细胞培养的操作步骤

1、细胞培养的操作步骤细胞培养的操作步骤一、原代培养及其操作步骤原代分离细胞培养是指从供体内取出组织后， 经机械以及消化分离成单个细胞或单一型细胞 群，使之在体外模拟人体生理环境，在无菌、适 当温度和一定的营养条件下，生存、生长和繁殖。 原代培养细胞常有不同的细胞成分，生长缓慢， 但是更能代表所来源的组织细胞类型和表达组 织的特异性特征。利用原代细胞培养做各种实 验，如药物测试、细胞分化及病毒学方面的试验 效果很好。其操作步骤如下。1 .剪切组织 先将所取得的组织，用D-Hanks 或Hanks液清洗，以去除表面血污，并用手术镣 去除黏附的结缔组织等非培养所需组织。再次清 洗后，用手术刀将组织切成

2、若干小块，移入青霉 素小瓶或小烧杯中，加入适量缓冲液，用弯头眼 科剪，反复剪切组织，直到组织成糊状，约1mm3 大小。静置片刻后，用吸管吸去上层液体，加入 适当的缓冲液再清洗一次。2 .消化分离 消化分离的目的是将细小的组 织块消化分离成细胞团或分散的单个细胞，以利 于进一步的培养，常用的消化酶有胰蛋白酶和胶原酶。3 .培养细胞悬液用计数板进行细胞计数。用 培养液将细胞数调整为(25) x 105 cells / ml,或实验所需密度，分装于培养瓶中，使细胞 悬液的量以覆盖后略高于培养瓶底部为宜。置 CO琴养?I内，5%CO2 37c静置培养。一般3 5d,原代培养细胞可以黏附于瓶壁， 并伸展

3、开始 生长，可补加原培养液量1/2的新培养液，继续 培养23d后换液，一般714d可以长满瓶壁， 进行传代。4 .注意事项(1)无菌操作：细菌或霉菌污染是培养失败 的常见原因，必须加强各个环节的无菌操作观 念，以预防为主，一旦污染，一般很难消除。(2)培养液：所用的培养液必须满足细胞生 存和生长的必要条件。由于细胞来源的动物种 类、组织类型不同，对培养液的要求有一定的差 异，必要时可用预实验的方法选择适当的培养 液。(3)小牛血清：小牛血清对于维持培养细胞 的生存和促进细胞增殖起着关键性作用。可选择 多种不同批号的小牛血清进行小样分析。一旦确 定某一厂家的某一批号小牛血清后，就保持应用 至实验

4、完成。(4)胶原酶溶液：必须新鲜配制，贮存时间 过长(即使是-20C低温保存)，也将影响消化效 力，导致消化时间过长，细胞损伤增加。(5) L-谷氨酰胺：几乎所有细胞对谷氨酰胺 都有较高的要求，细胞需要谷氨酰胺合成核酸和 蛋白质，在缺少谷氨酰胺时，细胞会因生长不良 而死亡。谷氨酰胺在溶液中很不稳定，加有谷氨 酰胺的培养液在4c冰箱贮存两周以上时，就应 重新加入原来量的谷氨酰胺。(6)静置培养：原代细胞在消化分离后，置 于CO莓养箱的头2448h (必要时72h)内，应 处于绝对静置状态，切忌不时地取出培养瓶观察 生长状况，这将使原代分离细胞难以贴壁， 更谈 不上伸展和增殖，初学者尤应注意。不必

5、担心培 养液中的营养成分会消耗光，在细胞增殖之前对 营养的要求并不大。原代培养初期仅加一薄层培 养液的目的也在于有利于细胞贴壁伸展。(7)消化时间：一般消化至肉眼尚可见微小 组织颗粒即可，因为此时组织颗粒已经松散，略 经吹打即成细胞团或单个细胞，过久的消化往往导致细胞损伤加重，细胞培养成活率降低(8)其他生长因子：经过以上处理，一般原 代分离细胞培养均可以成功。对于少数特殊类型 细胞也可以考虑加一些特殊的生长因子，如胰岛 素能促使细胞摄取葡萄糖和氨基酸。 另外，内毒 素、EGF FGF等均有促有丝分裂作用，但费用 较高。二、传代培养及其操作步骤原代细胞培养成功以后，需要进行分离培养， 否则细胞

6、会因生存空间不足或密度过大，营养障 碍，影响细胞生长。细胞由原培养瓶内分离稀释 后传到新的培养瓶中培养的过程称之为传代培 养。传代细胞允许培养的细胞扩增(形成细胞株)，可以进行细胞克隆，易于保存，但可能丧 失一些特殊的细胞和分化特征。传代细胞形成细 胞株的最大利处在于提供了大量持久的实验材 料，便于实验。1.操作步骤(1)吸掉或倒掉培养瓶内旧培养液。(2)向瓶内加入胰蛋白酶液和 EDTA昆合液少 量。以能覆盖培养瓶底为宜。(3)置37c孵箱或室温(25c温度)下进行 消化，25min后把培养瓶放在倒置显微镜下进 行观察，当发现胞质回缩、细胞间隙增大后，应 立即中止消化。(4)吸出消化液，向瓶内

