分为：(1)器官培养(organ culture):是指用植物体的全部或局部器官原基接种于培养基上, 这些培养的组织块可经过脱分化、产生愈伤组织,并进而再经过分化培养成幼苗.(2)

2、胚胎培养(embryo culture ):指以胚珠、幼胚、成熟胚的离体培养,也包括胚乳 培养或子房培养.常用幼胚作材料.(3)组织培养(tissue culture)：分生组织、形成层组织、表皮组织、薄壁组织等和各 种器官组织,以及其培养产生的愈伤组织的培养.(4)细胞培养(cell culture ):通过愈伤组织的液体振荡培养法而获得游离细胞或细胞 群的培养.(5)原生质体培养(protoplast culture ):将植物体细胞的细胞壁,通过酶解使各细胞的原生质体形成游离状态,再进行培养,包括原生质体培养、原生质体融合(细胞杂交)、原生质体的遗传操作.第二章培养基培养基,是外植体生长

3、的营养物质, 通常含有两个组成成分, 即根本培养基和附加成分.根本培养基是只含有无机营养成分和有机营养成分的培养基.根本培养基的配方有几百种,常用的近1020种.完全培养基,是在根本培养基的根底上,根据要求添加一些PGR和复杂的有机物质.(一)根据含无机营养成分的浓度上下,把培养基分为高盐型、中盐型和低盐型.(二)根据培养基凝固情况分为固体培养基和液体培养基1 .固体培养基 参加了适量的凝固剂的培养基,如琼脂、卡拉胶、明胶等.2 .液体培养基 没有参加凝固剂的培养基,主要用于细胞的悬浮培养,抗褐化培养.三、培养基的成分培养基的成分主要可分水、无机盐、有机物、天然复合物、培养体的支持材料等五大类

4、.3 、水 水是植物原生质体的组成成分,也是一切代谢过程的介质和溶媒.它是生命活 动过程中不可缺少的物质.配制培养基母液时要用蒸储水,以保持母液及培养基成分的精确性,预防贮藏过程发变质.大规模生产时可用自来水.但在少量研究上尽量用蒸储水,以防成分的变化引起不良效果.4 、无机元素(inorganic element)1.1 大量元素,指浓度大于 0.5mmol/L的元素,有 N, P, K, Ca, Mg, S等.其作用是：(1) N是蛋白质、酶、叶绿素、维生素、核酸、磷脂、生物碱等的组成成分,是培养 物生长、胚胎发生所必需的物质.在制备培养基时以NO3-N和NH4-N两种形式供给.(3) K

5、对碳水化合物合成、转移、以及氮素代谢等有密切关系.2) P是磷脂的主要成分.而磷脂又是原生质、细胞核的重要组成局部.磷也是ATP、ADP等的组成成分.在植物组织培养过程中,向培养基内添加磷,不仅增加养分、提供能量,而 且也促进对N的吸收,增加蛋白质在植物体中的积累.K增加时,蛋白质合成增加,维管束、纤维组织兴旺,对胚的分化有促进作用.(4) Mg、S和Ca、Mg 是叶绿素的组成成分,又是辅酶的活化剂；S是含S氨基酸和蛋白质组成成分.Ca是构成细胞壁的一种成分,Ca对细胞分裂、保护质膜不受破坏有显著作用,常以CaCl2,2H2O提供.(5)微量元素 指小于0.5mmol/L的元素,Fe、B、Mn

6、、Cu、Mo、Co等.铁是一些氧化酶、细胞色素氧化酶、过氧化氢酶等的组成成分.同时,它又是叶绿素形成的必要条件.培养基中的铁对胚的形成,芽的分化和幼苗转绿有促进作用.B、Mn、Zn、Cu、Mo、Co等,也是植物组织培养中不可缺少的元素,缺少这些物质会导致生长发育异常 现象.高等植物一般不需要Na+,但对喜盐植物重要,C4植物也需要.3 .有机化合物(organic compound ) (1)碳水化合物糖类在培养基中除了作为碳源和能源外,还具有维持培养基一定的渗透压作用,蔗糖约有 1/4-2/5用于保持培养基的渗透压.(2)维生素(vitamin)这类化合物在植物细胞里主要是以各种辅酶的形式参

7、与多种代谢活 动,对生长、分化等有很好的促进作用.虽然大多数的植物细胞在培养中都有合成所必需的 维生素,但在数量上还明显缺乏,通常需参加1至数种维生素,以便获得最良好的生长,主要有VB1 (盐酸硫胺素)、VB6(盐酸毗哆醇卜VPP(烟酸)、VC(抗坏血酸)、有时还使用生物 素、叶酸、VB2等.一般用量为 0.11.0mg/L.有时用量较高.VB1可能是必需的,对愈伤 组织的产生和生活力有重要作用,VB6能促进根的生长,VPP与植物代谢和胚的发育有一定关系.VC有预防组织变褐的作用.(3)肌醇(myo-inositol )又叫环已六醇,在糖类的相互转化中起重要作用. 通常可由磷酸葡萄糖转化而成,

8、还可进一步生成果胶物质,用于构成建细胞壁.(4)氨基酸(amino acid)是很好的有机氮源,可直接被细胞吸收利用.培养基中最常用的甘氨酸.(5)天然复合物它的成分大多不清楚,所以一般应尽量预防使用.4 .植物生长调节剂(plant growth regulator )在培养基的各成分中,PGR或植物激素是培养基的关键物质,其用量虽少,但对外植 体愈伤组织的诱导和器官的分化起着重要的和明显的调节性作用.(1)生长素类(auxin)在组织培养中,生长素主要被用于诱导愈伤组织形成,诱导根 的分化和促进细胞分裂、伸长生长.在促进生长方面,根对生长素最敏感.在极低的浓度下, (10-510-8mg/

