6生物分离工程技术第六章沉淀与膜分离技术1ppt课件

1、生物分离生物分离(工程工程)技术技术生物分离工程技术生物分离工程技术主讲：吴元喜主讲：吴元喜: : 联系电话：联系电话：027-87792304027-87792304 20192019年年8 8月月 生物分离生物分离(工程工程)技术技术生物工业下游技术一般工艺过程生物工业下游技术一般工艺过程生物分离生物分离(工程工程)技术技术第六章沉淀分离技术第六章沉淀分离技术一、蛋白质的表面特性一、蛋白质的表面特性 二、盐析沉淀二、盐析沉淀 三、有机溶剂沉淀三、有机溶剂沉淀 四、热四、热 沉沉 淀淀 五、其他沉淀法五、其他

2、沉淀法 六、思考题六、思考题生物分离生物分离(工程工程)技术技术沉淀的含义沉淀的含义 沉淀结晶：是物理环境的变化引起溶质的溶解度降低、生成固体凝聚沉淀结晶：是物理环境的变化引起溶质的溶解度降低、生成固体凝聚物的现象。物的现象。 沉淀是不定形的固体颗粒，构成成分复杂，除含有目标分子外，还夹沉淀是不定形的固体颗粒，构成成分复杂，除含有目标分子外，还夹杂共存的杂质、盐和溶剂，其纯度远低于结晶。杂共存的杂质、盐和溶剂，其纯度远低于结晶。 沉淀法是采取适当的措施改变溶液的理化参数，控制溶液中各种成分沉淀法是采取适当的措施改变溶液的理化参数，控制溶液中各种成分的溶解度，使溶液中的欲提取目标物和杂质分开的技

3、术，所以也称溶解的溶解度，使溶液中的欲提取目标物和杂质分开的技术，所以也称溶解度法。度法。 沉淀法是一种初级分离技术沉淀法是一种初级分离技术, ,也是一种浓缩技术。多步沉淀操作也可制也是一种浓缩技术。多步沉淀操作也可制备高纯度的目标产品。备高纯度的目标产品。生物分离生物分离(工程工程)技术技术怎样使目标物和杂质分开？怎样使目标物和杂质分开？ 第一种做法是采用使目标物的溶解度最大，而杂第一种做法是采用使目标物的溶解度最大，而杂质溶解度尽可能小的条件，即需要的目标物保留质溶解度尽可能小的条件，即需要的目标物保留在溶液中，杂质则被沉淀。在溶液中，杂质则被沉淀。 第二种做法是选择使目标物选择性地沉淀出

4、来，第二种做法是选择使目标物选择性地沉淀出来，杂质保留在溶液中。杂质保留在溶液中。 一般认为，在第一种情况中，应使要提取目标物一般认为，在第一种情况中，应使要提取目标物的溶解度大于的溶解度大于10g10gL L；第二种情况，要目标物的；第二种情况，要目标物的溶解度应控制在溶解度应控制在O.1O.1O.01gO.01gL L。生物分离生物分离(工程工程)技术技术沉淀分离技术的原理和方法沉淀分离技术的原理和方法一、蛋白质的表面特性一、蛋白质的表面特性 二、盐析沉淀二、盐析沉淀 三、有机溶剂沉淀三、有机溶剂沉淀 四、热四、热 沉沉 淀淀 五、其他沉淀法五、其他沉淀法 六、思考题六、思考题生物分离生物

5、分离(工程工程)技术技术一、蛋白质表面特性一、蛋白质表面特性 蛋白质表面结构特点蛋白质表面结构特点 蛋白质的胶体特性蛋白质的胶体特性生物分离生物分离(工程工程)技术技术蛋白质表面结构特点图蛋白质表面结构特点图生物分离生物分离(工程工程)技术技术蛋白质的胶体特性蛋白质的胶体特性 蛋白质的相对分子质量蛋白质的相对分子质量 (6kD-1000kD (6kD-1000kD，直径约，直径约l-30nm) l-30nm) 分子表面的水化层分子表面的水化层 紧密结合的水化层可达到紧密结合的水化层可达到0.35g0.35gg g蛋蛋白质，白质， 疏松结合的水化层可达到蛋白质分疏松结合的水化层可达到蛋白质分子质

