第三章紫外可见分子荧光仪器分析

1、1第三章第三章 紫外及可见吸收光谱法紫外及可见吸收光谱法Ultraviolet and VisibleUV-Vis Spectrophotometry附：分子荧光和化学发光简介附：分子荧光和化学发光简介2l用于无机物和有机物的定量分析，也可以进行有机物的定性及结构分析 l较高的灵敏度（10-410-7gmL-1）和较高准确度 l仪器操作简单快速 3l本章讨论内容讨论光的吸收定律，主要介绍紫外及可见吸收法的应用，扼要介绍紫外及可见分光光度计和实验技术4一物质的颜色当光照射到物体上，光与物质发生相互作用，产生反射、散射、吸收或透射，对于均匀物体，光的散射可忽略一束光通过某一有色溶液，一些波长的光被

2、溶液吸收，另一些波长的光则透过透过光或反射光刺激人眼而使人感觉到颜色存在5l可见光：400750nml溶液的颜色由透射光波长决定l物质呈现的颜色是物质对不同波长的光选择必性吸收的结果如CuSO4溶液，吸收白光(复合光)中的黄光而呈蓝色6l复合光：一束具有多种波长的光 白光是一种复合光，它是由红、橙、黄、绿、青、蓝、紫等各颜色按一定比例混合而成的 l单色光：一束具有一种波长的光 7分子吸收光谱的产生 在分子中，除了电子相对于原子核的运动外，还有核间相对位移引起的振动和转动这三种运动能量都是量子化的，并对应有一定能级下图为分子的能级示意图 电子能级振动能级转动能级BA分子中电子能级、振动能级和转动

3、能级示意图8 图中A和B表示不同能量的电子能级在每一电子能级上有许多间距较小的振动能级，在每一振动能级上又有许多更小的转动能级 若用E电子、 E振动、 E转动分别表示电子能级、振动能级转动能级差，即有 E电子电子 E振动振动 E转动转动处在同一电子能级的分子，可能因其振动能量不同，而处在不同的振动能级上当分子处在同一电子能级和同一振动能级时，它的能量还会因转动能量不同，而处在不同的转动能级上所以分子的总能量可以认为是这三种能量的总和： E分子 = E电子 + E振动 + E转动9l当入射光子的能量 等于吸光物质的基态和激发态能量之差时才会被吸收l由于物质的分子（或离子）只有有限数目的量子化能级

4、，所以物质对辐射的吸收是有选择性的 l被激发的粒子在10-8s后又回到基态，并以热的形式或荧光等形式释放能量10l与光子碰撞发生能量转移 M + hv M* 基态 激发态 由于分子中的量子化能级是有限的，不同的物质微粒由于结构不同而具有不同的量子化能级，能级差不同，因此物质对光的吸收具有选择性11定义：将不同波长的光透过过某一固定浓度和厚度的有色溶液，测量每一波长下对光吸收程度，以波长为横坐标，吸光度为纵坐标作图，这种图谱称为该物质的吸收曲线 描述了物质对不同波长光的吸收能力12l不同浓度的同一物质，在吸收峰附近，吸光度随浓度增加而增大，但最大吸收波长不变l在最大吸收波长处测定，灵敏度最高l吸

5、收曲线是光度法中选择测定波长的重要依据KMnO4溶液的最大吸收波长为525nm, 吸收黄绿色的光，呈现紫红色133 分子吸收光谱类型分子吸收光谱类型 根据吸收电磁波的范围不同，可将分子吸收光谱分为远红外光谱、红外光谱及紫外、可见光谱三类 14一、朗伯-比尔定律朗伯定律-dI/I=KdbbKeII015比尔定律 光的吸收与溶液中吸光物质的浓度有关 朗伯定律中的比例常数与吸光物质的浓度成正比bcKeII 016朗伯比尔定律lgI0/I=kbc A=kbc k与物质的性质、入射光的波长及温度等因素有关吸光度与透光度的关系T=I/I0, A=lgI0/I A= lgT17吸光系数(a) 当c以gL-1

6、, b以cm表示时，常数K以a表示，称为吸光系数， 单位为Lg-1cm-1， 此时吸收定律为： A=abc 18摩尔吸光系数()浓度c用molL-1，液层厚度b以cm为单位时，则K用另来表示，称为摩尔吸光系数，其单位为Lmol-1cm-1, 摩尔吸光系数表示物质浓度为1molL-1，液层厚度为1cm时，溶液的吸光度 此时，吸收定律为 A=bc 19l显然，不能直接取1molL-1这样高浓度的吸光物质溶液来测量其摩尔吸光系数，只能通过计算求得l摩尔吸光系数表明物质对某一波长光的吸收能力，愈大，表示该物质对某波长光的吸收能力愈强，测定的灵敏度就愈高，因此进行吸收测量时，为了提高分析的灵敏度，必须选

7、择摩尔吸光系数大的化合物，以及选择具有最大值的波长作入射光20l实际上由实验结果计算时，常以被测物质的总浓度代替吸光物质的浓度，则得到的值实际上是表观摩尔吸光系数l吸光度具有加和性21 I0和I在实验室中都不容易加以测量，这是因为待测溶液必须装在吸收池内，辐射和器壁将相互作用，从而会因反射或吸收在每个界面上造成辐射强度的损失，因此在实际测定工作中，取另一个完全相同的吸收池，装溶剂作参比进行测定（图3-3） 2223 标准曲线应当成直线，但是当浓度大时，标准曲线不成直线的情形，特别是明显地看到标准曲线向浓度轴弯曲，个别情形也有向吸光度轴弯曲者 原因是多方面的，有的属于定律本身的基本限制，有的则同

