【医疗药品管理】磺胺类药物

1、磺胺类药物(Sulfonamides, SAs)是指具有对氨基苯磺酰胺结构的一类药物的总称,其通过干扰细菌的酶系统对氨基 苯甲酸的利用而发挥抑菌作用,后者是微生物生长必需物质叶 酸的组成局部.自20世纪30年代研究证实了 SAs抑菌的根本结 构后,相继合成了各种SAs,由于其抗菌谱广,价格低廉,目前 仍是兽医临床和畜牧养殖业中最常用的药物添加剂之一,但也带来了食品平安和环境污染等系列问题.研究说明与其它常用抗生素相比,SAs可能更易诱导菌株应 选择压力而产生耐药性.此外,SAs药物还会导致过敏反响、 尿和 造血功能紊乱等副作用.如磺胺二甲基嚅咤等可能诱发啮齿类动 物如鼠的甲状腺增生,对其激素样

2、效应和潜在致癌性质正在进 一步研究中.由于SAs在体内作用和代谢的时间较长,通过任何 途径摄入的磺胺都有可能在人体中蓄积,蓄积浓度超过一定值 时将对人体机能造成损害.因此,联合国食品法典委员会(CAC) 和许多国家规定,食品和饲料中SAs总量以及磺胺二甲基嚅咤等 单个SAs的量均不得超过011mg/kg .而且伴随兽药残留毒理学 的开展和风险分析手段的进步,各国对SAs在动物源性食品中的 残留限量做出了越来越严格的规定,如日本对食用动物肌肉中 磺胺二甲基喀咤的最大残留限量规定为方法检测低限,即0101mg/kg.关于SAs残留的检测从早期的分光光度法、荧光法、薄层色 谱法到近些年的液相色谱法、

3、气相色谱 -质谱法、液相色谱-质谱法、毛细管电泳法和超临界流体色谱法,几乎所有的分析理论 和技术在SAs残留分析中都得到了研究和应用,其中采用最多的 筛选方法是反相高效液相色谱法(HPLC),后来开展的酶联免疫 吸附测试方法(EL ISA)作为筛选方法也得到了广泛的应用.但 是这些检测方法都存在处理方法繁琐,操作时间长及只能检测 单个磺胺类药物的问题.基于细菌受体分析的Charm n放射免疫法的样品前处理提取方法简便,具有灵敏度高,特异性强的特 点,并且可以检测磺胺类残留总量,已经为欧盟国家和美国FDA 认可并且应用于初筛分析,目前国内尚未见有关鳗鱼的检测报 道.本研究建立了鳗鱼中磺胺类残留C

4、harm n放射免疫检测方法.1材料和方法1 . 1 设备和材料Charm 6600 /7600 分析仪:美国Charm 公司生产；IEC离心; 均质器；涡旋混合器；恒温孵育器(65 ±1C; 80 ±2 C);闪 烁液加液器;50mL离心管；硼硅玻璃试管及试管塞；pH试条； 药片压杆.1 . 2 样品和试剂1.2.1 检测基质鳗鱼1.2.2 检测试剂磺胺类Charm II检测试剂盒；闪烁液(Optifluor);阴性对照液；多抗标准品.以上试剂均由美国Charm公司提供.1.2.3 磺胺类药物标准品磺胺甲基喀咤SM1、磺胺二甲基喀咤SM2、磺胺间甲氧喀咤SMM、磺胺间二甲

5、氧喘 咤SDM、磺胺喽嗯咻SQX、磺胺甲嚷二嚏STZ、磺胺 叱咤SPD 、磺胺异嗯嚏SIZ、磺胺甲基异嗯嚏SMZ、 磺胺喀咤SD、磺胺嚷嚏ST、磺胺甲氧哒嗪SMP、磺 胺氯哒嗪SCP o以上标准品由Sigma公司提供.1.2.4 恩诺沙星、新霉素、庆大霉素、链霉素、螺旋霉素、 林可霉素、四环霉素、氯霉素、红霉素、青霉素 G标准品. 以上标准品由Sigma公司提供.1 . 3 方法1.1. 1测试原理测定的根底是竞争性受体免疫反响. 用3H 标记的磺胺二 甲喀咤示踪剂与样品中磺胺类药物的竞争结合试剂 微生物细 胞上的特异性受体上的磺胺结合位点,当样品中残留磺胺类药 物时,残留物与受体上的结合位点

6、结合,从而阻止了 3H 标记 的磺胺类药物与结合剂位点的结合.样品中的磺胺类药物含量越高竞争的结合位点越多,3H 标记磺胺二甲喀咤的那么越少,用 Charm II分析仪测定样品中的3H 含量的cpm 每分钟脉冲 数值,cpm值越低那么样品中的磺胺类药物残留量越高.1.3. 2提取步骤1取50mL离心管,参加10g均质好的鳗鱼糜样.(2)力口入30mLMSU提取缓冲液,强力振荡离心管10min后进入步骤(3).(3)将离心管置80 ± 2 C孵育器内孵育45min.(4)再将离心管置冰水内10min.(5)于 1750g ( IEC 离心机 313 X 1000 rpm) 离心 10m

7、in .(6)吸出上层液用于测试.注意不要将漂浮的脂肪颗粒混入上清 液内.1.4. 3测定步骤 用药片压杆的平端,将白色药片(受体试剂片)压入一洁净的 玻璃试管内.(2)加300山 蒸储水到试管内用涡旋混合器振荡 10 s至药片破 碎.(3)用加样器加4mL样品到试管内.(每一样品用一新加液吸 嘴).(4)用笔的平端,压入粉红色药片(3H 标记的磺胺二甲嚅咤).用振荡器振荡大约15 s o置65 ±1 C孵育器内,孵育3min.(6) 1750g ( IEC 离心机 313 X 1000 rpm) 离心 3min .(7)离心停止后立即取出试管,倒掉上层液,用棉签去除试管内 的脂肪环