6、量的子质量的2 2倍以上倍以上 分子间的静电排斥双电层分子间的静电排斥双电层 ） 蛋白质沉淀的机制环境、沉淀剂）蛋白质沉淀的机制环境、沉淀剂）生物分离生物分离(工程工程)技术技术蛋白质分子双电层示意图蛋白质分子双电层示意图1 1、双电层中存在距表面由高到低、双电层中存在距表面由高到低( (绝对值绝对值) )的电位分布，双电层的性质与该电位分布的电位分布，双电层的性质与该电位分布密切相关。密切相关。2 2、紧密层和分散层交界处的电位值称为、紧密层和分散层交界处的电位值称为(zeta)(zeta)电位，带电粒子间的静电相互作电位，带电粒子间的静电相互作用取决于用取决于电位电位( (绝对值绝对值)

7、)的大小。的大小。3 3、当双电层的、当双电层的电位足够大时，静电排电位足够大时，静电排斥作用抵御分子间的相互吸引作用斥作用抵御分子间的相互吸引作用( (分子分子间力间力) )，使蛋白质溶液处于稳定状态。，使蛋白质溶液处于稳定状态。生物分离生物分离(工程工程)技术技术二、盐析沉淀及其应用二、盐析沉淀及其应用1 1、盐析沉淀的原理、盐析沉淀的原理2 2、影响盐析的因素、影响盐析的因素3 3、盐析的操作、盐析的操作4 4、盐析操作必须注意的问题、盐析操作必须注意的问题5 5、运用、运用生物分离生物分离(工程工程)技术技术1 1、蛋白质盐析沉淀的原理、蛋白质盐析沉淀的原理 蛋白质沉淀的机制图蛋白质沉

8、淀的机制图 溶解度与离子强度的关系溶解度与离子强度的关系 KSKS分段盐析和分段盐析和分段盐析分段盐析 几种常用盐对某些蛋白质的几种常用盐对某些蛋白质的盐析常数盐析常数生物分离生物分离(工程工程)技术技术蛋白质沉淀的机制图蛋白质沉淀的机制图生物分离生物分离(工程工程)技术技术蛋白质溶解度与离子强度的关系蛋白质溶解度与离子强度的关系生物分离生物分离(工程工程)技术技术蛋白质溶解度与离子强度的关系蛋白质溶解度与离子强度的关系 logS/S0 =-KSI logS/S0 =-KSI logS logS logS0 - KSI = - KsI logS0 - KSI = - KsI logS logS

9、 KsI KsI S S、S0 -S0 -在离子强度为在离子强度为I I和和0 0时的溶解度时的溶解度g/dm3g/dm3）；）； - -常数与蛋白质的性质相关）；常数与蛋白质的性质相关）； Ks - Ks -盐析常数与盐的性质相关）；盐析常数与盐的性质相关）； I I离子强度，离子强度，molmoldm3dm3。（。（I I CiZi2 CiZi2 ） 举例：举例：生物分离生物分离(工程工程)技术技术蛋白质溶解度与离子强度的关系蛋白质溶解度与离子强度的关系生物分离生物分离(工程工程)技术技术KSKS分段盐析和分段盐析和分段盐分段盐析析 logS logS logS0 - KSI = - Ks