8、测定吸收的方法有关，或者是浓度改变时伴随着化学变化 2425朗伯定律总是适用的 吸光度与液层厚度成正比比尔定律的条件 比尔定律只有在描述稀溶液的吸收时才是正确 吸光物质的高浓度（负偏离） 电解质的高浓度（负偏离）26在理想状况下，吸光物质的光学性质必须是均匀的，当试样为胶体、乳状液或有悬浮物质存在时，入射光通过溶液后，有一部分光会因散射而损失，使吸光度增大，对Beer定律产生正偏差质点的散射强度是与入射光波长的四次方成反比的，所以散射对紫外区的测定影响更大27l比尔定律只适用于单色光 l实际中入射光用的是复合光l举例：以两种波长的复合光作为入射光28l对1 A1=1bc (1)l对2 A2=2

9、bc (2) I0=I01+I02=f1I0+f2I0 (3) bcII1-01110bcII2-0221029l复合光通过溶液后 021lgIIIA0-2-10)1010(lg21IffIbcbc)1010lg(2121bcbcff(4)30l标准曲线是吸光度A与浓度c的关系曲线，其斜率可通过式(4)对c微分求得 (5) 当1=2=时，即当入射光为单色光时，式（5）变为 dA/dc=b (6)标准曲线的斜率为一定值，即符合比尔定律 )1010()1010(dd2121212211bcbcbcbcffbfbfcA31l当入射光为复合光时（12），标准曲线不再是直线关系，将式（5）对c微分，则(

10、7) (7)式右边恒为负值，说明用复合光作入射光时，标准曲线向浓度轴弯曲，使发生对于比尔定律的偏离 1与2相差愈大，吸收池愈厚，偏离比尔定律愈严重 2-2-1)( -22122122)1010(10)-(30. 2-dd2112bcbcbcffbffcA32实际上，在测量中，只要在入射光所包括的波长范围内，吸光物质的吸光系数没多大差别，对比尔定律的偏离一般是很小的由于溶液在紫外及可见区的吸收曲线一般比较平滑且较宽，这个条件容易达到，只需要所选用的入射辐射波长不在吸收曲线陡变部分即可（图3-6） 3334吸光物质的离解、缔合、形成新化合物及互变异构等化学变化往往也造成偏离比尔定律的现象 例如，K

11、2Cr2O7在溶液中有下列平衡：Cr2O72-+H2O 2HCrO4- 2H+CrO42- 350nm 370nm 橙色黄色35Cr2O72-: max=350nmCrO42-: max=370nm335nm, 445nm 等吸收点36l图3-7为K2Cr2O7和K2CrO4的吸收曲线（等吸收点、等吸收波长）l依吸光物质的性质，溶液中化学平衡的知识，对偏离加以预防和终止，也必须严格控制显色反应的条件，获得较好的测量结果37显色体系显色体系有色络合物在溶液中有一定程度的离解，其浓度不等于金属离子的总浓度如生成有色络合物的显色反应用下式表示 M +nLMLn选择MLn有强烈吸收而M和L都没吸收的波

12、长进行测定，络合物的稳定常数为稳KnnMLML38l以条件稳定常数表示，则 LMLMML稳稳KaaKnnnnnKLMML稳39上式中M、L分别为未络合的金属离子浓度和试剂浓度金属离子生成络合物MLn的分数为MLMMLMLMnnncnnKKL1L稳稳40 紫外-可见分光光度计的基本结构是由五个部分组成：即光源、单色器、吸收池、检测器和信号指示系统4142l要求 基本对光源的基本要求是应在仪器操作所需的光谱区域内能够发射连续辐射，有足够的辐射强度和良好的稳定性，而且辐射能量随波长的变化应尽可能小l分光光度计中常用的光源有热辐射光源和气体放电光源两类l热辐射光源用于可见光区，如钨丝灯和卤钨灯 43气

13、体放电光源用于紫外光区，如氢灯和氘灯钨灯和碘钨灯可使用的范围在340 2500nm这类光源的辐射能量与施加的外加电压有关，在可见光区，辐射的能量与工作电压4次方成正比光电流与灯丝电压的n次方（n1）成正比因此必须严格控制灯丝电压，仪器必须配有稳压装置 在近紫外区测定时常用氢灯和氘灯它们可在160 375 nm范围内产生连续光源氘灯的灯管内充有氢的同位素氘，它是紫外光区应用最广泛的一种光源，其光谱分布与氢灯类似，但光强度比相同功率的氢灯要大35倍44l钨丝灯45l多数吸收仪器中钨丝的工作温度在3000K左右，因此其发射能量的主要波长在红外区钨丝灯可用于3202500nm之间的波长区域l钨丝灯在可

14、见区的能量输出大约随工作电压的四次方而变化，为保持光源稳定，灯电源应加稳压装置 46l氢灯（气体放电光源）氢气在低压放电时，形成激发分子，此分子随后就离解产生两个氢原子和一个紫外辐射光子，由于离解的氢原子具有不同的动能，所以它们放出光子的能量在一连续的区域内，波长在160400nm之间一般氢灯的使用波长区域为200375nm47l在比色计中，一般用滤光器来获得一定波长的光辐射，在分光光度计中，则采用棱镜或光栅构成的单色器来获得纯度较高的单色光 l选择波长可使吸光度附合比尔定律，同时可提高测定的灵敏度、选择性48l作用吸收滤光器是通过吸收光谱的某些部分滤去不需要的波长以获得一定波长范围的辐射 在

15、比色计中应用l有色玻璃 、滤光片 49滤光片的透光曲线和半宽度 图示为蓝色滤光片，最大透过光的波长为470nm，半宽度为60nm. 光谱半宽度愈小，透过的单色光就愈纯 50l定义一种能将辐射分解成它的各成分波长，并能从中分出任一所需部分的仪器部件l单色器都含有狭缝和透镜系统，并有一个棱镜或光栅色散元件51 单色器是能从光源辐射的复合光中分出单色光的光学装置，其主要功能：产生光谱纯度高的波长且波长在紫外可见区域内任意可调 单色器一般由入射狭缝、准光器（透镜或凹面反射镜使入射光成平行光）、色散元件、聚焦元件和出射狭缝等几部分组成其核心部分是色散元件，起分光的作用单色器的性能直接影响入射光的单色性，