9、L)就可促进生长,其次是茎和芽.天然的生长素热稳定性差,高温高压或受光条件易被破坏,在植物体内也易受到体内酶 的分解.组织培养中常用人工合成的生长素类物质.IAA (indo acetic acid)是天然存在的生长素,亦可人工合成,其活力较低,是生长素中 活力最弱的激素,对器官形成的副作用小,高温高压易被破坏,也易被细胞中的IAA分解酶降解,受光也易分解.NAA (naphthalene acetic acid)在组织培养中的启动水平要比 IAA高出34倍,且由于 可大批量人工合成,耐高温高压,不易分解破坏,所以应用较普遍.NAA和旧A广泛应用于生根,并与细胞分裂素互促进芽的增殖和生长.IB

10、A (indolebutyric acid 口引味丁酸)是促进发根水平较强的生长调节物质,不易被过氧 化物酶分解,但价格较贵.2,4-D (2,4-二氯苯氧乙酸)启动水平比IAA高10倍,特别在促进愈伤组织的形成上活力最高,但它强烈抑制芽的形成,影响器官的发育.适宜的用量范围较狭窄,过量常有毒效 应.作用强弱顺序：2,4-D>NAA>IBA>IAA .生长素配制时可先用少量 95%酒精助溶.2,4-D可用0.1mol/L的NaOH或KOH助溶.生长素常配成1mg/ml的溶液贮于冰箱中备用.(2) GA (gibberellic acid)赤霉素有20多种,生理活性及作用的种类

11、、部位、效应等各有不同,培养基中添加的是 GA3,主要用于促进幼苗茎的伸长生长,促进不定胚发育成小植株；赤霉素还用于打破休眠,促进种子、块茎、鳞茎等提前萌发.一般在器官形成后,添 加赤霉素可促进器官或胚状体的生长.一般用量为0.1mg/L.赤霉素溶于酒精,配制时可用少量 95%酒精助溶.赤霉素不耐热, 高压灭菌后将有 70%100%失效,应当采用过滤灭菌法参加.(3)细胞分裂素类(cytokinin)有两类,一类是腺喋吟的衍生物,包括 6-BA (6-芳基 氨基喋吟)、Kt(kinetin冲动素)、Zt(zeatin玉米素)、2-iP (2-异戊烯腺喋吟)等.另外一类是 苯基月尿类,主要有口比

12、效隆(4PU, CPPU)和曝重氮苯基月尿(TDZ).在培养基中添加细胞分裂素有3个作用：1、促进细胞分裂和分化,增强蛋白质的合成,延缓组织的衰老.2、诱导芽的分化,抑制顶端优势,促进侧芽萌发生长.细胞分裂素与生长素相互作用, 当组织内细胞分裂素/生长素的比值高时,诱导愈伤组织或器官分化出不定芽.3、抑制根的分化.因此,细胞分裂素多用于诱导不定芽的分化、茎、苗的增殖,而预防在生根培养时使用.作用的强弱顺序为：TDZ, 4PU> ZT> 2-iP> BA> KT .但在组织培养中常用的是人工合成的、性能稳定的 BA 和 KT.价格(美元 /g) BA 5.25, 2-ip

13、 26, ZT 735, TDZ 2500.生长素与细胞分裂素的比例决定着发育的方向,是长愈伤组织、长根还是长芽.如为了促进芽器官的分化,应除去或降低生长素的浓度,或者调整培养基中生长素与细胞分裂素的 比例.PGR的使用甚微,一般用 mg/L表示浓度.在组织培养中生长调节物质的使用浓度,因 植物的种类、部位、时期、内源激素等的不同而异,一般生长素浓度的使用为0.055mg/L,细胞分裂素0.0510mg/L.5.培养材料的支持物(1)琼脂(agar)在固体培养时琼脂是最好的固化剂.琼脂是一种由海藻中提取的高 分子碳水化合物,本身并不提供任何营养.6.抗生物质(antibiotic)抗生物质有青

14、霉素、链霉素、庆大霉素等,用量在 520mg/L之间.添加抗生物质可防 止菌类污染,减少培养中材料的损失,尤其是快速繁殖中,常因污染而丢弃成百上千瓶的培养物,采用适当的抗生素便可节约人力、物力和时间.尤其对大量通气长期培养,效果更好.7、抗氧化物(antioxide)植物组织在切割时会溢泌一些酚类物质,接触空气中的氧气后,自动氧化或由酶类催化氧化为相应的醍类,产生可见的茶色、褐色以致黑色,这就是酚污染.这些物质渗出细胞外就造成自身中毒,使培养的材料生长停顿,失去分化水平,最终变褐死亡.8、活性炭(active carbon)活性炭为木炭粉碎经加工形成的粉沫结构,它结构疏松,孔隙大,吸水力强,有

15、很强 的吸附作用,它的颗粒大小决定着吸附水平、粒度越小,吸附水平越大.茎尖初代培养,参加适量活性炭,可以吸附外植体产生的致死性褐化物,其效力优于VC和半胱氨酸；在新梢增殖阶段,活性炭可明显促进新梢的形成和伸长,但其作用有一个 阀值,一般为0.1%0.2% ,不能超过0.2%.活性炭在生根时有明显的促进作用,其机理一般认为与活性炭减弱光照有关,可能是由于根顶端产生促进根生长的IAA,但IAA易受可见光的光氧化而破坏,因此活性炭的主要作用就在于通过减弱光照保护了IAA ,从而间接促进了根的生长,由于根的生长加快, 吸 收水平增强,反过来又促进了茎、叶的生长.此外,在培养基中参加 0.3%活性炭,还

