人子宫蜕膜树突状细胞DEC205HLADRCD11c的分离纯化与鉴定

1、人子宫蜕膜树突状细胞DEC-205+HLA-DR+CD11 c+的分离纯化与鉴定祝文峰袁建辉曾国琼李红梅【摘要】目的：探讨人子宫蜕膜树突状细胞的分离方式和诱导培 育的最正确条件，为研究树突状细胞在母胎免疫耐受中的作用奠定基 础。方式：人早孕（712周）子宫蜕膜组织经机械破碎，梯度离心取 得蜕膜低密度细胞，经粒-巨噬细胞集落刺激因子（GM-CSF）和干细胞 因子（SCF）诱导，所取得细胞用FITC标记的抗人DEC-20五、HLA-DR、 CDllc抗体进行鉴定。结果：从蜕膜组织可获取足足数量蜕膜树突状 细胞，体外培育1018 d细胞生长较为活跃，第14天左右达到最高 值，维持34 d开始下降，2

2、0 d内细胞数仍能维持在）X105个 /mLo结论：梯度离心法能成功分离蜕膜树突状前体细胞，GM-CSF和 SCF体外诱导可提供蜕膜树突状细胞原代培育较为中意的生长条件。【关键词】怀胎；免疫耐受；蜕膜；树突状细胞；分离和纯化（Abstract ） Objective To investigate the separation methods and growth conditions of decidual dendritic cells, and establish the ground work for the research of dendritic celT s functionar

3、y mechanism in maternal immunity and tolerance to the fetus. Methods The fresh early gestation （7 12 wk gestation） decidual tissue was dispersed mechanically in Hank'S balanced salt solution, and the low density cells were obtained by gradient centrifugation and cultured with granulocytemacropha

4、ge colony-stimulating factor (GM-CSF) and stem cell factor (SCF). Then the generated cells were identified by phenotypic and functional methods. Results A total of X 105 decidual dendritic cells were obtained from the fresh decidual tissue. These cells grew vigorously within 1018 days and reached th

5、e peak at the 14th day. Conclusion The method of echanically, gradient centrifugation can successfully separate the decidual dendritic cells. GM-CSF and SCF can promote the growth of the decidual dendritic cells and provide satisfactory growth conditions for them.(Key Words) Gestation; Immunity and

6、tolerance; Deciduas; Dendritic cells; Separation and purification正常怀胎有赖于母体和胎儿间的免疫平稳。正常怀胎时，母 体免疫系统以Th2型免疫应答为主，爱惜胚胎乃至胎儿胎盘不被母体 排斥，维持母体对胎儿的免疫耐受。研究说明1,树突细胞对母体免 疫耐受的启动起着重要作用，发觉早孕期蜕膜中存在HLA-DR+lin-的 树突细胞，并认DEC-205+可作为蜕膜树突状细胞的标志。本研究采 纳密度梯度离心法成功分离了人早孕子宫蜕膜树突状细胞，并用粒一 巨噬细胞集落刺激因子（GM-CSF）和干细胞因子（SCF）诱导其大量生 长，为后续研究树

7、突状细胞在母胎免疫耐受中的作用奠定了基础。1材料和方式材料人早孕（7、12周）子宫蜕膜组织（本院门诊要求终止怀胎的组 织标本）。D-Hanks'（平稳盐溶液），配制方式见文献2,高压灭菌 备用；细胞分离液：3%Ficoll （菲科尔）/10%泛影葡铉；RPMI 1640 （细胞培育液，Sigma公司），利用前加入青霉素、链霉素（100U/mL、 100U/mL）. 10%小牛血清;50 g/L GM-CSF （粒-巨噬细胞集落刺激因 子，华丽公司）；20 g/L干细胞因子（SCF,华丽公司）。抗人DEC-20 五、HLA-DR 和 CDllc （1:200,博士德公司）。方式蜕膜树突状

8、细胞分离和培育无菌切除的新鲜蜕膜组织用 D-Hanks'液冲洗2次，置入消毒后的组织匀浆器中，加入D-Hanks' 10 mL制成匀浆，200目金属网过滤，20、100Xg离心60 s,弃上清，警惕地将蜕膜细胞悬液加入含10 mL细胞分离液的离心管液面 上，20、200 Xg离心20mino搜集上层低密度细胞3。调剂细胞 密度为5X105个/mL,取2 mL加入6孔培育板，补加RPMI-1640 培育液2 mL, 37, 5% C02培育箱中进行培育，距离3、4 d半量 改换细胞培育液。实验分对照组、50 g/L GM-CSF组、20 g/L SCF组 和50 g/L GM-C