16、从而也影响到测定的灵敏度度、选择性及校准曲线的线性关系等5253l棱镜有玻璃和石英两种材料它们的色散原理是依据不同的波长光通过棱镜时有不同的折射率而将不同波长的光分开由于玻璃可吸收紫外光，所以玻璃棱镜只能用于350 3200 nm的波长范围，即只能用于可见光域内石英棱镜可使用的波长范围较宽，可从185 4000nm，即可用于紫外、可见和近红外三 个光域54ddddddnn式中：d /dn表示作为棱镜材料折射率函数的 的变化；dn/ d则表示折射率随波长的变化(3-4)55ld /dn的大小决定于棱镜的几何形状和入射角I，当入射角使辐射通过棱镜的走向几乎平行于棱镜底边时，d /dn就只取决于棱镜

17、顶角，并随增大而增大一般说，的上限约为60 ldn/d称为棱镜材料的色散率 56l科希提出材料的折射率与波长关系的经验公式42CBAn式中A、B和C是由材抖的特性决定的常数当波长间隔不太大时，取这个公式的前两项就够了 2BAn57将上式微分，得到32ddBn A、B都是正值，则波长增大时，折射率和色散率都减小 5859l注意：棱镜单色器色散具有非线性的特征l玻璃和石英对于紫外辐射都有较大的色散率，而对可见辐射具有较小的色散率，其中较好的是玻璃，因此可见分光光度计都使用玻璃棱镜，但玻璃对于紫外辐射有显著的吸收，所以紫外-可见分光光度计采用石英棱镜作为整个光谱区的色散元件 60 光栅是利用光的衍射

18、与干涉作用制成的，它可用于紫外、可见及红外光域，而且在整个波长区具有良好的、几乎均匀一致的分辨能力它具有色散波长范围宽、分辨本领高、成本低、便于保存和易于制备等优点缺点是各级光谱会重叠而产生干扰61l由狭缝来的辐射在各未刻部分发生反射，各反射光束之间的干涉则引起色散，因此光束1与光束2的光路之差为（AB CD），要发生干涉，必须m(AB CD) AB=dsini 式中d是刻线间的距离，称为光栅常数； i是入射光与法线间的夹角lCD- d sin 式中是衍射角，负号则表示入射光和反射光在法线异侧，如果二者在法线同侧，则取正号62l因此发生干涉的条件是 md（sinisin）(3-6)l m是谱线

19、的级数，该式说明对于某一给定的衍射角，存在不同的值，例如在 处出现有800nm的一级谱线（m1），则二级（400nm）和三级（267nm）谱线也在这个角度出现，造成了不同级次光谱的重叠 63l光栅的角色散率可在保持i不变的情形下，将式（3-6）对波长微分求得，即对任一给定的入射角 cosdddm 光栅常数愈小，角色散率愈大，即在单位长度内刻线数目愈多，角色散率愈大 64l在不同的光谱级次内角色散率也不相同，高级次的光谱有较大的角色散率在短波长范围内，cos并不明显的随波长而变，因此，光栅的色散几乎是线性分布的，这一点与棱镜的色散不同，图3-14就是在这方面对光栅单色器和棱镜单色器所作的比较 l

20、光栅可使用的波长范围很宽，从几个纳米到几百个微米,这也是比棱镜单色器优越的地方 65l单色器的狭缝对单色器质量有重要作用，一般说，入射狭缝和出射狭缝的大小相同，当单色器正好调节到相应辐射波长的位置上时，入射狭缝的像将恰好充满整个出射狭缝的宽度l单色器从照明入射狭缝的具有各种波长的辐射中分出单色辐射的能力，常用光谱带宽来量度 66l光谱带宽定义为入射狭缝的像从出射狭缝的一边移向另一边时所对应的波长间隔 （右图）l仪器的光谱带宽的大小随狭缝宽度的改变而变化l有效带宽仪器透过的波长范围的一半 67l 单色器的有效带宽与光栅及棱镜的色散及入射狭缝和出射狭缝的宽度有关l大多数单色器都采用可变狭缝，因此有

21、效带宽可以调节l在定性分析中需要分解比较窄的吸收带，应采用尽量小的狭缝宽度，这样有助于分开波长相近的光谱线，可以减少或消除光谱重叠引起的干扰l在定量分析中，可用较宽的狭缝，使光束有足够的强度以供测量 68l 与单色器光学元件一样，盛放试样的吸收池必须用所需光谱区辐射的材料制成l 吸收池的窗面应严格垂直于光束方向l采用光程长度和透明性都相同的吸收池，以使能正确比较透过溶剂和试液的辐射强度69l检测器的功能是检测信号、测量单色光透过溶液后光强度变化的一种装置l紫外及可见区用的检测器主要有光电池、光电管和光电倍增管 70l响应一个很大波长范围内的辐射能 ；l对弱的辐射也应有足够的灵敏度 ；l能快速回

22、答一个容易放大而噪声低的电信号；l产生的电信号应正比于投射到检测器上的光束强度，且有宽的线性范围 这是定量的基础71l硒光电池，它对于550nm左右的绿色光有最大灵敏值，而且在250nm和750nm处其响应减少至最大值的10%硒光电池主要用于可见辐射的检出和测量 l主要用于可见辐射的检出7273l光电管是由封装在真空透明泡中的一个半圆柱形阴极和一个丝（状）阳极组成，阴极的凹面有光电发射材料层，在受光照射时，如果光子的能量超过阴极光电材料的功函数时，便有电子发射出来，所经过的时间最多不超过10-9秒的数量级l当在两级间加有电压时，发射的电子就流向丝阳极而产生光电流，对于给定的照射光强度，它所产生