16、可降低玻璃苗的产生频率,对预防产生玻璃苗有良好作用.活性炭在胚胎培养中也有一定作用,如在葡萄胚珠培养时向培养基参加0.1%的活性炭可减少组织变褐和培养基变色,产生较少的愈伤组织.但是,活性炭对物质的吸附是无选择性的,既吸附有害物质,也吸收有利物质第二节培养基的制备一、母液stock solution 的配制和保存在植物组织培养工作中,配制培养基是日常必备的工作.为简便起见,通常先配制一系列母液,即贮备液.所谓母液是欲配制液的浓缩,这样不但可以保证各物质成分的准确性及配制时的快速移取, 而且还便于低温保藏. 母液配制时可分别配成大量元素、微量元素、铁 盐、有机物和PGR类等.配制好的母液瓶上应分

17、别贴上标签,注明母液名称、配制倍数、日期及配1L培养基时应吸取的量.二、培养基的配制1 .琼脂溶解 用瓷量杯装蒸储水或自来水 300ml,参加琼脂条或琼脂粉5-7g,边加热 边搅拌,预防糊底.旺火煮开,再用文火加热,直至琼脂全部融化即清澈见底为度.2 .称好20-30g蔗糖,趁热参加瓷量杯中溶解.3 .按表用量筒分别移取大量元素母液1、2、3 10ml,用专一对应的移液管分别吸取微量元素母液1 5ml、2 0.5ml、铁盐母液5ml、有机物母液5ml,均置入1烧杯中,假设不加任何 激素,那么为 MS.培养基；假设需加激素按配方移取激素母液即可.将所有母液的混合液参加 瓷量杯中,定容至 1000

18、ml.4 .pH调整 培养基配好后,用 0.1mol/L的NaOH或HCI液将培养基的pH值调整为6.0 左右.调后注意一定要摇动均匀,还要注意酸或碱液不要放置时间太久.三、培养基的分装与灭菌培养基合成后要趁热分装,100ml的容器约装入2530ml培养基,即1L培养基约装33-40 瓶左右.太多那么浪费培养基,太少不易接种和影响生长.但要根据培养对象来决定.如果培养时间较长时,应适当多装培养基,生根等短期培养时,可适当少加培养基.分装时不要把 培养基弄到管壁上,以免日后污染.装后用封口材料包扎瓶口,扎口后,写上培养基种类, 准备灭菌,注意不能放置时间过长,以免产生污染.培养基用高压灭菌.灭菌

19、好的培养基不要放置时间太长,12周用完,最多不能超过 1个月.第三章植物材料与处理第一节植物材料的选择与处理二、母树株和外植体的预处理植物材料的预处理,近来被重视和研究的较多,国际上把这一阶段定名为Stage O,目的有二,其一是为获得比拟清洁的材料, 其二是为了改变母株或外植体的生理状态,使接种后能更好地生长分化.一栽培治理1 .不要连作 以免土传病虫害的加剧,特别是对地下球茎、鳞茎或根茎等作材料的,危 害更大.此外,连作还会有矿质营养元素缺乏、作物根系分泌物的毒性危害等.2 .基质或无土栽培 最好使用蛭石、珍珠岩、泥炭等基质进行栽培,如果是土壤作基质, 在栽种前要用药物或蒸汽进行灭菌处理.

20、3 .施肥和灌溉限制 基肥应在取材前12个月进行,追肥应使用化肥,不要使用喷灌, 预防将水、肥浇到植株上,以保证田间的清洁,减少病菌活动的时机.4 .病虫害防治 以保证植株的健壮生长,特别是临近取材前,更应用杀菌剂、抗生素处 理.如在采集外植体前用敌菌丹captatol或异菌月尿iprodione杀菌剂处理田间的披散山龙眼母树,使污染从对照的 90%减少至14%oMondal等在采集材料前,向番木瓜植株喷1000mg/L 的庆大霉素gentamycin,采芽后再用庆大霉素进行处理.5 .适宜的环境 要求场地开阔、阳光充足、通风透气.最好在能限制光照、温度、湿度 的温室或人工气候室内栽培,创造生

21、长发育的最适条件,促使植物的生长代谢活泼,外植体的生理状态得到改善.二田间母株的处理1 .光照1.1 光周期对光周期敏感的植物,在限制光周期条件下培养,可以得到对培养条件反映 更稳定的外植体.如高温和长日照处理秋海棠植株叶片有利离体条件下的分化.1.2 光质 光质对矮牵牛的生长有影响,最后一次是红光,植株分枝多,远红光那么不分枝,前者的叶片在培养时芽的分化比后者要多3倍.1.3 黑暗或黄化etiolation 长时间的黄化处理,有利于板栗、苹果成年树的茎尖培养 或侧芽的分化,黑暗被广泛用于木本植物母树的预处理,以减少褐化和内源菌的污染.2 .温度2.1 低温促进花药培养如大白菜花药培养中在 3

22、-5C下48-72hr,可以促进胚状体形成； 打破休眠 如某些鳞茎、木本植物的种胚和芽存在休眠期,需要低温处理.如花棱草种子需 要低温休眠,胚培养时需给予2周6c的处理.预防酚污染,如核桃茎段机关5c 12-24hr处理可减少褐变.2.2 高温 脱去植株的局部病毒.3 .PGR的预处理对母树的处理一般用喷洒,有时也用注射的方法.木本植物用100-1000mg/L 6-BA处理 可提升茎尖培养的成功率.用CCC处理番茄可使外植体芽的分化大量增加.将矮牵牛叶片在400mg/LKT 中浸5s-10min ,可较大地促进芽分化.三从田间或野外采集后的材料处理1 .在温室或人工条件下培养一段时间,或在树

23、上套袋,使用新生的局部.2 .木本植物枝条取回后用水冲洗干净后插入无糖的培养液或自来水中,使其发枝,然后 以这种新抽的嫩枝作为外植体.一些木本植物的茎尖外植体用催芽溶液forcing solution 根本成分为八羟基唾咻8-hydroxyquinole citrate 200mg/L , 6-BA100-800mg/L 和 GA10-100mg/L,蔗糖2%处理,常可提升培养的成功率.一般做法是将木本植物的外植体有forcingsolution处理一段时间24hr再接种到培养基上.3 .黄化处理 在无菌条件下对采自田间的枝条进行暗培养,待抽出徒长的黄化枝条时取 材,如使用仙客来黄化的叶柄进行

