HPLC测定肉制品中胭脂红的含量

1、hplc测定肉制品中胭脂红的含量 一、试验目的 把握肉制品中胭脂红含量的hpi。c定性和定量测定办法。 二、试验原理 样品经脱脂、碱性溶液提取、蛋白质沉淀、聚酰胺粉吸附与洗脱后，以高效液相色谱仪测定。按照保留时光定性，外标法定量。 三、仪器与试材 1仪器与器材 高效液相色谱仪(配有紫外检测器或二极管阵列检测器)、电吹风机、水浴锅、g3砂芯漏斗等。 2试剂 除特殊解释外，试验中所用试剂均为分析纯，水为去离子水或蒸馏水。 (1)常规试剂：hcl、naoh、h2so4、氨水、甲醇(色谱纯)、甲酸、石油醚(沸程为30 60)、无水乙醇、钨酸钠、柠檬酸、nh4ac、聚酰胺粉(过200目筛)。 (2)常规

2、溶液：hcl溶液(1+10，体积比)、naoh溶液(50g/l)、h2so4溶液(1+9，体 积比)、钨酸钠溶液(100gl)、nh4ac溶液(0.02mo1l，经0.45m滤膜过滤)、柠檬酸溶液(200gl)、甲醇一甲酸混合液(3+2，体积比)、无水乙醇一氨水一水溶液(7+2+1，体积比)、ph=5的水(取100ml水，用柠檬酸溶液调ph至5)。 (3)海砂：先用hcl溶液煮沸15min，用水洗至中性，再用naoh溶液煮15min，用水洗至中性，于105干燥，储于具塞瓶中。 (4)胭脂红标准储备液(1mgml)：取按其纯度折算为1()()质量的胭脂红标准品(含量95)0.100g，置于100

3、ml容量瓶中，以ph=5的水溶解并稀释至刻度。 (5)胭脂红标准工作液：临用时，将胭脂红标准储备液用水稀释至所需浓度，经0.45m滤膜过滤后，备用。 3试验材料 23种火腿肠，各100g。 四、试验步骤 1样品提取 (1)称取去除肠衣、切碎的火腿肠10.0g于研钵中，加少许海砂捣碎，研磨混匀，以电吹风 的冷风使试样稍微干燥。 (2)以50ml石油醚提取脂肪，共提取3次，每次提取45min，过滤，去滤液，残渣于通风橱中用吹风机吹干。 (3)残渣以50ml左右的无水乙醇氨水一水溶液多次反复提取至提取液无色，以砂芯漏斗抽 滤提取液。收集所有提取液于250ml锥形瓶中。 (4)于70水浴上浓缩提取液至

4、10ml以下后，依次加人1.0ml h2so4溶液和1.0ml，钨酸钠溶液，混匀，继续在70水浴中加热5min，沉淀蛋白质。冷却至室温后，以滤纸过滤，用少量水洗涤，收集滤液作为样品提取液。 2.样品纯化 (1)将上述样品提取液加热至70，将1.5g聚酰胺粉加少量水调成粥状后，倒入样品提取液中，使色素彻低被吸附。 (2)将吸附色素的聚酰胺粉所有转移到布氏漏斗中，抽滤，用70柠檬酸溶液洗涤35次，然后用甲醇一甲酸混合液洗涤5次，至洗出液无色为止，再用水洗至流出液呈中性后抽干。为了提高洗涤效果，在洗涤过程中应不断搅拌。 、 (3)用无水乙醇一氨水一水溶液洗涤聚酰胺粉35次，每次5ml，收集洗涤液，于

5、70蒸发至近干，加水溶解并定容至10ml，过0.45m滤膜，滤液为样品净化液。 3.测定 (1)分离将待测样品净化液和标准工作液用高效液相色谱仪测定，按照保留时光定性；按照试样溶液中胭脂红的含量状况，选定峰面积相近的标准工作液，以外标法定量。 (2)参考色谱条件：色谱柱为c18柱150mm×6mm，(内径)，5"m；流淌相为甲醇和o02moll nh4ac溶液，梯度洗脱，流速为1.0mlmin；柱温为30；检测波长为508nm；进样量为20l。 4.计算 按下式计算试样中胭脂红着色剂的含量： x=cav/asm 式中，x为样品中胭脂红的含量，mgkg；c为标准工作液中胭脂红的浓度，gml；a为样品净化液中胭脂红的峰面积；v为样品净化液的体积，ml；as为标准工作液中胭脂红的峰面积；m为样品净化液相当于样品的质量，g。 五、注重事项 1.试验步骤中的色谱条件仅作参考，在实际的试验中，应按照仪器类型和试验条件举行调节。 2.在本试验的参考色谱条件下，胭脂红的保留时光为9