23、电流大约为光电池的1/4，但光电管有很高的内阻，所产生的光电流很容易放大 74l对于低辐射强度的测量，光电倍增管要比普通光电管优越得多一般说，它的灵敏度比光电管高200多倍 l光电倍增管由阴极和多个附加极组成 l光电倍增管易被强辐射损坏，所以只可用于低辐射强度的测量因此光电倍增管必须安装在暗室中，并仔细屏蔽杂散光的影响 75l光电二极管是在硅片上形成的反向偏置的pn结所构成当受到辐射照射时，产生空穴和电子，空穴扩散通过过渡层到p区，然后湮灭，由此引起电子空穴对的产生与复合，使得导电性增强，其大小与光强成正比 l当阵列的一面受辐射照射时，吸收光子产生电子空穴对，使pn结部分放电，每一个光电二极管

24、有一个积贮光电流的存储电容器，通过扫描电路，周期地顺序读取各个存储电容器中存储的电荷，达到检测出相应的光信息 76（五）信号指示系统（五）信号指示系统(读数指示器读数指示器) 它的作用是放大信号并以适当方式指示或记录下来常用的信号指示装置有直读检流计、电位调节指零装置以及数字显示或自动记录装置等很多型号的分光光度计装配有微处理机，一方面可对分光光度计进行操作控制，另一方面可进行数据处理77l指示系统直读检流计、电位调节指零装置、数字显示和自动记录装置等l直读检流计0100，线性标尺表示透光率 ，对数标尺表示吸光度l吸光度与透光率是负对数关系，吸光度标尺的刻度是不均匀的0781.单光束分光光度计

25、l单光束分光光度计光路示意如图3-8所示(仪器部件)，经单色器分光后的平行光通过吸收池，进入检测器，进行吸光度的测定其结构简单，操作方便，适用于常规分析l属于此类光度计的有国产72型、721型、723型、751型和752型等l结构简单，操作方便，维修容易，适用于常规分析7980l将单色器所得的单色辐射，用切光器分成两个光束，分别通过试样溶液和溶剂溶液，这两个光束可通过与前一切光器同步的另一切光器在不同时间内交替由一个检测器来接受，并通过一个光电计时信号系统把来自两个光束的信号加以比较，获得吸光度 81l双光束分光光度计一般都能自动记录吸收光谱曲线l双光束仪器由于样品溶液与溶剂的对比几乎是同时进

26、行的，光源和检测系统的漂移可以得到一些补偿l由于两束光同时分别通过参比池和样品池，还能自动消除光源强度变化所引起的误差82l这种仪器是将一共同光源发出的辐射通过一特制的单色器，此单色器内设有两个可以单独调节的光栅，经光栅色散后，两种波长的辐射交替通过切光器，又重新合并成同一光束，经过试液后到达光电倍增管，仪器配有一个同步开关装置以区别接通相应于各光束的电信号，经过仪器内的电子学单元装置可测量两种波长的吸光度差值A，其方框图如图3-28所示 83根据两波长1和2处吸光度差值A与吸光物质浓度c的关系进行分析的 84bcIIA)()()(0)(1111lgbcIIA)()()(0)(2222lg调节

27、仪器使两者入射光强度相同)(0)(021II85l即在两波长处吸光度差A与物质浓度c成正比)()()()(1221lgIIAAAbc)()(2186右图中，B是待测组分，A是共存组分B浓度与吸光度差值成正比 87一、仪器测量误差1 测量误差的来源光源的不稳、检测器不灵敏和光电流测量不准确等等，在仪器透光率读数尺上表现为读数误差T对于同一台光度仪器，T基本上为一常数，一般为0.010.002这个读数误差是限制光度分析准确度的主要原因 88lTc之间关系为对数性质，同样， T对不同浓度的溶液造成的c不同l当被测物质浓度很小时，由T造成的c也很小，但由于浓度c本身很小，相对误差c/c仍然较大l当被测

28、物质的浓度很大时，由T 造成的c很大，所以相对误差c/c也较大 89l依比尔定律 A=-lgT=abcl将上式写成自然对数并微分90l浓度测量误差不仅与仪器的绝对误差有关，而且还与它本身的透光率有关 cabTTInTTddd434. 0434. 0lgTTTccdlg434. 0dTTTcclg434. 091l要使c/c最小，TInT应最大，即：434. 0lg368. 0010)(TATInTTInTTdT92lT=1565%(A=0.20.8)范围内，浓度测量的相对误差较小lA过大或过小，误差非常大，不适于高含量或较低含量组分的测定l为了控制合适的读数范围，宜采取的方法有：1)控制溶液的

29、浓度；2)选择不同厚度的吸收池93辐射波长和狭缝宽度的选择根据吸收曲线，选择溶液具有最大吸收时的波长为宜优点：摩尔系数大，测定灵敏度高；在此波长处的一个较小范围内，吸光度随波长变化不大，不会造成对比尔定律的偏离，测定有较高的准确度94l狭缝的宽度直接影响到测定的灵敏度和标准曲线的线性范围狭缝宽度增大，入射光的单色性降低，在一定程度上使灵敏度下降，标准曲线偏离比尔定律，狭缝的宽度以减小狭缝宽度时，试样的吸光度不再增加为止一般情况下，狭缝宽度约是吸收峰半宽度的1/1095l控制标准溶液和被测溶液的吸光度在0.20.8范围内l可以从控制溶液浓度和选择不同厚度的吸收池来考虑 96l影响一种溶液吸收光谱

30、的常见变量有溶液的酸度、温度、高电解质浓度、溶剂的性质和存在的干扰物质等l必须了解这些变量的影响，选择控制这些变量的条件 97l总原则：试液的吸光度真正反映待测物的浓度l测量吸光度时，利用参比溶液来调节仪器的零点，可以消除由于吸收池器壁及溶剂对入射光的反射和吸收带来的误差A=lgI0/I=I参比I试液98l仅待测物与显色剂的反应产物有吸收，可用纯溶剂作参比溶液l若显色剂或其它试剂略有吸收，应用空白溶液（不加试样）作参比l试样中其它组份有吸收，但不与显色剂反应，则当显色剂无吸收时，选用试样溶液作参比溶液（不加显色剂）；当显色剂略有吸收时，在试样中加入适当掩蔽剂，再加显色剂，以此溶液作参比溶液99