24、培养时,可限制内生菌的污染.4 .热击Langens等将美丽百合Lilium speciosum的鳞茎外植体放入试管中进行43c热击处理,罗伯利械的休眠芽进行42.5 C或45c热击处理,可有效地减少内生菌污染.5 .用抗生素进行预培养朱光廉对相思树的芽和茎段灭菌时,用皂液刷洗和乙醇杀菌后,转入0.2%苯菌灵benlnete和0.2%链霉素溶液中,在摇床上振荡过夜.湿热灭菌 即高压蒸汽灭菌,是最有效的一种方法.布类如工作服、口罩、胶塞、金属器械、玻璃器皿以及某些培养用液都可用此法灭菌.培养基在制备后的 24h内完成灭菌工序.第二节外植体灭菌1 .茎尖、茎段、叶片灭菌的方法(1)植物的茎、叶局部

25、多暴露在空气中,易受到泥土、肥料中的杂菌污染.将采来的 材料除去不用的局部, 外表不光滑或长有绒毛难以洗净的材料,要用毛刷充分刷洗. 把材料切割成适当大小,即灭菌容器能放入为宜.置自来水龙头下流水冲洗几min至数小时,冲洗时间视材料清洁程度而宜.易漂浮或细小的材料,可装入纱布袋内冲洗. 流水冲洗在污染严重时特别有用.洗时可参加洗衣粉清洗, 然后再用自来水冲净洗衣粉水. 洗衣粉可除去轻度附着在植物 外表的污物,除去脂质性的物质,便于灭菌液的直接接触.当然,最理想的清洗物质是外表活性物质一吐温.洗后的材料用滤纸吸干水分.(2)对材料的外表浸润灭菌.要在超净台或接种箱内完成,准备好灭菌的烧杯、玻璃

26、棒、75%酒精、灭菌液、无菌水等.用 75%酒精浸泡1030s, 一些特殊的材料,如果实、 花蕾、包有苞片、苞叶等的孕穗,多层鳞片的休眠芽等等,以及主要取用内部的材料,那么可 只用75%酒精处理稍长的时间.处理完的材料在无菌条件下,待酒精蒸发后再剥除外层, 取用内部材料.(3)用灭菌剂处理.外表灭菌剂的种类较多,可根据情况选取12种使用见表4-5.上述灭菌灭剂应在使用前临时配制,氯化汞可短期内贮用.灭菌时,把植物材料转放到烧杯或其他器皿中,记好时间,倒入灭菌溶液,不时用玻璃棒轻轻搅动,以促进材料各局部与灭菌溶液充分接触,驱除气泡,使灭菌彻底.在快到时间之前12min,开始把灭菌液倾入一备好的大

27、烧杯内,要注意勿使材料倒出,倾净后立即倒 入无菌水,轻搅刷洗.灭菌时间是从倒入灭菌液开始,至倒入无菌水时为止.记录时间还便 于比拟灭菌效果,以便改正.灭菌液要充分浸没材料,宁可多用些灭菌液,切勿勉强在一个体积偏小的容器中使用很多材料灭菌.在灭菌溶液中加吐温-80或Triton X效果较好,这些外表活性剂主要作用是使药剂更易 于展布,更容易浸入到灭菌的材料外表.但吐温参加后对材料的伤害也在增加,应注意吐温的用量和灭菌时间,一般参加灭菌液的0.1-0.5%.最后一步是用无菌水刷洗,刷洗要每次3min左右,视采用的灭菌液种类,刷洗 310次左右.无菌水刷洗作用是免除灭菌剂杀伤植物细胞的副作用.2 .

28、其他外植体灭菌的方法(1)果实和种子的消毒视果实和种子的清洁程度,先用自来水冲洗1020min,甚至更长时间.再用 75%酒精迅速漂洗一次.果实用 2%NaClO溶液浸10min,后用无菌蒸储 水冲洗23次后,就可取出果实内的种子或组织进行培养.种子那么先要用 10%NaClO溶液 浸泡2030min,对难以消毒的还可以用 0.1%汞或1%2%滨水消毒5min.(2)根及地下部器官的消毒由于它们长在土壤中,可预先用自来水冲洗、软毛刷刷洗,再用纯酒精漂洗后,置于0.1%0.2%升汞浸510min或2%NaClO溶液浸泡1015min , 然后以无菌水冲洗 3次,用无菌滤纸吸干水分后即可接种.假设

29、条件许可,还可将材料浸入消毒液中进行抽气减压,以帮助消毒液渗入,到达彻底灭菌的目的.(3)花药的消毒通常用于组织培养的花药,实际上多未成熟,由于它的外面有花萼、花瓣或颖片保护,根本上处于无菌状态,故只需将整个花蕾或穗消毒即可以了.一般用75%酒精浸泡数秒钟,然后用无菌水冲洗23次,再在漂白粉上清液中浸泡10min,经无菌水冲洗23次即可接种.3 .难灭菌材料的特殊方法(1)间隙灭菌法 按常规灭菌后,将外植体培养在一不含PGR和维生素的简单培养基上20-24hr,取出,再消毒一次,接入正式培养基中.(2)预培养法将植物材料放入混和抗生素和杀菌剂的溶液中振动培养4-12小时,然后再按常规灭菌程序消

30、毒.(3)减压抽滤法 将植物材料放入杀菌剂中,减压抽去植物组织中的气体,使杀菌剂更容易进入组织,维持数 min后,取出再按常规方法消毒.(4)培养基中参加抗生素、杀菌剂法在培养基中参加少量的抗生素10-20mg/L,能有效地抑制细菌的生长；参加一些杀菌剂如甲基托布津、多菌灵等,也有一定的杀菌作用.外植体大小目前许多植物的茎尖培养说明,外植体(茎尖)越小成活率越低.因此除非用于去除 病毒,否那么不宜将外植体切得太小.在甘蔗心叶愈伤组织的培养中发现,材料大小对分化生长有明显的影响(表31).通常情况下,叶片、花瓣等面积约为5mm2,茎段那么长约0.5-1.0cm.但并不是说外植体越大越好,外植体过