10、I logS0 - KSI = - KsI KS KS分段盐析：分段盐析： 温度和温度和pHpH一定（一定（ ），改动），改动 I I和盐和盐 ； 分段盐析：分段盐析： 盐和盐和I I一定一定KS IKS I），改变温度和），改变温度和pHpH生物分离生物分离(工程工程)技术技术几种常用盐对某些蛋白质的盐析常数几种常用盐对某些蛋白质的盐析常数 盐盐蛋白质蛋白质硫酸镁硫酸镁 硫酸铵硫酸铵 硫酸钠硫酸钠 硫酸钾硫酸钾-乳球蛋白乳球蛋白 0.63马血红蛋白马血红蛋白 0.33 0.71 1.00人血红蛋白人血红蛋白 2.00马肌血红蛋白马肌血红蛋白 0.94卵清蛋白卵清蛋白 1.22血纤维蛋白血纤维

11、蛋白 1.64生物分离生物分离(工程工程)技术技术2 2、影响盐析的因素、影响盐析的因素 无机盐的种类及选择无机盐的种类及选择 温度温度pHpH值值 生物分离生物分离(工程工程)技术技术无机盐的种类及选择无机盐的种类及选择 Ks Ks 取决于盐的性质，与离子价数成正比，与离子取决于盐的性质，与离子价数成正比，与离子半径和溶液介电常数成反比。半径和溶液介电常数成反比。 常见阴离子的盐析作用顺序常见阴离子的盐析作用顺序 ： PO43- PO43-SO42-SO42-CHCOO-CHCOO-Cl-Cl-N03-N03-Cl04-Cl04-I-I-SCN- SCN- 阳离子的盐析作用顺序为阳离子的盐析

12、作用顺序为 NH4+ NH4+K+K+Na+Na+Mg2+Mg2+ 盐类必须溶解度大、受温度影响小，而且盐溶液盐类必须溶解度大、受温度影响小，而且盐溶液密度不高密度不高 。生物分离生物分离(工程工程)技术技术一氧化碳血红蛋白一氧化碳血红蛋白在不同电解质下的溶解曲线在不同电解质下的溶解曲线生物分离生物分离(工程工程)技术技术常用盐析剂在水中的溶解度常用盐析剂在水中的溶解度g/100mlg/100ml） 温度温度中性盐中性盐 0 20 40 60 80100（NHNH4 4）2 2SOSO4 471.675.481.088.095.3103 NaNa 2 2SOSO4 4 4.918.948.34

13、5.343.342.2 MgSO MgSO4 434.544.454.663.670.8 NaH NaH2 2POPO4 4 1.6 7.854.182.693.8101生物分离生物分离(工程工程)技术技术温度和温度和pHpH值值 在高离子强度溶液中，温度升高，蛋白质的在高离子强度溶液中，温度升高，蛋白质的溶解度下降溶解度下降; ; 在低离子强度溶液或纯水中，蛋白质的溶解在低离子强度溶液或纯水中，蛋白质的溶解度随温度升高而增大度随温度升高而增大; ; 在在pHpH接近蛋白质等电点的溶液中蛋白质的溶接近蛋白质等电点的溶液中蛋白质的溶解度最小解度最小(值最小值最小).).生物分离生物分离(工程工程

14、)技术技术温度对盐析的影响温度对盐析的影响生物分离生物分离(工程工程)技术技术pHpH对盐析的影响对盐析的影响生物分离生物分离(工程工程)技术技术3 3、盐析的操作、盐析的操作(NH4)2SO4(NH4)2SO4浓度的计算与调整浓度的计算与调整盐析曲线的制作盐析曲线的制作分步盐析法分步盐析法生物分离生物分离(工程工程)技术技术(NH4)2SO4(NH4)2SO4浓度的计算与调浓度的计算与调整整 饱和度的意义饱和度的意义 饱和溶液调整的计算饱和溶液调整的计算 固体直接加入的计算固体直接加入的计算 查表法查表法生物分离生物分离(工程工程)技术技术饱和度的意义饱和度的意义 饱和饱和(NH4)2SO4