31、l进行比色分析或光度分析时，常需把待测组份转化为有色或有吸收的化合物，然后进行测定l显色反应：将待测组份转变成有色化合物的反应l显色剂：与待测组份形成有色化合物的试剂l在分析工作中选择合适的显色反应，并严格控制反应条件，是十分重要的 100显色反应可分为两大类，即络合反应和氧化还原反应，而络合反应是最重要的显色反应同一组分常可与多种显色剂反应，生成不同的有色物质，在分析时，究竟选用何种显色反应较适宜，应考虑以下因素 101l光度法一般用于微量组分的测定，因此，选择灵敏的显色反应是应考虑的主要方面摩尔吸光系数的大小是显色色反应灵敏度高低的重要标志，因此应当选择生成的有色物质的较大的显色反应一般来

32、说，当值为104105时，可认为该反应灵敏度较高102 选择性好指显色剂仅与一个组分或少数几个组分发生显色反应 仅与某一种离子发生反应者称为特效的(或专属的）显色剂这种显色剂实际上是不存在的，但是干扰较少或干扰易于除去的显色反应是可以找到的 103l这样，试剂空白值小，可以提高测定的准确度通常把两种有色物质最大吸收波长之差称为“对比度”，一般要求显色剂与有色化合物的对比度L在60 nm以上 104l对于形成不同络合比的络合反应，必须注意控制实验条件，使生成一定组成的络合物，以免引起误差 l性质稳定，至少保证在测量过程中溶液的吸光度变化小这就要求有色化合物不容易受外界环境条件的影响，如日光照射、

33、空气中的氧和二氧化碳的作用等，此外，亦不应受溶液个其他化学因素的影响否则将影响吸光度测定的准确度及再现性 105l吸光光度法是测定显色反应达到平衡时溶液的吸光度，因此要能得到准确的结果，必须从研究平衡着手，了解影响显色反应的因素，控制适当的条件，使显色反应充全和稳定l现对显色的主要条件讨论如下 106l 显色反从一般可用下式表示： M 十 nR MRn (待测组分)(显色剂) (有色化合物) nnnRMMR或nnnRMMR 107l式中M代表金属离子，R为显色剂，n为络合物的累积稳定常数由上式可见，当R固定时，从M转化成MRn的转化率将不发生变化对稳定性好的（即n大）络合物，只要显色剂过量，显

34、色反应即能定量进行而对不稳定的络合物或可形成逐级络合物时，显色剂用量要过量很多或必须严格控制 108l根据溶液平衡原理，有色络合物稳定常数愈大，显色剂过量愈多，愈有利于待测组分形成有色络合物但是过量显色剂的加入，有时会引起副反应的发生，对测定反而不利显色剂的适宜用量常通过实验来确定 109l其方法是将待测组分的浓度及其它条件固定，然后加入不同量的显色剂，测定其收光度，绘制吸光度(A)浓度(c)关系曲线，一般可得到下图所示三种不同的情况： 图3-01 吸光度与显色剂浓度的关系曲线 110a)影响显色剂的平衡浓度和颜色l 由于大多数有机显色剂是有机弱酸，在溶液中存在着下列平衡： M + HR MR

35、 + H+ 增大H+，对显色反应不利酸度改变，将引起平衡移动，从而影响显色剂及有色化合物的浓度变化，可能引起配位基团(R-)数目的改变以致改变溶液的颜色 111l酸度对待测离子存在状态及是否发生水解也是有影响的酸度太低，水解水解反应的存在对显色反应不利发生成沉淀，则使显色反应无法进行lpH值增大会引起某些金属离子水解而形成各种型体的羟基络合物，甚至可能析出沉淀；或者由于生成金属的氢氧化物沉淀而破坏了有色络合物，使溶液的颜色完全退去 112l对于生成逐级络合物的显色反应，酸度不同，络合物的络合比往往不同，其颜色也往往不同 l由于pH值不同，可形成具有不同配位数、不同颜色的配台物金属离子与弱酸阴离

36、子在酸性溶液中大多生成低配位数的配合物，可能并没有达到阴离子的最大配位数当pH值增大时，游离的阴离子浓度相应增大，使得可能生成高配位效的化合物 113l如磺基水杨酸与Fe3+的显色反应，在不同酸度下，可能生成1:1、1:2和1:3三种颜色不同的络合物，因此在用这类反应进行测定时，控制溶液的pH至关重要lpH值范围 络合物组成 颜 色 1.84 Fe(C7H4O3)+ 紫红色 48 Fe(C7H4O3)2- 棕褐色 811.5 Fe(C7H4O3)33-黄色 114l一种金属离子与某种显色剂反应的适宜酸度范围，是通过实验来确定的l确定的方法是固定待测组分及显色剂浓度，改变溶液pH值，测定其吸光度

37、作出吸光度与pH关系曲线，如图所示选择曲线平坦部分对应的pH值作为测定条件 115l显色反应一般在室温下进行，有的反应则需要加热，以加速显色反应进行完全有的有色物质当温度偏高时又容易分解为此，对不同的反应，应通过实验找出各自适宜的温度范围116l大多数显色反应需要经一定的时间，才能完成时间的长短又与温度的高低有关有的有色物质在放置时，受到空气的氧化或发生光化学反应，会使颜色减弱因此必须通过实验，作出在一定温度下(一般是室温下)的吸光度时间关系曲线，求出适宜的显色时间 117l光度分析中，体系内存在的干扰物质的影响有以下几种情况：1)共存离子如本身有颜色，或与显色剂作用生成有色化合物，在测定条件

38、下也吸收；2)在显色条件下，干扰物质水解，析出沉淀使溶液混浊，致使吸光度的测定无法进行；3)与待测离子或显色剂形成更稳定的络合物，使显色反应不能进行完全都将干扰测定 118l (1)加入络合掩蔽剂或氧化还原掩蔽剂，使干扰离子生成无色络合物或无色离子l(2)选择适当的显色条件以避免干扰l(3) 利用校正系数l(4) 利用参比溶液消除显色剂和某些共存有色离子的干扰l(5)选择适当的波长l(6)分离干扰离子1191 无机显色剂l无机显色剂在光度分析中应用不多，这主要是因为生成的络物不够稳定，灵敏度和选择性也不高目前，应用较多的仅有硫氰酸盐、钼酸铵和过氧化氢等下表列出了它们的些应用 120121l大多