31、大,不易彻底灭菌.如木薯,只有在 2mm以上长的茎尖才能形成完整植株； 长度不到2mm的茎尖仅产生愈伤组织或根.但脱毒培养多用较小的外植体,如麝香石竹用 2mm大小的外植体时只长根,而用 7.5mm大小的外植体培养那么仍有病毒存在.此外,外植 体的大小与褐变及玻璃化有关.如金冠苹果茎尖小于0.5mm时褐变严重；当茎尖长度在515mm时褐变较轻,成活率可达 85% (蒋迪军、牛建军,1992).第三节无菌操作技术一、接种前的准备接种时由于有一个敞口的过程,所以是极易引起污染的时期,这一时期主要由空气中的细菌和工作人员本身引起.为了做好接种前的准备工作,宜制定出分门别类的操作卡片,包括操作程序(P

32、rotacol / Procedure)卡片,如过滤灭菌液参加培养基的分装、外植体接种、 继代培养等等.各卡片上记有需用器材和物品名称、要求及数量等,这对初学者尤为重要.1 .接种室内消毒保持定期用1%3%的高镒酸钾溶液对设备、墙壁、地板等进行擦洗,并用甲醛熏蒸接种室.2 .洗手和着装接种员的头发、衣服、手指都不同程度地带有许多杂菌,先剪除指甲,用 肥皂洗净双手,最好再用 0.2%新洁尔灭溶液擦洗或浸泡 10min;在缓冲间换好专用实验服, 戴上帽子,并换穿拖鞋等；3 .培养皿、酒精灯和其他工具应事先放在超净工作台上,并用75%酒精擦洗或喷洒消毒.工作台面上的用品要合理布局,原那么上应是右手使

33、用的东西放在右侧,左手用品放在左侧, 酒精灯置于中央.如图.4 .在接种前翻开超净工作台的风机,接种前用紫外灯照射 20-30min,接种室空间大的需用30-50min.超净工作台也有紫外灯,主要用于消毒台面上用品,对台面流动的空气无意 义.紫外灯照射后15min,操作人员方可入内.5 .在使用期间用75%的酒精或3%的来苏儿喷雾,使使空气中的细菌和真菌抱子随灰尘 的沉降而沉降.6 .上工作台后,经常用 75%酒精棉球擦拭双手,特别是指甲处.7 .超净工作台面要用 0.2%新洁尔灭或75%酒精擦洗,使超净工作台对接种环境污染的 限制更有成效.8 .点燃酒精灯或煤气灯,先用酒精棉球擦拭接种工具,

34、再将镣子和剪刀从头至尾过火一 遍,然后反复过火尖端处,对培养皿要过火烤干.9 .工作人员的呼吸所产生的污染,主要是在接种时谈话或咳嗽所引起的,因此,在操作时应禁止谈话并应戴上口罩.注意：不要把东西迎面堆的太高,以免挡住气流.二、接种接种是将已灭菌好的根、茎、叶等离体器官,经切割或剪裁成小段或小块,放入培养基 的过程.以上已表达接种前的材料外表的灭菌消毒,现将接种前后的程序连贯地介绍.1 .将初步洗涤及切割的材料放入烧杯,带入超净台上,用消毒剂灭菌,再用无菌水冲洗,最后沥去水分,取出放置在灭过菌的4层纱布上或滤纸上.2 .材料吸干后,一手拿镣子,一手拿剪刀或解剖刀,对材料进行适当的切割.如叶片切

35、 成0.5cm见方的小块；茎切成含有一个节的小段. 微茎尖要剥成只含12片幼叶的茎尖大小, 需要在双筒实体显微镜下放大操作.别离工具一定要放好, 工具要锋利且切割动作要快,防止挤压,以免使材料受损伤而导致培养失败.注意：接种时要预防交叉污染发生,因此刀和镣子等接种工具每次使用前都应放入75%或95%酒精中浸泡,然后在火焰上反复灼烧,放凉后才接种,否那么会烫伤外植体.使 用后的工具仍然插入盛有酒精的瓶中.在接种过程中要经常灼烧接种器械,预防交叉污染.3用灼烧灭菌过的器械将切割好的外植体插植或放置到培养基上.具体操作过程是： 左手拿试管或三角瓶,用右手轻轻取下包头纸,以免纸上的灰尘飞扬,造成污染.

36、将试管几乎水平拿着,使试管口靠近酒精灯火焰, 并将管口在火焰上方转动, 使管口里外灼烧数秒钟. 假设用棉塞盖口,可先在管口外面灼烧,去掉棉塞,再烧管口里面.注意,翻开瓶盖时,最大污染的时机是管口边缘的微生物落入管内,由于试管或容器在贮存期间积累了少量的灰尘；另外,灭菌冷却时,在管口形成负压,当开盖时,空气进入而 带入灰尘.所以,试管应斜拿,利用酒精灯火焰附近气流上升,以减少灰尘的落入；开盖前 要用火焰转动灼烧瓶口,把灰尘固定在瓶口上,以杀死菌类.然后用镣子夹取一块切好的外植体送入试管内,轻轻插入培养基上.假设是叶片直接附在培养基上,以放13块为宜.至于材料放置方法,茎尖、茎段要正放尖端向上或横

