D半乳糖合并半高脂饲料致认知功能障碍大鼠模型的建立及评价

1、【摘要】目的建立复合因素所致认知功能障碍大鼠模型，并从行为学、病 理形态学、 细胞凋亡、 氧化损伤和炎症因子等角度进行评价。 方法 选用雌性正 常SD大鼠，采用皮下注射D半乳糖及饲喂半高脂饲料，制备6 w及8 w不同 时程的认知功能障碍动物模型。采用Morris水迷宫实验及物体识别实验检测各 组大鼠学习记忆能力；采用HE染色及电镜观察海马组织病理形态；测定脑中丙 二醛(MDA)、氧化低密度脂蛋白(ox LDL)、肿瘤坏死因子a (TNF a )及tl细胞介素6 (IL 6)的含量；比较不同时程认知功能障碍模型大 鼠之间及与正常大鼠的差异。结果6 w末时，认知功能障碍模型大鼠在物体识 别实验中，

2、分辨指数较空口组明显下降(P0.05),但水迷宫实验成绩与空白 组比较无明显差异；而8 w末时，模型动物在分辨指数下降(P0.01)的同 时，水迷宫成绩亦明显下降，逃避潜伏期明显延长(PV0.01),穿台次数明显 减少(P0.05)；8 w末与6 w末相比，水迷宫实验逃避潜伏期明显延长(P 0.01):造模后， 能引起海马神经细胞的退行性改变及早期凋亡现象， 且存 在着进行性加重的病理变化；6、8 w模型组大鼠脑组织的TNF a、IL 6水 平显著升高(P0. 05, P0.01),同时8 w大鼠IL 6水平高于6 w模型组(P0. 05) ； 6、8 W模型组ox LDL、MDA水平均显著升

3、高(P0 05, P 0.01) o结论以该方法复制的认知功能障碍大鼠模型，在一定程度上模拟了认 知功能障碍发生、发展的多环节病理变化，可为认知功能障碍的治疗，特别是 其早期干预打下基础。【关键词】D半乳糖； 半高脂饲料； 认知功能障碍； 大鼠模型Establishmentand evaluation on rat model of cognitive impairment achieved by D galactoseand semi high fat diet YAO Ming Jiang, LI Hao, ZHAO Wen Ming, et al Xiyuan Hospital , Ch

4、inaAcademy of Chinese Medical Sciences, Beijing 100091, China AbstractObjective To establish rat model of cognitive impairment with compositefactor, and evaluate the model on praxiology, pathomorpho1ogy, apoptosisand oxidative damage Methods Female SD rats were received dailyhypodermic injection of

5、D galactose with the concentration of 50 mg/kgand fed with semi high fat diet for 6 and 8 weeks The abilities of learningand memory were tested by Morris water maze, the pathomorphologic ofhippocampus was observed by HE staining and electron microscope Thelevels of MDA, ox LDL, TNF Q and IL 6 in bra

6、in were detected, and thedifference between rat model of cognitive impairment and normal rat indifferent course were analyzed Results After 6 weeks, resolution indexof model group was decreased than that of normal group (P0.03) in objectrecognition test, but there was no difference in water maze res

7、ults After8 weeks, both resolution index and water maze results of model group weredecreased than those of normal group, and escape latency was extended(P0.01) , times of crossing platform was reduced (P0.03) Escape latencywas also extended at 8 weeks compared with that at 6 weeks (P0.01) Inthe two

8、model groups, degeneration and early apoptosis were observed inneurocyte ofhippocampus, and the changes were aggravated progressive!y. The levelsof TNF a and IL 6 in model groups were elevated （P 0.03， P0.01） ,and the level of IL 6 in 8 weeks model group was higher than that in 6weeks model group （P

9、0.05）, the levels of ox LDL and MDA in model groupswere elevated compared with those in normal group （P0.03, P0.01）Conclusions Rat model of cognitive impairment achieved by this methodcould imitate the genesis and progression of cognitive impairment in someextent, and could provide research foundati

10、on for early intervention ofcognitive function impairment 【Key words D galactose; Semi high fatdiet;Cognitive impairment; Rat model随着我国逐渐进入老龄化社会，认知功能障碍的人口正逐年增加， 许多中老年人及其家人正在经受认知功能障碍所带 来的痛苦，同时也为整个社会带来巨大的经济负担（1） o U前，D半乳糖模 型已成为国内公认的衰老和脑老化动物模型之一（2） o同时，多项研究分析表 明，心脑血管病危险因素与认知功能障碍相关，如高血压、房颤、血脂异常、糖尿病等，不仅是