39、数有机显色剂常与金属离子生成稳定的螯合物，显色反应的选择性和灵敏度都较高有些有色螯合物易溶于有机溶剂，故可进行萃取光度法，进一步提高测定的灵敏度和选择性 l它广泛应用于吸光光度分析中正是由于有机显色剂的研制和应用，推动了吸光光度分析法的应用和发展l目前研制高灵敏度和高选择性的显色剂仍然是吸光光度法研究中的重要课题 122l有机显色剂及其产物的颜色与它们的分子结构有密切关系根据实践得知分子中含有一个或一个以上的某些不饱和基团(共轭体系)的有机化合物，往往是有颜色的，这些基团称为发色团(或生色团)l 有机显色剂中一般都含有生色团和助色团 123l生色团有机化合物分子中的不饱和键基团，能吸收波长大于

40、200nm的光这种基团称为广义的生色团例如，偶氮基(一N=N一)、羰基(C=O)、硫碳基(C=S)、亚硝基(一N=O)等 124l助色团某些含有弧对电子的基团，虽然本身没有颜色，但它们的存在却会影响有机试剂及其与金属离子的反应产物的颜色，这些基因称为助色团 l助色团与生色团上的不饱和键相互作用，可以影响有机化合物对光的吸收，使颜色加深例如，胺基(-NH2、RNH-或R2N-)、羟基(-OH)、巯基(-SH)、-Cl-、-Br-等 125l凡含有偶氮结构的有机化合物，都是带色的物质 l当偶氮基两端与芳烃碳原子相连，而且在其邻位上有一定的络合基团(-OH， -AsO3H2、-COOH，-N)时，此

41、类化合物在一定的条件下就能与某些金属离子作用，改变生色团的电子云结构，使颜色发生明显的变化 126l 根据连接在偶氮基两边的芳香基团以及结合基团的不同，可得到一类品种繁多的显色剂 l偶氮类显色剂具有性质稳定、显色反应灵敏度高、选择性好、对比度大等优点，所以是目前应用最广泛的一类显色剂其中以偶氮胂III、PAR等最为突出 127l吸收光谱法是测量微量组分的一种很好的方法，也能用于常量组分和多组分的测定，同时分光光度法还广泛应用于化学平衡的研究，以及有机物结构的测定等等 128l特点）应用广泛 ）灵敏度高 ）好的准确度 ）选择性较好 ）仪器设备比较简单，容易推广应用，采用现代仪器，测定容易掌握且快

42、速 129l单组份定量方法l1) 标准曲线法l2) 标准对比法：是标准曲线法的简化，即只配制一个浓度为Cs的标准溶液，并测量其吸光度，求出吸收系数k，然后由Ax=kcx求出cx该法只有在测定浓度范围内遵守L-B定律，且Cx与Cs大致相当时，才可得到准确结果130l吸光度具有加和性溶液中含有数种吸光物质，则在给定波长处总吸光度等于各个成分吸光度的总和 l对于含多组分的溶液，在各组分的吸收光谱互不干扰时，可以不经分离，在各自最大吸收波长处进行测定，与单组分测定的情形相同 131l各组份相互重叠示例132lCr2O72-的最大吸收波长为350nm, MnO42-的最大吸收波长为525nm，设在350

43、nm(1)和525nm(2)所测得的和的吸光度分别为 Mn)(MnCr)(Cr)(111bcbcAMn)(MnCr)(Cr)(222bcbcA则解这个联立方程式，即可求得两种组分的含量 133l适用于较高含量组份的测定l 示差分光光度法采用一个比被测溶液浓度稍低的标准溶液作为参比溶液，以代替一般分光光度法所使用的参比溶液 134l三束同一波长、相同强度的光，投射到三个完全相同的吸收池上三个吸收池中各装有纯溶剂，吸光物质浓度为cs的标准溶液和浓度为cx的未知溶液将透过溶液以后的光的强度同透过溶剂的光的强度相比较，则以溶剂为参比溶液时比尔定律表示为135l而浓度为cs和cx两个溶液透过光强度之比为

44、sabcsII100 xabcxII100sxabcabcIIII101000sx136cabIIAxsf lg式中Af为浓度为cs的标准溶液作参比溶液时，溶液cx的表观吸光度上式表明在符合比尔定律的浓度范围内，示差分光光度法所读取的表观吸光度Af同浓度差c成正比，这就是示差法的基本原理 137l式中Tf为被测溶液以标准溶液cs为参比时的表观透光率，Ts是标准溶液的透光率)lg(434. 0sfffTTTTcc138参比溶液的透光率Ts越小越好但参比溶液越浓，Ts越小，透过溶液作用于检测器的光的强度越弱只有当仪器有足够灵敏度时才能将透光率读数调节到满刻度（Ts100 %），因此参比溶液的浓度，

45、受仪器灵敏度的限制139l导数光谱法是解决干扰物质与被测物质的吸收光谱重叠，消除胶体和悬浮物散射影响和背景吸收，提高光谱分辨率的一种技术 l比尔定律：II0exp(-bc)对波长求一阶导数)exp(dd)exp(dddd00bcbcIbcII140l通过仪器自动控制狭缝或通过放大的自动电路调节，使I0在整个波长范围内保持恒定，即使dI0d0，则ddddIbcI这时导数信号与浓度成正比，测定的灵敏度与dd有关141同样，对波长求二阶和三阶导数，得2222222dd)dd(ddIbccIbI33222233333dddddd3)dd(ddIbcbcIbI当dd0时，上两式变为2222ddddIbc