37、放, 叶片要将叶背接触培养基叶背比叶表有更多的气孔,利于吸收水分和养分,其他尚无统一要求.放置材料数量现在倾向少放,通过统计认为：对外植体每次接种以一支试管放一枚 组块为宜,这样可以节约培养基和人力,一旦培养物污染可以抛弃.操作时动作要准确敏捷,但不必太快,以防空气流动,增加污染时机.不能用手触及已消毒器皿,如已接触,要用火焰灼烧消毒触及部.接完种后,将管口在火焰上再灼烧数秒钟.并用棉塞,塞好后,包上包口纸,包口纸里面也要过火.所有材料接种完毕,做好标记,注明接种植物和处理名称,接种日期.注意接种时,接种员双手不能离开工作台,接种完毕后要清理干净工作台,可用紫外灯灭菌30min.假设连续接种,

38、每 5天要大强度灭菌一次.第四章灭菌与无菌操作常用的灭菌方法可分为物理和化学两类,即：物理方法如干热烘烧和灼烧、湿热常压或高压蒸汽、射线处理紫外线、超声波、微波、过滤等；化学方法是使用升汞、甲醛、过氧化氢、高镒酸钾、来苏儿、漂白粉、次氯酸钠、抗菌素、酒精等化学灭菌剂.这些方法 和药剂要根据工作中的不同材料不同目的适中选用.一物理灭菌法1 .射线灭菌 主要是指使用6°Co、X射线和加速器等发出的辐射,能消毒灭菌,适用于 灭菌量大和不适合做高压或过滤灭菌的培养器皿,如塑料制品.2 .紫外线灭菌 是目前各实验室常用的灭菌法,方便,效果好.适用接种室、超净台上 或接种箱里的灭菌.适用空气、操

39、作台外表和一些不能使用其他方法消毒的培养器皿如塑料培养皿,培养板等的灭菌.紫外线灭菌是利用辐射因子灭菌,细菌吸收紫外线后,蛋白质和核酸发生结构变化,引起细菌的染色体变异,造成死亡.紫外线的波长为200300nm,其中以260nm的杀菌水平最强.培养室的紫外线灯应距离地面2.5m,使每cm2有0.06微瓦能量的照射,才能发生有效的灭菌作用.经紫外线照射20、40、60min后,空气中细菌数分别下降 71%, 79%, 86%,说明用紫外线灭菌,经一定时间后能杀灭空气中的大局部细菌.其缺点是产生臭氧,污染空气,对身体有害.由于紫外线的穿透物质的水平很弱,3-5mm厚的玻璃就能阻挡射线；射线照射不到

40、的部位起不到灭菌作用.故灭菌时,物品不宜相互遮挡.紫外线对细胞、试剂和培养液都有不良影响,对人皮肤和眼睛也有伤害, 应该预防边照射边进行操作.3 .微波炉红外线灭菌适用少量的培养基灭菌,但灭菌的时间、沸腾问题的解决和灭菌的效果有待实验确定.4 .干热灭菌 主要用于玻璃器皿的灭菌.干热灭菌后的器皿枯燥,易于贮存.干热灭菌是利用烘箱加热到160180 c的温度来杀死微生物.由于在干热条件下,细菌的营养细胞的抗热性大为提升,接近芽抱的抗热水平,通常采用170c持续90min来灭菌.干热灭菌的物品要预先洗净并枯燥,工具等要妥为包扎, 以免灭菌后取用时重新污染.包扎可用耐高温的塑料. 灭菌时应渐进升温,

41、 到达预定温度后记录时间.烘箱内放置的物品的数量不宜过多,以免阻碍热对流和穿透,到指定时间断电后,待充分冷凉60c以下,才能翻开烘箱,以免因冷空气骤然进入引起玻璃炸裂,影响灭菌效果.干热灭菌热传导慢, 能源消耗太大,浪费时间.金属器械如解剖刀、剪刀等,高温会使刀口钝化；橡胶、塑料制品也 不能使用该法.5 .湿热灭菌 即高压蒸汽灭菌,是最有效的一种方法.布类如工作服、口罩、胶塞、金属器械、玻璃器皿以及某些培养用液都可用此法灭菌. 培养基在制备后的 24h内完成灭菌 工序.高压灭菌的原理是： 在密闭的蒸锅内,其中的蒸汽不能外溢,压力不断上升,使水的沸点不断提升,从而锅内温度也随之增加.在 0.1M

42、pa的压力下,锅内温度达 121 C.在此蒸 汽温度下,可以很快杀死各种细菌及其高度耐热的芽抱.细菌的芽抱在 100c的沸水中能生存好几个小时.注意应完全排除锅内的空气,使锅内全部是水蒸汽, 灭菌才能彻底.高压灭菌放气有几种不同的做法,但目的都是要排净,使锅内均匀升温,保证灭菌彻底.常用方法是：关闭放 气阀,通电后,待压力上升到 0.05Mpa时,翻开放气阀,放出空气,待压力表指针归零后, 再关闭放气阀.关阀再通电后,压力表上升到达 0.1Mpa时,开始计时,维持压力0.10.15Mpa, 20min.高压灭菌前后的培养基,pH值下降0.20.3单位.高压后培养基pH值的变化方向和幅度取决于多

43、种因素.在高压灭菌前用稀碱适当调高pH值.培养基成分单一时和培养基中含有高或较高浓度物质时,高压灭菌后的pH值变化幅度较大,甚至可大于2个pH值单位.环境pH值的变化大于0.5单位就有可能产生明显的生理影响.高压灭菌通常会使培养基中的蔗糖水解为单糖,从而改变培养基的渗透压.在8%20%蔗糖范围内,高压灭菌后的培养基渗透压约升高0.43倍.培养基中的铁在高压灭菌时会催化蔗糖水解, 可使15%25%的蔗糖水解为葡萄和果糖. 培养基pH值小于5.5,其水解量更多,培养基中添加 0.1%活性炭时,高压下蔗糖水解大大 增强,添加1%活性炭,蔗糖水解率可达 5%.实验中,应在瓶盖上进行标记,以预防不同培养

