初识转基因植物筛选试剂

1、初识转基因植物筛选试剂 摘 要 随着植物基因工程技术的不断发展， 转基因植物 的研究与应用已取得了骄人成绩， 相继培育出了一些抗病、 抗虫、 抗除草剂和高产优质的转基因农作物新品种。 与此同时， 转基因 植物的筛选检测技术也在不断发展、 完善， 不但节省筛选时间和 成本，而且为科学地评价转基因作物提供技术支持。 实验室常用 的转基因植物筛选试剂有草铵膦、卡那霉素和潮霉素。1983年世界首例转基因植物培育成功，标志着人类用转基 因技术改良农作物的开始。转基因作物于 1987 年被允许进入田 间鉴定试验， 1992年开始大田产量试验， 1995 年完成安全性评 价研究， 1996年进行商业化生产种

2、植面积为 174万 hm2，2002 年，这一数字增长了 33 倍。目前，产业化的转基因作物主要包 括抗除草剂大豆、抗虫玉米、抗虫棉花和抗除草剂油菜等，其他 具有优良性状的转基因作物也呈现良好的产业化前景。植物转基因因受到受体系统的限制， 外源基因的转化得率较 低，为了获得有效转化样本， 需要进行大量的转化筛选实验获得 目的样本， 采用何种方法才能解决在大量的待选材料中快速、 有 效的检测出转基因阳性植物或者细胞 ; 检测外源基因是否已经整 合到植物染色体上 ; 是否正确表达等一系列问题？本文仅对常用 的转基因植物筛选试剂作以简要的介绍。草铵膦（Phosph in othricin , PPT

3、，是一种有机磷类除草剂（basta的活性成分），其有效成分是膦丝菌素（ PPT。草 铵膦主要通过抑制谷氨酰胺合成酶（GS活性，使植物体内氮代 谢紊乱、细胞内氨的含量过高而中毒、叶绿素解体、光合作用受 到抑制，最终导致植物死亡。谷氨酰胺合成酶（GS是植物体内唯一能降解氨毒的酶， 能够去除植物体内因硝酸还原反应、 氨基 降解反应和光呼吸反应过程所释放的氨。 草铵膦乙酰转移酶基因 Bar，从土壤吸水链霉菌中分离克隆而来，其编码的草铵膦乙酰 转移酶（PAT对草铵膦专一性高，它可以催化PPT的自由氨基乙酰化，使PPT不能抑制GS的活性，含有该基因的植物具有对 Basta 的抗性。利用 Basta 筛选转

4、基因植物主要有两种方法。 一种是在幼苗 长出叶片之后直接向待筛选植株喷施Basta，另一种是在MS培养基中加入适当浓度的 Basta。培养皿中央点野生型种子作为对 照，其余部分点突变体种子，水平放置培养。挑选发芽较好的幼 苗，移栽到土壤中作为候选突变体培养。不同的植物对于 Basta 的敏感程度不同， 同一植物不同生长阶段对于 Basta 的敏感程度 也不同。 临界筛选浓度的判定标准： 以野生型几乎不能发芽或者 发芽不能存活的 basta 浓度。根据拟南芥幼苗的黄化程度和死亡 率确定出 basta 最佳筛选浓度。卡那霉素（ Kanamycin ，主要分为盐酸卡那霉素和硫酸卡 那霉素两种， 其本

5、质是一种蛋白质生物合成抑制剂， 主要用于分 子克隆中被作为标记基因。 卡那霉素属于氨基糖苷类抗生素， 能 够与叶绿体和线粒体中的核糖体 30S 亚基结合，从而干扰蛋白质 的合成，引起植物绿色器官的黄化，最终导致植物的死亡。常用 npt 基因作为遗传标记基因，其编码新霉素磷酸转移酶H能使 植物产生抗卡那霉素特性， 对转化植株进行筛选。 卡那霉素属于 氨基糖苷类抗生素， 能够与叶绿体和线粒体中的核糖体 30S 亚基 结合，从而干扰蛋白质的合成，引起植物绿色器官的黄化，最终 导致植物的死亡。利用卡那霉素筛选转基因植物主要是在 MS培养基中加入适 当浓度的卡那霉素。 根据拟南芥幼苗的死亡率确定出卡那霉素最 佳筛选浓度。 培养皿中央点野生型种子作为对照， 其余部分点突 变体种子，水平放置。挑选发芽较好的幼苗，移栽到土壤中作为 候选突变体培养。潮霉素( hygromycin )，性状为微黄褐色粉末，毒性较低， 具有一定的驱虫活性。潮霉素(Hyg)是一种氨基糖苷类抗生素， 通过竞争叶绿体和线粒体中的核糖体与延长因子 EF-2 的结合位 点，破坏细胞中核糖体的功能，从而抑制蛋白的合成，使敏感组 织褐化死亡。用于真菌、植物、动物等生物体外源基因转化的筛 选。目前，转基因技术比较完善、成熟，但对目的基因的转化， 还比较难做到定量、 定位，因此需要对转基