7、加入Hanks液少量, 轻轻转动培养瓶，把残留消化液冲掉，然后再加 培养液。如果仅使用胰蛋白酶消化，在吸除胰蛋 白液后，可直接加入少量含血清的培养液， 终止 消化。(5)使用弯头吸管，吸取瓶内培养液，按顺 序反复轻轻吹打瓶壁细胞，使之从瓶壁脱离形成 细胞悬液。吹打时动作要轻柔，以防用力过猛损 伤细胞。(6)用计数板计数后，分别接种于新的培养 瓶中，置CO莓养箱中进行培养。？?？(7)细胞培养换液时间应根据细胞生长的状 态和实验要求来确定。一般23d后应换一次生 长液。待细胞铺满器皿底面，即可使用；也可继续传代扩大培养或换成维持液。2.注意事项(1)掌握好细胞消化的时间，消化时间过短 时，细胞不

8、宜从瓶壁脱落，过长的消化会导致细 胞脱落、损伤。(2)掌握好消化浓度，当消化液浓度过高时, 消化时间应缩短，过低时细胞消化时间相对延 长。三、体内细胞培养及其操作步骤1.瘤细胞悬液接种(1)无菌选取生长良好(有光泽，淡红色)瘤 组织或对数生长期培养瘤细胞。(2)在PBS中将瘤组织剪碎后用匀浆器研磨，经80100目筛网过滤成细胞悬液。(3)培养细胞应用PBSa两遍。(4)计数并调整细胞浓度至107108/ml。(5)常规消毒后，于接种部位(通常为背部或 腋窝腹股沟皮下)用医用注射器皮下潜行一段后注入细胞悬液(0.1ml /部位，106细胞)。初次 接种成功率低，细胞数尽可能多一些。(6)次日注意

9、观察动物一般情况。初次接种 一般有一段较长的潜伏期，以后随着传代潜伏期 逐渐缩短，最后固定为一个相对稳定的时间。2.腹水瘤的建立与腹水瘤的接种 将实体瘤 细胞直接种于小鼠腹腔、腹壁或其他部位，引起 腹水，腹水中含有瘤细胞，将这种腹水反复传代， 即可成为腹水瘤。初次传代时，腹水常呈血性(含 大量红细胞)，反复传代后腹水逐渐变成乳白色。 腹水瘤的接种过程如下。(1)将冻存或培养的腹水瘤细胞离心和洗涤， 进行细胞计数。(2)消毒动物，左下腹穿刺接种106腹水瘤细 胞。(3)接种腹水瘤细胞后约712d,待小鼠腹部 明显膨大。用碘酒棉球消毒小鼠腹部，用 9号针 头抽取腹水，也可行腹部解剖后，用滴管吸取。

10、 每只小鼠可抽35ml。(4)抽取的腹水经3000rpm离心15min,收集 上清，分装冻存备用。四、培养细胞的冻存及复苏细胞低温冻存是培养室常规工作和通用技术。 细胞冻存在-196C液氮中，储存时间几乎是无限 的。细胞冻存及复苏的原则是慢冻快融。1 .冻存细胞(1)选对数增生期细胞(证明无支原体污染)， 在冻存前1d换液。(2)按常规方法把培养细胞制备成悬液，计 数，使细胞密度达5X107/ml左右密度，离心， 去上清。(3)加入配制好的冻存液(培养液6.8ml，小 牛血清 2ml, DMSOml, 5.6%NaHCO3.1ml),按 与去上清相同的量一滴一滴加入离心管中， 然后 用吸管轻轻

11、吹打令细胞重悬。冻存细胞时培养液 中加入保护剂10%二甲基亚碉(DMSO或甘油，可 使冰点降低，使细胞内水分在冻结前透出细胞 外。(4)分装于无菌冻存管中，每管加1.5m悬液。(5)旋好冻存管并仔细检查，一定要盖紧， 做好标记。(6)冻存：在特殊的仪器或简易的液氮容器 中，按-1C/min的速度，在3040min时间内， 下降到液氮表面，再停30min后，直接投入液氮中。要适当掌握下降冷冻速度，过快能影响细胞 内水分透出，太慢则促进冰晶形成。操作时应戴防护眼镜和手套，以免液氮冻伤。2 .复苏细胞(1)从罐中取出冻存管。(2)迅速放入36c37c水浴，不时摇动， 使其急速融化，3060s内完成。(3)冻存管用70%酒精擦拭消毒后，打开盖