15、(NH4)2SO4溶液的配制溶液的配制: : 水水+ +过量过量(NH4)2SO4 ,(NH4)2SO4 ,加热加热10min(50-10min(50-60),60),过滤过滤, , 静置静置2h(0 2h(0 或或10 ),10 ),析出结晶后为析出结晶后为100%100%饱和度。饱和度。 在在2525时，溶解度为时，溶解度为767g767gL L 在在00时，溶解度为时，溶解度为697g697gL L 溶液饱和度：溶液饱和度： = = 饱和饱和(NH4)2SO4(NH4)2SO4溶液的体积溶液的体积/ /溶液溶液总体积总体积生物分离生物分离(工程工程)技术技术饱和溶液调整的计算饱和溶液调整

16、的计算V:V:需要加入饱和硫酸铵溶液的体积需要加入饱和硫酸铵溶液的体积V0:V0:原溶液的体积原溶液的体积S1,S2:S1,S2:分别为原溶液和所需达到的分别为原溶液和所需达到的硫硫 酸铵饱和度酸铵饱和度生物分离生物分离(工程工程)技术技术固体直接加入的计算固体直接加入的计算W W：将一升：将一升S1S1提高到提高到S2S2时需加入的硫酸时需加入的硫酸铵克数铵克数G G和和A A为常数，为常数，00时，时，G=707G=707，A=0.27A=0.27 25 25时，时，G=756G=756，A=0.29A=0.29生物分离生物分离(工程工程)技术技术查表法查表法生物分离生物分离(工程工程)技

17、术技术盐析曲线的制作盐析曲线的制作( (设操作温设操作温度为度为0)0)(1)(1)将料液分成等体积的数份；将料液分成等体积的数份； (2)(2)计算达到计算达到1010-100-100饱和度所需加入的硫酸铵量，饱和度所需加入的硫酸铵量，并在搅拌下分别加到料液中，搅拌并在搅拌下分别加到料液中，搅拌1h1h，静置，静置1h1h以上；以上；(3)(3)离心离心3000rpm3000rpm40min40min后，将沉淀溶于缓冲溶液中，后，将沉淀溶于缓冲溶液中，测定其中总蛋白和目标蛋白的浓度；测定其中总蛋白和目标蛋白的浓度；(4)(4)分别测上清液中总蛋白和目标蛋白的浓度，比较沉淀分别测上清液中总蛋白

18、和目标蛋白的浓度，比较沉淀前后蛋白质是否保持物料守恒，检验结果的可信度；前后蛋白质是否保持物料守恒，检验结果的可信度；(5)(5)以饱和度为横坐标，上清液中总蛋白和目标蛋白浓度以饱和度为横坐标，上清液中总蛋白和目标蛋白浓度为纵坐标作图。为纵坐标作图。 生物分离生物分离(工程工程)技术技术盐析曲线图盐析曲线图生物分离生物分离(工程工程)技术技术分步盐析法分步盐析法生物分离生物分离(工程工程)技术技术4 4、盐析操作必须注意的问题、盐析操作必须注意的问题 中性盐的纯度要高、溶解要充分；中性盐的纯度要高、溶解要充分； 盐析常与等电点沉淀相结合；盐析常与等电点沉淀相结合； 选择适当的沉淀温度；选择适当

19、的沉淀温度； 选择适当的蛋白质浓度；选择适当的蛋白质浓度； 饱和硫酸铵要现配现用；饱和硫酸铵要现配现用； 盐析产品需脱盐后进一步纯化。盐析产品需脱盐后进一步纯化。生物分离生物分离(工程工程)技术技术等电点沉淀等电点沉淀生物分离生物分离(工程工程)技术技术三、有机溶剂沉淀三、有机溶剂沉淀1 1、有机溶剂沉淀的机理、有机溶剂沉淀的机理2 2、有机溶剂的选择与用量、有机溶剂的选择与用量3 3、温度和、温度和pHpH对有机溶剂沉淀的影响对有机溶剂沉淀的影响4 4、有机溶剂沉淀时应注意的问题、有机溶剂沉淀时应注意的问题生物分离生物分离(工程工程)技术技术1 1、有机溶剂沉淀的机理、有机溶剂沉淀的机理 降

