单核细胞增生李斯特菌：无菌斑马鱼感染模型及Mmp-9在抗细菌感染中的作用机制

1、单核细胞增生李斯特菌：无菌斑马鱼感染模型及Mmp9在抗细菌感染中的作用机制单核细胞增生李斯特菌(Listeria monocytogenes,简称单增李斯特菌)作为四 大食源性病原菌之一，在环境中广泛存在，且对不良环境的耐受能力较强。人和动 物食用了单增李斯特菌污染的食物后，细菌进入消化道并跨越宿主肠道屏障，随血液 循环分布至全身脏器中，或穿过血脑屏障和胎盘屏障造成脑炎和流产等。单增李斯特菌拥有一套十分强大的毒力因子系统，感染过程中对宿主细胞的黏 附和侵袭、细胞内增殖和细胞间扩散的每一步都由特定的毒力因子介导。内化素 A(lnlA)是该菌介导细菌黏附细胞的分子之一，能够与宿主细胞表面的E钙黏蛋

2、白 共价结合,不同种宿主的E钙黏蛋白识别位点不同，因此InIA的识别具有宿 主特异 性。经口感染单增李斯特菌在人源细胞上的黏附效率比在小鼠细胞上更高，是由于 小鼠肠上皮细胞的E-钙黏蛋白与人的在第16位氨基酸上有差异,不能与InIA有效结 合。而斑马鱼的E钙黏蛋白在此位点上与人相同。斑马鱼作为重要的模式脊椎动物之一，具有繁殖能力强、体外受精和发育、性 成熟周期短，胚胎透明、易于遗传操作等诸多优点。斑马鱼具有与哺乳动物相似类型 的免疫细胞，且先天免疫系统在胚胎时期独立于后天免疫而存在。以斑马鱼为模式动物建立病原微生物感染模型，对于病原的致病机制、宿主的 先天免疫功能和病原与宿主之间互作关系的研究

3、具有重要意义。然而普通斑马鱼饲 养环境及其肠道内的微生物可能会影响特定病原感染的研究，因此以斑马鱼为模型进 行感染与免疫研究需采用无菌斑马鱼。本研究旨在:(1)建立无菌斑马鱼胚胎培养体系；(2)建立单增李斯特菌多种 途 径感染无菌斑马鱼胚胎的方法；(3)探明李斯特菌感染无菌斑马鱼胚胎转录组 学特 征；探明基质金属蛋白酶9(Mmp-9)在介导巨噬细胞迁移和抗感染中的作用机制。1 斑马鱼胚胎的无菌培养及评价斑马鱼胚胎时期，后天免疫尚未发育(受精后46 周)，该时期是研究先天免疫功能的最佳时期。由于斑马鱼生活环境中微生物易大量繁殖，斑马鱼肠道中也有共生的微生物 菌 群，会激活斑马鱼先天免疫系统，从而

4、影响试验结果。本研究成功建立了斑马鱼胚胎 培育的无菌操作系统，无菌检验显示其生活环境及体内未检测到能形成菌落的病原微 生物,先天免疫分子Toll样受体分子(Toll-likereceptors,TLRs)表达量较低或不表达，而常规培养斑马鱼以及浸泡感染单增李斯特菌的无菌斑马鱼中这些 基因转录水平较咼。我们认为该无菌系统培育的斑马鱼胚胎能够达到“相对无菌乃，其先天免疫尚 未激活，可应用于免疫系统功能、肠道固有菌群功能和特定病原感染机制等研究中。 2单增李斯特菌不同感染途径对斑马鱼致病性的影响卵黄注射单增李斯特菌强毒株 EGDe能够引起斑马鱼迅速死亡，注射EGD啲斑马鱼卵孵化率为18%相 比弱毒株

5、 M7组80%无害李斯特菌组88唏口对照组90%勺孵化率有显著下降。脑室注射单增李斯特菌能够引起斑马鱼胚胎逐渐死亡，并且能够观察到巨噬 细 胞迁移至脑内吞噬细菌，细菌能够在巨噬细胞中增殖。静脉注射100 CFU强毒 株 EGDef就能导致鱼在一周内全部死亡，细菌能够在全身躯干血管、主静脉及眼周血 管中分布并大量增殖，引起严重的感染。而弱毒株及无害李斯特菌则在感染后一定时间内被鱼体清除。以上三种注射 感 染途径中，李斯特菌属不同菌株的毒力与在小鼠模型中毒力相似：EGDe>M7>无害李斯特菌用高达1010CFU/mL勺EGDeft泡感染斑马鱼虽不能引起死亡，但冰冻切片显