9、SF+20 g/L SCF组，加入相应浓度的刺激因素。细胞观看及鉴定每24h行细胞计数，制作生长曲线，倒置显 微镜观看细胞形态及细胞生长情形。用蜕膜树突状细胞特异性标记物 抗人DEC-205-FITC>HLA-DR-FITC和CDUc-FITC抗体通过免疫荧光 染色方式来鉴定上述培育细胞，观看其表达情形。2结果蜕膜细胞制备和分离采纳机械破碎，金属网过滤，梯度离心法，能获取足够的蜕膜树 突状前体细胞，数量达义107,知足蜕膜树突状细胞原代细胞培育的 需要。细胞生长曲线见图lo蜕膜细胞接种后，数量均有一明显下降，第5天达最 低值，可能是细胞悬液中蜕膜细胞死亡所致。体外培育1018 d蜕膜 树

10、突状细胞生长较为活跃，第14天左右细胞数达到最顶峰值，维持34 d后开始下降，但20 d内细胞数仍可维持较高水平。在细胞培 育液中加入GM-CSF、SCF诱导后与对照组比较，蜕膜树突状细胞数量 均有不同程度增加；其中二者合用诱导后蜕膜树突状细胞数量增加最 为明显；三者在培育1018 d均能取得足足数量（X105/mL）蜕膜 树突状细胞。蜕膜树突状细胞的形态和生长转变倒置显微镜观看蜕膜树突状细胞体外培育最初呈圆形或卵圆形, 79 d后显现典型割裂相，胞质内可见二倍体核型；d细胞割 裂旺盛，彼此聚集有贴壁现象；14d左右细胞贴壁，胞膜向外延伸出 尖状突起，胞质中见圆形或卵圆形细胞核，细胞生长呈簇状

11、聚集，此 状态可持续到第18天左右。尔后细胞割裂慢慢减慢，活细胞开始离 解和死亡，至第21天左右细胞明显减少，第28天细胞完全死亡。 形态学观看说明：原代培育的蜕膜树突状细胞在1018 d生长和割裂 能力很强，尔后慢慢衰退，最长可达28 do蜕膜树突状细胞鉴定免疫荧光观看显示为阳性反映，即所培育的细胞是蜕膜树突状细 胞 DEC-205+HLA-DR+CD1lc+o怀胎以后母体免疫系统发生假设干转变，如Thl/Th2系统向 Th2偏移，NK细胞毒性下降CD4+ CD25+调剂性T细胞增多4等, 母胎界面也形成了免疫耐受的微环境。可见母胎免疫耐受不是被动的 不识别胚胎抗原，而是一个主动识别和耐受的

12、进程。而母体对胚胎抗 原的识别必然离不开抗原递呈细胞一树突细胞。因此，树突细胞对母 体免疫耐受的启动起着重要作用。Gardner等1对人蜕膜中树突细胞 的表型和散布进行了研究，发此刻早孕期蜕膜中存在HLA-DR+lin-(即 CD3-CD19-CD14-CD56-CD16-)的树突细胞，而且为未成熟型，要紧特 点为 HLA-DR+CDllc+DEC-205+CD40+DC-sign-CDl a -CD123-,并以为 DEC-205+可作为蜕膜树突细胞的标志。免疫组化显示DEC-205+的树 突样细胞散在散布于蜕膜中，在种植部位可见其与滋养细胞很接近。 Blois等5对孕鼠子宫局部及外周血中的

13、树突细胞在孕期的转变进 行研究发觉：CDllc+树突细胞在孕d开始上升，d达顶峰，d 为平台期。在子宫局部只有< 30%的树突细胞表达MHCII类分 子，说明大部份的树突细胞处于非成熟状态，而且在孕d, MHCII类 分子的表达明显下降，其表型也转为分泌Th2型细胞因子的CD8a- 树突细胞，提示树突细胞可能在胚胎抗原的耐受中起重要作用，可是 目前尚缺乏直接证据。关于树突细胞在母胎免疫耐受中的作用还有很 多未知。要研究树突状细胞在母胎免疫耐受中的作用，需要进行树突状细 胞的原代培育。而要将蜕膜树突状前体细胞从中分离出来较为困难。 国外文献报导组织树突细胞的分离方式要紧有两种：体外

14、组织培育和 流式细胞仪分选6, 7o前者分离纯度低，后者程序复杂且消耗大量 抗体，均不能快速简便地获取树突细胞。本研究采纳的方式简便、高 效、重复性好，能够知足蜕膜树突状细胞原代培育的需要，是一种较 为成功的蜕膜细胞分离方式。咱们还对蜕膜树突状细胞体外培育最正 确条件进行了探讨。在RPMI-1640培育液中，蜕膜树突状细胞生长缓 慢，加入GM-CSF和SCF诱导后，可促使蜕膜树突状前体细胞向成熟 蜕膜树突状细胞转化，细胞生长活跃，对数生长期提早并延长，细胞 数量较对照组大幅度增加，在培育第1018天均能达到X 105,知 足后续实验的需求，便于相关课题研究的深切开展。【参考文献】 Gardne

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