20、低溶液的介电常数，降低溶液的介电常数， 如：如：2020时，水的介电常数为时，水的介电常数为8080，82%82%的乙醇的介电常数为的乙醇的介电常数为4040。 破坏蛋白质胶体分子的水化膜，破坏蛋白质胶体分子的水化膜， 破坏蛋白质分子的次级键，使疏水基团暴破坏蛋白质分子的次级键，使疏水基团暴露，形成疏水层。露，形成疏水层。生物分离生物分离(工程工程)技术技术2 2、有机溶剂的选择与用量、有机溶剂的选择与用量 丙酮乙醇甲醇丙酮乙醇甲醇 乙醇的稀释乙醇的稀释 有机溶剂用量的计算有机溶剂用量的计算 有机溶剂沉淀曲线有机溶剂沉淀曲线生物分离生物分离(工程工程)技术技术乙醇的稀释乙醇的稀释生物分离生物分

21、离(工程工程)技术技术有机溶剂用量的计算有机溶剂用量的计算 V=V0(S2-S1)/(100-S2) V=V0(S2-S1)/(100-S2) V V需加入有机溶剂的体积；需加入有机溶剂的体积；V0V0蛋白溶液的原始体积；蛋白溶液的原始体积；SlSl蛋白溶液中有机溶剂的浓度；蛋白溶液中有机溶剂的浓度；S2S2蛋白溶液中欲达到的有机溶剂浓蛋白溶液中欲达到的有机溶剂浓度。度。 生物分离生物分离(工程工程)技术技术3 3、温度和、温度和pHpH对有机溶剂沉淀的影响对有机溶剂沉淀的影响生物分离生物分离(工程工程)技术技术4 4、有机溶剂沉淀时应注意的问题、有机溶剂沉淀时应注意的问题 低温下操作低温下操

22、作 中性盐的盐溶作用可减少变性中性盐的盐溶作用可减少变性 多价阳离子可降低蛋白质的溶解度多价阳离子可降低蛋白质的溶解度 防止过量有机溶剂引起共沉淀防止过量有机溶剂引起共沉淀 沉淀应尽快分离，并溶于缓冲液中沉淀应尽快分离，并溶于缓冲液中生物分离生物分离(工程工程)技术技术四、热四、热 沉沉 淀淀 根据蛋白质间的热稳定性的差别进行蛋白质根据蛋白质间的热稳定性的差别进行蛋白质的热沉淀，分离纯化热稳定性高的目标产物。的热沉淀，分离纯化热稳定性高的目标产物。 热沉淀是一种变性分离法，带有一定的冒险热沉淀是一种变性分离法，带有一定的冒险性，使用时需对目标产物和共存杂蛋白的热性，使用时需对目标产物和共存杂蛋

23、白的热稳定性有充分的了解。稳定性有充分的了解。 生物分离生物分离(工程工程)技术技术五、其他沉淀法五、其他沉淀法 非离子型聚合物聚乙二醇非离子型聚合物聚乙二醇(PEG)(PEG)是蛋白质稳定是蛋白质稳定剂，也可促进蛋白质的沉淀。剂，也可促进蛋白质的沉淀。 聚电解质有酸性多糖和羧甲基纤维素、海藻酸聚电解质有酸性多糖和羧甲基纤维素、海藻酸盐、果胶酸盐和卡拉胶等常用于回收食品蛋白盐、果胶酸盐和卡拉胶等常用于回收食品蛋白 某些金属离子可与蛋白质分子上的某些残基发某些金属离子可与蛋白质分子上的某些残基发生相互作用而使蛋白质沉淀。生相互作用而使蛋白质沉淀。 例如，例如，Ca2+Ca2+和和Mg2+Mg2+能与羧基结合，能与羧基结合，Mn2+Mn2+和和Zn2+Zn2+能与羧基、含氮化合物能与羧基、含氮化合物( (如胺如胺) )以及杂环以及杂环化合物结合。化合物结合。 生物分离生物分离(工程工程)技术技术非离子型聚合物沉淀法