11、血管性痴呆（VD）,而且也是老年性痴呆（AD）和轻度认知 功能损伤（MCI）的危险因素（3） o因此，本实验在皮下注射D半乳糖诱导 脑老化的基础上，加喂半高脂饲料，旨在建立一种简便易行、 便于重复并且能 较好地重现人类认知功能障碍发生、 发展病理变化的动物模型。1材料与 方法1 1实验材料SPF级雌性SD大鼠48只，体重180200 g,由北 京维通利华实验动物技术有限公司提供，许可证编号SCXK（京）20070001 o D半乳糖ill Sigma公司提供（G0625）:半高脂饲料（配方：5%猪油+0. 5%胆固 醇+概蛋黃粉+89. 5%基础饲料）山北京科澳协力饲料有限公司提供；氧化低密度

12、 脂蛋白（ox LDL） （ELISA）测定试剂盒由美国TPI公司提供（批号：TE212）:丙二醛（MDA）测定试剂盒山南京建成生物工程研究所提供（批号：20070814）；考马斯亮蓝蛋口测定试剂盒III南京建成生物工程研究所提供 （批 号：20070814）。Morris水迷宫系统DMS2（中国医学科学院）；MultiskanMK3 Thermo（雷伯）酶标仪、Wellwash MK2 Thermo（雷伯）洗板机（芬兰）；恒温 水浴箱（上海仪器厂）；OLYMPUS BH 2光学显微镜（日本）；日立H 600型透射电镜（日本）1.2方法1.2.1认知功能障碍大鼠模型的制备SPF级雌性SD大鼠适

13、应性饲养1 w后，按随机方法分为4组，即6 w模型组、6 w空白组、8 w模型组、8 w空口组，每组12只。每组6只用于海马组织匀 浆相关指标检测；另外6只用于灌注固定后海马组织病理检测。6 w模型组： 每日颈背部皮肤75%酒精消毒后，皮下注射D半乳糖50 mg/kg体重，并自第3周起同时给予半高脂饲料喂食，至第6周末。6 w空白组：每日颈背部皮肤75%酒精消毒后，皮下注射等量生理盐水，并饲喂普通饲料，至第6周末。8 w模型组：每日颈背部皮肤75%酒精消毒后， 皮下注射D半乳糖50 mg/kg体 重， 并自第5周起同时给予半高脂饲料喂食，至第8周末。8 w空口组：每日 颈背部皮肤75%酒精消毒

14、后，皮下注射等量生理盐水，并饲喂普通饲料，至第8周末，死亡1只。1. 2. 2行为学实验1. 2. 2. 1 Morris水迷宫实验 山定位航行实验与空间探索实验两部分组成。定位航行实验：实验水深30 cm,水温（251） C,将大鼠从第二象限标记处逐一放入水池中，放入时将大 鼠面向池壁，自动录像系统记录大鼠从入水至找到平台并爬上平台所需的时间（以四肢爬上平台为准），即逃避潜伏期（PLL） o如大鼠在3 min内未找到平 台，则山实验者将其引导至平台。潜伏期最长时间为180 so待大鼠爬上平台 并在平台上休息10 s后，再进行下一只大鼠的实验。每天进行1次，连续训练5 d,记录每天的FLL。空

15、间探索实验：第5天下午，撤除平台，随机选取一 点，面向池壁将大鼠放入水池中，摄像系统自动记录大鼠3 min内进出原平台区的次数作为评价大鼠学习成 绩的指标。1. 2. 2. 2物体识别实验参考Ennaceur等（4）及Aggieton等（5）的方法进行物体识别实验。装置主要由一个测试盒（自制）与2套（每 套2只） 测试物体组成， 测试物体在实验前经筛选有近似的大鼠喜好程度。 测 试盒以1 mXlmX0.5 m的木制盒自制而成，内面漆成灰色，底面铺一层锯 屑。A套物体与B套物体材料及颜色需不同，高度约1518 cm,两物体均足够 重以防止大鼠推动。测试主要分适应期、熟悉期和识别期。第1天：适应期

16、。 将鼠放入测试盒正中，盒内未放任何物体。自行活动10 mine第2天：熟悉 期。盒中放入两个相同物体（AA或BB）,两物体处于对角线上，距两侧壁各10 cm,将鼠仍从正中放入盒中，距两物体等距。共活动10 mine测试者分别 用2只秒表记录鼠在每个物体上的探索时间，即鼠嘴凑近物体2 cm内和/或用 鼻触物体，只在附近走动及趴在物体上则不计入时间。第3天： 测试期。 将盒 中物体其中之一换为另一套物体中之一， 即AB或BL共活动10 min,同上法 计时，记录每只大鼠探索新、旧物体的时间，并以探索时间计算分辨指数（DI）评价其识别能力，DI计算公式：DI二（X F） /（N+F） X100%,