6、示48 hpi (hours post infection)时细菌大量存在于鱼肠腔中未能突破肠道屏 障，且 在72 hpi被全部清除。强毒株感染组先天免疫基因cypla、irgIL、illb和mmmp的 转录水平显著高于弱毒株感染组、无害李斯特菌感染组和未感染组。这些基因表达在48hpi达到顶峰，在72hpi回落至正常水平，提示可能是这些 基因参与了细菌清除。3致病性与非致病性李斯特菌浸泡感染斑马鱼幼鱼勺比较 转 录组学应用Affymetrix基因芯片对斑马鱼14900个基因转录本进行杂交检测，发现 单增李斯特菌感染勺斑马鱼相对于空白对照组有239个基因表达上调(fold20),56 个基因表

7、达下调(fold < 0.5)o无害李斯特菌感染勺斑马鱼相对于空白对照组仅有25个基因上调，4个下调而 单增李斯特菌感染勺斑马鱼相对于无害李斯特菌感染勺鱼有102个基因上调。其中Mmp-9±调倍数最多，达20倍以上。荧光定量检测大部分基因表达趋势与 基因芯片结果一致。对单增李斯特菌感染组相对空白对照组上调勺239个基因和相对于无害李斯特 菌感染组上调的102个基因分别进行Gene Ontology (GO)分析，发现这些上 调的基 因大多富集于GO 0005576和GO 0050896,分别与细胞外基质稳态平衡 和抵御应激 相关。将这些基因进行GeneCluster分析，发现在

8、紧密连接、信号转导、干扰素、热 休克蛋白、纤连蛋白、补体和肌动蛋白等分类下的基因均有不同 程度的上调。这些结果提示斑马鱼可能通过改变细胞外基质的稳态来抵御单增李斯特菌感染，这一过程中Mmp9可能发挥了重要作用。4.Mmp-9在斑马鱼抗感染过程中的作 用机制Mmp9属于基质金属蛋白酶家族，是一种锌离子依赖的胶原蛋白酶，作用底 物广泛，能在各种细胞中表达并参与组织修复、细胞运动、炎症发生等多项生理及病 理过程，近来也有报道Mmp9在抗感染过程中也发挥一定作用。早期的研究均认为Mmp9水解细胞外基质，有助于巨噬细胞、中性粒细胞等炎 性细胞在细胞外基质中迁移。最近有研究发现,Mmp-9可能参与细胞内信

9、号转导，激 活细胞运动相关的通路，从而引起细胞迁移运动。我们利用特异Morpholino注射单细胞阶段的鱼卵，抑制Mmp9表达，并对Mmp- 9抑制后的鱼进行脑室注射、静脉注射及浸泡感染。结果显示，静脉注射感染Mmp9抑制的鱼在24 hpi细菌载量显著高于正常鱼，在感染后2-3天内全部死 亡， 比正常鱼感染后死亡快。脑室注射感染后，Mmp9抑制的鱼中迁移至脑内的巨噬细胞数显著低于正常 鱼。浸泡感染虽仍不引起斑马鱼死亡，但Mmp9抑制的鱼出现消化道出血现象。本研究还利用RNA干扰技术，结合小分子化学药物作用，在小鼠巨噬细胞 RAW264. 细胞模型上，对Mmp9可能诱导的通路分子进行了探索。细菌

10、感染及 LPS刺激能够引起Mmp9表达提高，同时也导致RAW264.7在Tran swell上的迁移 能力增强。沉默Mmp9或Mmp9在细胞内可能的受体分子CD44均能导致细胞体外迁移 能力减弱，但Mmp9的沉默不影响细胞吞噬细菌的能力和形成伪足的能力,也不 影响细菌ActA作用引起的actin tail形成。抑制细胞RhoA通路上游分子FAK,中游分 子ROC均能在一定程度上减少由Mmp9士调引起的细胞迁移，用细胞松弛 素抑制肌 动蛋白聚集后，由Mmp9上调增多的细胞迁移活动完全被抑制。以上结果提示Mmp9在抗感染过程中能够介导巨噬细胞迁移至感染部位，从 而达到清除细菌的作用。Mmp9通过非水解酶作用，与CD44或其他细胞表面受体 结 合，诱导细胞运动相关RhoA通路，从而引发细胞迁移运动综上所述，本研究建立了简易的无菌斑马鱼胚胎培养体系，用此无菌系统培 育的斑马鱼胚胎先天免疫尚未激活，可用于其先天免疫系统