46、I3333ddddIbcI此时二阶和三阶导数信号与浓度成正比，测定的灵敏度分别与d2d2和d3d3有关142 图3-36为物质的吸收光谱(零阶导数光谱)和它的14阶导数光谱图由图可见，随着导数的阶次增加，谱带变得更加尖锐，分辨率提高143l分光光度法是研究络合物组成和测定不稳定常数的十分有效的方法它的优点是进行吸光度测量时，体系的平衡状态不受干扰 l量比法、斜率比法、连续变化法和平衡移动法 l吸光度的测定多采用单波长分光光度计 144l这种方法是固定金属离子M的浓度，改变络合剂L的浓度，得到LM一系列比值不同的溶液，配制相应的参比溶液，在选定的波长处测量吸光度如果在这一波长络合物有吸收而络合剂

47、和金属离子没有吸收，则吸光度与溶液中的络离子浓度成正比，以吸光度A为纵坐标，LM为横坐标作图（图3-38） 145l当cL/cMn，金属离子几乎全部生成络合物MLn，吸光度不再改变，两条直线的交点所对应的横坐标cL/cM比值若为n，则络合物的络合比为1:n146147l利用图上“计量点”附近曲线弯曲的程度，可以用来计算络合物的不稳定常数l对于1:1的络合物的曲线可分析如下： 溶液中M的总浓度为c，则在“计量点”时，L的总浓度也是c，这时溶液的吸光度为A当L大量存在时，M应全部形成ML，这时的吸光度可从图3-38中找到，以Am表示，则 148cAAMLmM = L = c ML = c (1 A

48、/Am)cAAAAm2m/)/(1 K不稳149l在保持溶液中 cM+cR=c(定值)的前提下，改 变cM与cR的相对比例，制备一 系列溶液，以各自的空白溶液作参 比，在络合物的最大吸收波长下， 测量它们的吸光度，以吸光度为纵坐标，以cM/cf为横坐标，由作图法求得络合比 图中的曲线，是由一组实 验数据绘成的将曲线两边的直线部分延长，相交于B点，B点处的f 值恰为0.5表示M与R的络合比 为1:1 150l从图中可以看出当形成1：1络合物时，若当它全部以MR形 式存在时，则应该具有B点处的吸光度A 实际上它们仅具有B，处的吸光度A基原因是络合物有部分离解 151l根据A与A差别可求得络合物的离

49、解度a为：a=(A-A)/Al络合物的稳定常数为：21 caaRMMRK稳152l光度测量可用于确定滴定的终点光度滴定通常都是用经过改装的在光路中可插入滴定容器的分光光度计或光电比色计来进 行的测定滴定过程中溶液的吸光度，并绘制滴定剂体积和对应 的吸光度的曲线，根据滴定曲线就可确定滴定终点153l用光度法以0.1mol/LEDTA溶液滴定100ml 0.02mol/L Bi3+和Cu2+溶液的滴定曲线(所用波长为745nm)1541有机化合物的吸收特性(1)几个概念生色团从广义来说，所谓生色团，是指分子中可以吸收光子而产生电子跃迁的原子基团但是，人们通常将能吸收紫外、可见光的原子团或结构系统定

50、义为生色团凡是在饱和碳氢化合物中，引入一个原子基团，而它能使该化合物在2001000nm波长的光谱区内产生吸收带，这种基团叫做生色团，生色团都是具有轨道的原子团 155生色团溶剂/nmmax跃迁类型烯正庚烷17713000*炔正庚烷17810000*羧基乙醇20441n*酰胺基水21460n*羰基正己烷1861000n*， n*偶氮基乙醇339，665150000n*，硝基异辛酯28022n*亚硝基乙醚300，665100n*硝酸酯二氧杂环己烷27012n*156主要的生色团有-C=O，-N=N-，-N=O等 助色团 助色团是指带有非键电子对的基团，如-OH、 -OR、 -NHR、-SH、-C

51、l、-Br、-I等，它们本身不能吸收大于200nm的光，但是当它们与生色团相连时（与具有轨道的生色团相结合 ），会使生色团的吸收峰向长波方向移动，并且增加其吸光度157红移与蓝移（紫移）红移与蓝移（紫移） 某些有机化合物经取代反应引入含有未共享电子对的基团（ -OH、 -OR、 -NH2、-SH 、-Cl、-Br、-SR、- NR2 ）之后，吸收峰的波长将向长波方向移动，这种效应称为红移效应这种会使某化合物的最大吸收波长向长波方向移动的基团称为向红基团158l那么影响红移或蓝移的因素有哪些呢？l共轭体系的存在-红移如CH2=CH2的-*跃迁，max=165200nm;而1,3-丁二烯，max=

52、217nml异构现象：使异构物光谱出现差异如CH3CHO含水化合物有两种可能的结构：CH3CHO-H2O及CH3CH(OH)2; 在已烷中，max=290nm,表明有醛基存在，结构为前者；而在水溶液中，此峰消失，结构为后者159l空间异构效应-红移 如CH3I-258nm, CH2I2-289nm, CHI3-349nml基团取代 如苯环或烯烃上的H被各种取代基取代，多产生红移lpH值 苯酚在酸性或中性水溶液中，有210.5nm及270nm两个吸收带；而在碱性溶液中，则分别红移到235nm和 287nm.160l溶剂的影响l随溶剂极性增加，吸收光谱变得平滑，精细结构消失；l可以改变max位置(

53、由n-*跃迁产生的吸收峰，随溶剂极性增加，形成H键的能力增加，发生蓝移；由-*跃迁产生的吸收峰，随溶剂极收增加，发生红移)161图图3-41 分子的电子能级跃迁形式分子的电子能级跃迁形式 162 在紫外和可见光谱区范围内，有机化合物的吸收带主要由*、*、n*、n*及电荷迁移跃迁产生无机化合物的吸收带主要由电荷迁移和配位场跃迁（即d-d跃迁和f-f跃迁）产生 163l由于电子跃迁的类型不同，实现跃迁需要的能量不同，因此吸收光的波长范围也不相同其中*跃迁所需能量最大，n*及配位场跃迁所需能量最小，因此，它们的吸收带分别落在远紫外和可见光区从图中 可知，*（电荷迁移）跃迁产生的谱带强度最大，*、n*