17、式中N为 探索新物体所用的时间，F为探索旧物体所用的时间。实验中，A套物体为绿色 塑料物体，B套物体为红色玻璃物体。1.2.3组织样品处理 大鼠进行全部行为学测试后，禁食12 h, 10%水合氯醛腹腔麻醉后，每组6只随即断头 处死，在低温下快速取出全脑， 分离出大脑皮层和海马， 随机选2只大鼠， 取 海马组织1 mm3放入4%戊二醛磷酸缓冲液中固定，以备电镜检测；其余分别称 重后，置液氮中速冻，随后转存于-80C冰箱。取海马组织，于冰浴下超声波破 碎制成10%匀浆，离心3 000r/min, 4C, 10 min,取上清液，以待生化指标 检测。剩余6只大鼠剖开胸腔及腹腔，暴露心脏，剪开右心耳，

18、经升主动脉用0.01%肝素生理盐水冲净血液（2 min内） ，继用预冷为4C的含4%多聚甲醛的 固定液（PBS配制，pH7.4）进行灌注固定1 h,直到动物全身呈僵直状态，灌 流结束后，断头取全脑，常规脱水、透明、浸蜡、包埋，选取海马部位，将蜡 块切成4 um冠状切片，以备病理染色。1.2.4病理形态学观察组织切片常规HE染色，置光学显微镜下形态观察。取4%戊二醛磷酸缓冲液固定的 海马组织，进行常规电镜包埋，1 um半薄切片下定位，超薄切片染色后，日 立H 600型透射电镜观察海马超微结构改变并照像。山中国农业科学院原子能 所协助检测。1 .2. 5海马匀浆生化指标检测1. 2. 5. 1肿瘤

19、坏死因子a （TNF a）及白细胞介素6（IL 6）含量测定釆用放射免疫法测定TNF a和IL 6的含量，由解放军总医院提供放免试剂盒并协助检测。1. 2. 5. 2 MDA及ox LDL含量测定釆用免疫比浊法测定MDA的含量，酶联免疫法（ELISA）检测ox LDL的含量，实验步骤严格按照试剂盒说明书进行。1.3数据处理 数据以xs表示，采用SPSS13. 0软件进行统计分析，所有 数据均经正态性检验，统计分析采用t检验及方差分析。2结果2.1 6W末和8 W末各组大鼠水迷宫定位航行实验结果见表lo重复测量设计方差分析,6 w模型组PLL延长，但和6 w空口组比较，差异无统计学意义（P 0.

20、05） ；8 w模型组PLL明显延长，与8 w空口组相比有显著性差异（P 0.01）；与6 w模型组比较亦有显著性差异（P0. 05） o表1各组水迷宫定位航行实 验PLL比较（略）2.2 6w末和8 w末各组大鼠水迷宫空间探索实验和物体识别实验分辨指数结果见表2。6 w模型组穿台次数与6 w空白组相比，差异无统计学意义（P0.05） : 8 w模型组穿台次数明显减少，与8 w空口组比 较有显著性差异（P0.05）,与6 w模型组相比无显著性差异（P0. 05） o 6 w和8 w动物的分辨指数明显降低，和空口组比较有显著差异（P0. 05, P0. 05）o表2各组水迷宫空间探索实验穿台次数

21、和物体识别实验DI比较（略）2. 3 6 w末和8 w末大鼠海马组织病理形态学变化动物造模后，光镜下可见模型组大鼠海马病理形态显示神经元数量减少，突起明显稀疏，8 w模型组与6 w模型组比较，核固缩明显；空口组神经元数量多，突起致密，神 经胶质细胞少而小（见图1）o动物造模后，电镜下超微结构显示6 w模型组 大鼠海马细胞核萎缩，线粒体萎缩，核膜相对完整；8 w模型组细胞核中染色 质呈边集现象，为块状，核周岀现空晕，线粒体萎缩，结构变化差于6 w模型 组；而空白组细胞基本呈正常结构，形状椭圆，核内清晰，核膜结构清晰，线 粒体结构尚可；6 w空口组与8 w空口组无明显差别（见图2） o 2.4海马

22、 匀浆TNF Q及IL 6含量结果 见表3o 6 w.8 w模型组大鼠海马组织的TNF a. IL 6水平显著升高，与空白组比较差异显著（P0.05, P0. 01） :8 w大鼠IL 6水平明显高于6 w模型组（P0. 05）。表3各组海马TNF a、IL 6含量比较（略）2. 5海马匀浆MDA及ox LDL含量结果见表4。6 w、8 w模型组大鼠海马组织的MDA及ox LDL的含量显著升高，与 空白组比较差异显著（P0. 05, P0.01） o表4各组海马MDA、ox LDL含 量比较（略）3讨论国内外许多学者针对VD、AD等认知功能障碍疾病建立了一系列动物模型（6）,如基底前脑注射鹅蒿蕈氨酸（IB0）致痴呆大鼠模 型、东奁君碱致胆碱能损伤致痴呆动物模型、三氧化铝动物模型、自然衰老动 物模型、快速老化小鼠、转基因动物模型、D半乳糖皮下注射致脑老化动物模 型等，各有其优势，但都面临同一个问题， 即只是针对其病理的某一方面造 模， 因而只能模拟其诸多病理变