44、基的混淆.如用一般墨水在灭菌前写上, 灭菌后容易被消除掉.可用CoCl 2.6H2O 2g、30%HCl 10ml、蒸储水88ml配成墨水写字,经高温后可现出字迹.6 .灼烧灭菌 适用金属器械类.在无菌操作时,把镣子、剪刀、解剖刀等浸入95%的酒精中,使用之前取出在酒精灯火焰上灼烧灭菌.冷却后,立即使用.操作中可采用250或 500ml的广口瓶,放入95%的酒精,以便插入工具.7 .过滤灭菌 一些生长调节剂,如赤霉素、玉米素、脱落酸和某些维生素是不耐热的, 不能用高压灭菌处理,通常采用过滤灭菌方法.在无菌条件下,当已经灭菌过的培养基冷却至50c后,参加不耐热的物质.(二)化学灭菌法1 .灭菌方

45、法(1)熏蒸灭菌用加热燃烧、氧化等方法,使化学药剂变为气体状态扩散到空气中,以杀死空气和物体外表的微生物.这种方法简便,只需要把灭菌的空间关闭紧密即可.熏蒸时,房间可预先喷湿以增强效果.(2)喷雾灭菌一些物体外表可用一些药剂涂擦、喷雾灭菌,如工作人员的皮肤、操作台外表、无菌室内的桌椅、 墙面、空气和植物材料外表等.化学制剂有来苏儿 (1%2%)、新洁尔灭(0.25%1%)、过氧乙酸和75%的酒精等.(3)浸泡灭菌 从外界或室内选取的植物材料,都不同程度地带有各种微生物.这些污 染一旦带入培养基, 便会造成培养基污染.因此,植物材料常用化学灭菌剂浸泡,进行外表灭菌处理.2 .灭菌剂种类、作用与评

46、价化学灭菌剂的种类很多,它们使微生物的蛋白质变性,或竞争其酶系统,或降低其外表 张力,增加菌体细胞浆膜的通透性,使细胞破裂或溶解.一般说来,温度越高,作用时间越 长,杀菌效果越好.另外,由于灭菌剂必须溶解于水中才能发挥作用,所以要制成水溶状态,如升汞与高镒酸钾.还有灭菌剂的浓度一般是浓度越大杀菌水平越强,但石炭酸和酒精例外.石炭酸(C6H 5OH), 3%-5% , 5%以上对感觉神经有麻痹作用.(1)熏蒸剂 甲醛,常用熏蒸剂,熏蒸时,房间关闭紧密,按 58ml/m3用量,将甲醛 置于广口容器中,加 24g/m3高镒酸钾促使甲醛迅速挥发,熏蒸密闭 1224hr.高镒酸钾2%5%,杀菌力很强,酸

47、性条件下能提升其杀菌作用.冰醋酸也可进行加热熏蒸,但效果不如甲醛.乳酸蒸汽对空气消毒十分有效,但刺激味较强,常用于无菌室内或周围环境的定期消毒.消毒时,将少许乳酸放入一平皿或开口较大的容器内,下方用酒精灯加热, 使乳酸挥发弥漫整个室内.(2)喷雾或擦拭消毒剂来苏儿对皮肤有刺激性,不宜用作皮肤的消毒剂；新洁尔灭(澳代十二烷基二甲基卞基胺),阳离子型外表活性杀菌剂,使用浓度0.1%0.25%,通过阳电荷结合破坏菌体外膜结构,导致蛋白质变性.常用于器械、皮肤和 操作外表的浸泡和擦拭消毒.酒精(75%),和新洁尔灭一样,也是实验室常用的杀菌剂,但不能杀灭真菌.过氧乙酸CH3COOOH ,在0.5%浓度

48、10min即可将芽抱杀灭, 消毒水平较强, 可用作各 种物品的外表消毒. 使用时用水稀释,用喷洒和擦拭方法消毒.但稳定性差,稀释液有效期 短,只能维持3天左右.(3)浸泡杀菌剂75%酒精 具有较强的穿透力和杀菌力,常作为外表灭菌的第一步,它具有浸润和灭 菌的双重作用,但不能到达彻底的灭菌,必须结合其他药剂灭菌.有时,为了提升乙醇的杀菌效果,可在乙醇溶液中参加 0.1%的酸或碱,由于 H+和OH-可改变细胞表膜带电荷的性质而增加膜透性,提升乙醇的杀菌效果.由于酒精具有使植物材料外表被浸湿的作用,加之 75%酒精穿透力强,能使植物组织内的物质溶解,蛋白质变性,杀伤植物细胞,所以浸润时 间不能过长,

49、通常外植体浸入1530s即可.升汞Hgcl2是有剧毒的重金属盐杀菌剂,其杀菌原理是Hg+可与带负电荷蛋白质结合,使菌体蛋白变性,酶失活.其使用浓度为 0.1%0.2%, 一般浸泡612min ,就可有效地 杀死附着在外植体外表的细菌及真菌芽抱,是一种极有效的杀菌剂,灭菌效果极好.但用升汞灭过菌的外植体材料要用无菌水反复屡次冲洗,洗去残留的汞,否那么对培养的外植体会产生毒害作用.通常用无菌水冲洗不得少于5次,每次不少于3min,以尽量去除残毒.次氯酸钠NaclO用市售的“安替福民配制 2%10%的NaClO ,灭菌时只需浸泡 530min ,再用无菌水冲洗 45次即可.由于它可分解出具杀菌作用的

50、氯气,灭菌处理后易 于除去,不留残留,既有强杀菌力,又对植物无害,是组培中常选用的杀菌剂之一.漂白粉 一种常用的低毒有效的消毒剂,一般含 10%20% 重量/体积的Ca ClO 2使用浓度一般为 5%10%或其饱和溶液.它易吸潮散失有效氯而失效,故要密封、避光、 枯燥贮藏,但贮藏不能超过一年,应随配随用.双氧水或称过氧化氢 是分解中释放原子态氧来杀菌的,常用 6%12%的双氧水溶液处 理外植体材料,灭菌效果也相当好,加上该药剂在外植体外表容易除去, 又不会损伤外植体, 通常用于叶片的灭菌.新洁尔灭 是一种广谱外表活性灭菌剂.它对绝大多数植物外植体伤害很小,效果很好.通常使用1: 200稀释液,