54、、n*跃迁产生的谱带强度次之，配位跃迁的谱带强度最小164a)跃迁类型跃迁类型 基态有机化合物的价电子包括成键电子、成键电子和非键电子（以n表示）分子的空轨道包括反键 *轨道和反键*轨道，因此，可能的跃迁为*、*、n* n*等 (i)*跃迁 它需要的能量较高，一般发生在真空紫外光区饱和烃中的-C-C-键属于这类跃迁，例如乙烷的最大吸收波长max为135nm165(ii)n*跃迁 实现这类跃迁所需要的能量较高，其吸收光谱落于远紫外光区和近紫外光区，如CH3OH和CH3NH2的n*跃迁光谱分别为183nm和213nm(iii)*跃迁 它需要的能量低于*跃迁，吸收峰一般处于近紫外光区，在200 nm

55、左右，其特征是摩尔吸光系数大，一般max104，为强吸收带如乙烯（蒸气）的最大吸收波长max为162 nm166(iv)n*跃迁 这类跃迁发生在近紫外光区它是简单的生色团如羰基、硝基等中的孤对电子向反键轨道跃迁其特点是谱带强度弱，摩尔吸光系数小，通常小于100，属于禁阻跃迁 (v)电荷迁移跃迁 所谓电荷迁移跃迁是指用电磁辐射照射化合物时，电子从给予体向与接受体相联系的轨道上跃迁因此，电荷迁移跃迁实质是一个内氧化还原的过程，而相应的吸收光谱称为电荷迁移吸收光谱167b)有机化合物紫外有机化合物紫外-可见吸收光谱可见吸收光谱1)饱和烃及其取代衍生物饱和烃及其取代衍生物 饱和烃类分子中只含有键，因此

56、只能产生*跃迁，即电子从成键轨道（ ）跃迁到反键轨道（ *）饱和烃的最大吸收峰一般小于150nm，已超出紫外、可见分光光度计的测量范围168 饱和烃的取代衍生物如卤代烃，其卤素原子上存在n电子，可产生n* 的跃迁 n* 的能量低于*例如，CH3Cl、CH3Br和CH3I的n* 跃迁分别出现在173、204和258nm处这些数据不仅说明氯、溴和碘原子引入甲烷后，其相应的吸收波长发生了红移，而且显示了助色团的助色作用 直接用烷烃和卤代烃的紫外吸收光谱分析这些化合物的实用价值不大但它们是测定紫外和（或）可见吸收光谱的良好溶剂169 2)不饱和烃及共轭烯烃不饱和烃及共轭烯烃 在不饱和烃类分子中，除含有

57、键外，还含有键，它们可以产生*和*两种跃迁 *跃迁的能量小于 *跃迁例如，在乙烯分子中， *跃迁最大吸收波长为180nm 在不饱和烃类分子中，当有两个以上的双键共轭时，随着共轭系统的延长， *跃迁的吸收带 将明显向长波方向移动，吸收强度也随之增强在共轭体系中， *跃迁产生的吸收带又称为K带170化合物溶剂max/nmmax1,3-丁二烯己烷21721，0001,3,5-己二烯异辛烷26843，0001,3,5,7-辛四烯 环己烷3041,3,5,7,9-癸四烯异辛烷334121，0001,3,5,7,9,11-十 二烷基六烯异辛烷364138，0001713)羰基化合物羰基化合物 羰基化合物含

58、有C=O基团 C=O基团主要可产生*、 n* 、n*三个吸收带， n*吸收带又称R带，落于近紫外或紫外光区醛、酮、羧酸及羧酸的衍生物，如酯、酰胺等，都含有羰基由于醛酮这类物质与羧酸及羧酸的衍生物在结构上的差异，因此它们n*吸收带的光区稍有不同172l羧酸及羧酸的衍生物虽然也有n*吸收带，但是， 羧酸及羧酸的衍生物的羰基上的碳原子直接连结含有未共用电子对的助色团，如-OH、-Cl、-OR等，由于这些助色团上的n电子与羰基双键的电子产生n共轭，导致*轨道的能级有所提高，但这种共轭作用并不能改变n轨道的能级，因此实现n* 跃迁所需的能量变大，使n*吸收带蓝移至210nm左右1734)苯及其衍生物苯及

59、其衍生物 苯有三个吸收带，它们都是由*跃迁引起的E1带出现在180nm（MAX = 60,000）； E2带出现在204nm（ MAX = 8,000 ）；B带出现在255nm （MAX = 200）在气态或非极性溶剂中，苯及其许多同系物的B谱带有许多的精细结构，这是由于振动跃迁在基态电子上的跃迁上的叠加而引起的在极性溶剂中，这些精细结构消失当苯环上有取代基时，苯的三个特征谱带都会发生显著的变化，其中影响较大的是E2带和B谱带174175 产生无机化合物紫外、可见吸收光谱的电子跃迁形式，一般分为两大类：电荷迁移跃迁和配位场跃迁（一）电荷迁移跃迁（一）电荷迁移跃迁 无机配合物有电荷迁移跃迁产生的

60、电荷迁移吸收光谱176l 在配合物的中心离子和配位体中，当一个电子由配体的轨道跃迁到与中心离子相关的轨道上时，可产生电荷迁移吸收光谱 不少过渡金属离子与含生色团的试剂反应所生成的配合物以及许多水合无机离子，均可产生电荷迁移跃迁 此外，一些具有d10电子结构的过渡元素形成的卤化物及硫化物，如AgBr、HgS等，也是由于这类跃迁而产生颜色 电荷迁移吸收光谱出现的波长位置，取决于电子给予体和电子接受体相应电子轨道的能量差177（二）配位场跃迁（二）配位场跃迁 配位场跃迁包括d - d 跃迁和f - f 跃迁元素周期表中第四、五周期的过度金属元素分别含有3d和4d轨道，镧系和锕系元素分别含有4f和5f