51、刷洗、浸泡外植体 30min,甚至可更长的时间.在用上述药剂进行接种材料的灭菌处理时, 为了使休养菌剂湿润整个组织, 还需在药液 中参加润湿剂.如参加数滴或直至 0.1%的湿润剂吐温Tween 80或吐温20.有时还可以 用磁力搅拌、超声振动等方法使杀菌剂到达外植体外表,灭菌彻底.虽然在植物组织培养中通常都以升汞或次氯酸钠来进行外植体灭菌,但二者在常规灭菌剂量范围内均可对植物材料产生多种生理影响.如汞会抑制IAA对细胞壁的影响,而NaClO会影响灭菌的黄瓜种子,其发芽系数低于用升汞灭菌的,但苗高、苗重、子叶重、子叶开度、叶绿素含量和可溶性蛋白质含量都比升汞灭菌时高.因此,在选择消毒剂时,除了考

52、虑灭菌效果和去除残留物的难易程度外,还应适当注意灭菌剂对外植体的生理影响.三抗菌素消毒主要用于培养基.第六章植物组织培养中的污染和预防“污染概念应是：凡混入培养环境中对组织和细胞生存有害的成分都应视为污染.因此,污染应包括以下两大类；微生物：真菌、细菌、酵母菌、支原体和病毒；通常说的污染主要是前三者,因微生物来源不同,又分为外源菌污染和内源菌污染.化学物：主要是指醍引起的褐化,又叫酚污染.一、污染的途径一空气接种室和培养室的空气是扩散微生物的主要途径.二培养器皿和培养基培养器皿和容器洗刷不干净残留污染物,培养基消毒不彻底,培养基放置时间过久积 累灰尘,都可引入有害物.三操作操作中马虎、接种动作

53、不准确、灭菌观念不强,使用的器械沾染了微生物,或封瓶口 时不严,都可发生污染.四外植体 初代培养中外植体污染比拟普遍,有的是消毒时间不够,有的是含菌量 多或体内带菌,难于灭菌.二、细菌性污染1.病症 培养基外表或培养物附近出现粘液状菌落,或浑浊的水迹状痕迹,或有泡沫的 发酵状情况.有的菌落有红、黄、绿等色素,有的色素溶于水,间有不溶于水,散布于培养 基的.3 .污染原因外植体消毒不彻底；培养基灭菌时,高压灭菌锅末排尽冷空气,灭菌压力不够,或温度不够,或持续时间 不够；使用了末消毒好的工具,手接触了外植体或器皿的边缘等交叉感染所致；人呼吸时排出或头发洒落的细菌.4 .预防对策培养基灭菌后在培养室

54、放置 23天观察有无细菌感染的菌落；接种前,剪指甲,将手用肥皂洗干净,再用70%酒精擦洗；预防交叉感染,工具用一次即需消毒一次；操作时,应戴消毒好的口罩和工作帽,穿消毒好的工作服,并严禁谈话.另外,培养过程中,蚂蚁和空气中肉眼看不见的蛾虫爬入培养容器中也会导致细菌污染. 要用杀蛾剂处理培养室.三、真菌性污染1 .病症 一般接种后35天就可发现菌丝,随即在培养基或培养物上发现不同颜色的 菌落.3 .污染原因接种室空气含真菌抱子大环境污染；瓶口边缘的灰尘；取放瓶塞盖时扬起或由于负压带入的灰尘和抱子；超净工作台因使用时间过久或长时间没使用导致滤器堵塞.4 .预防对策接种室经常处于工作状态,定期用40

55、%甲醛和高镒酸钾进行熏蒸消毒；每次使用接种室和超净工作台先用紫外灯杀菌20min,再用75%酒精喷雾降尘；用75%酒精擦洗容器外部,再放入超净工作台上；接种时,动作要轻,瓶子斜拿,瓶口放在火焰上,利用气流上升的原理,以阻止空气 中抱子落入瓶内.经常清洗滤器,必要时更新.一、褐化现象的机理酚类phenol物质被氧化成有毒的苯醍quinones,成棕褐色或暗褐色,它们会逐渐 扩散到培养基中,抑制其它酶的活性,毒害整个外植体组织.又称为酚污染phenol pollution o 二、褐化现象的原因在自然条件下,细胞中的酚和醍之间保持一种动态平衡,酚氧化酶类处于抑制状态,醍类物质保持在一个较低的水平.

56、在适宜的pH、温度和水活性条件下,酚类物质、酚氧化酶和氧气聚合在一起时发生氧化反映.当植物组织被切割、接种时的机械损伤或组织的老化、 病变使酚氧化酶激活,都会引起褐变.1.酚类物质2.酚氧化酶四、减少褐化现象的举措1 .对母株的处理苹果M 9褐变预防最为有效的处理是：对母株遮光,母株经温室栽培后外植体在液体培 养中短期处理,外植体采自热处理母株.外植体在4c下处理18小时也能减少褐变.2 .切取外植体要求为了使细胞的伤害降到最低,用于切割的解剖刀必须尽可能地锋利. 解剖刀的消毒不能过分灼烧,由于过热会使刀刃变钝.操作时动作敏捷,随切随接,以减少 伤口在空气中暴露的时间.3 .对外植体预处理低温处理高温处理用抗氧化剂或吸收剂预处理 预培养4 .选择适宜的培养基及培养条件5 .在培养基中参加抗氧化剂或吸收剂6 .连续转移外植体第七章 植物组织培养的应用原理所谓植物细胞的全