8、并吸干管壁内的残渍,不要接触沉淀物.(8)加300山蒸储水到试管内,振荡使沉淀物完全破碎.(9)力口3mL闪烁液到试管内涡旋混匀至试管内没有不均一的云絮状物.(10)试管放入Charm II /7600分析仪内.(11)按Charm II /7600 分析仪操作程序选项(检测限制点需预先设定并输入仪器),读3H 项的cpm值.1.3.4 阳性结果确实定样品的cpm 限制点时,需要重新检测样品及同时测定一 个阴性质控和一个阳性质控,以确定试剂和设备是否工作正常. 通常情况下：(1)测试的阴性质控应该是阴性质控平均值土20% (每一试剂盒都会给出阴性质控平均值,平均值一般为运行三份阴性质控液 的c

9、pm值的平均数).(2)测试的阳性质控应该小于限制点.如果重测样品的cpm 控制点且(1) ( 2)两条件符合,那么判定样品阳性.1.3.5 限制点的建立在6份无磺胺类残留的鳗鱼样品中参加测试所要求的抗 生素浓度(参照试剂盒说明书).根据分析程序运行(见11313方 法).得出6个cpm值,计算其平均值.平均值的130%即为此类 样品的限制点.2结果与分析211抗原抗体竞争性反响标准曲线将浓度为1000闻/L的多抗标准品添参加阴性鳗鱼样品中, 添加浓度分别为 10、20、30、40、50、80、100、150、200闺/kg,按11313测定步骤检测其cpm值,结果如图1和图2添加浓度fWU加

10、即愣心图1娱鱼中淖加技二甲噫虎的竞争性RI启曲段图2 倏鱼中添加事艘二甲嗝咤趋於线任何受体分析的灵敏度都存在限制,Charm n放射免疫分析 中细菌受体和3H 的磺胺二甲嚅咤抗原的量是固定的.从图 1 可以看出,当样品中竞争性磺胺二甲嚅咤浓度到达50闻/kg时,浓度继续增加那么其竞争效率下降,表现为斜率绝对值变小,cpm 值读数变化很小.抗原质量浓度到达200闻/kg时,分析体系已接近饱和.在磺胺二甲嚅咤添加浓度为1050由/kg的范围内,以质量浓度对数为横坐标,以相应质量浓度的cpm数值的相对 值即其cpm读数与阴性样品cpm读数的比值,B /Bo 为纵坐 标,得到半对数曲线,如图2.由于是

11、以细菌细胞壁受体作为抗 原的结合位点,其亲和性不均一,而且抗原抗体反响的复杂性使 得不能得到相关系数很高的线形拟合 ,但是从图2可以看出在添 加浓度为1050闻/kg的范围内,分析体系是比拟灵敏的.根据 实际情况确定检测限时,考虑到分析相对标准偏差,一般要求空 白加标样品与空白样品的cpm相对值小于016,即鳗鱼中磺胺 二甲喀咤检测浓度须大于11129闻/kg o 2. 2 特异性验证实验本实验室选取阴性鳗鱼样品,分别参加13种磺胺类药物标 准品分别为磺胺甲基喀咤(SM1)、磺胺二甲基喀咤(SM2)、 磺胺间甲氧喀咤(SMM)、磺胺间二甲氧喀咤(SDM)、磺胺喽 嗯咻(SQX)、磺胺甲嚷二嚏(

12、STZ)、磺胺叱咤(SPD )、磺胺 异嗯嚏(SIZ)、磺胺甲基异嗯嚏(SMZ)、磺胺喀咤(SD)、磺 胺嚷嚏(ST)、磺胺甲氧哒嗪(SMP)、磺胺氯哒嗪(SCP),添 加水平为50闻/kg,测定加标后cpm值,与限制点cpm值1357 相比拟,结果添加13种磺胺类标准品的样品测定结果阳性率为 100% o另外添加恩诺沙星、新霉素、庆大霉素、链霉素、螺旋 霉素、林可霉素、四环素、氯霉素、红霉素、青霉素 G的混合标 准品,添加水平为1000 pg/kg,样品测定结果均为阴性.上述实 验验证了 Charm II放射免疫分析法测定鳗鱼中磺胺类残留的特 异性能满足检测要求.2. 3 最大残留限量MRL

13、验证现在日本等一些国家把磺胺类最大残留限量从100闻/kg降为50闻/kg,我们对放射免疫法在此水平的检测灵敏度做了 加标验证.首先按11315限制点的建立方法确定鳗鱼中磺胺类检 测限为50闻/kg的限制点cpm值是1357.选取阴性样品,添加 13种磺胺类药物标准品,添加水平分别为40闻/kg、50闻/kg 和80闻/kg, 测定出的cpm值与限制点cpm值1357进行比拟. 如样品的cpm值大于1357,那么结果为阴性；如样品的cpm值小 于1357,那么结果为阳性.实验结果如表 1 o加标水平闻/kg阴性样品加标试验SDSM1SM2SMMSDMSQXSTZSPDSMZSTSMPSCPSIZ混标40+50+80+2.4 实测结果分析我们应用本方法对600余份鳗鱼样品进行了磺胺类的初筛 分析,筛选水平为50 pg/kg,对其中筛选阳性的4份鳗鱼进行 HPLC /UV的分析,均未检出磺胺类残留,可见初筛有假阳性可能.原因可能是鳗鱼生长的环境复杂如：水源、土池的土壤、饲料、用来杀菌的中药等干扰物质造成的影响.另取十份初筛阴性的样品,经HPLC /UV 确认均为阴性,假阴性率为0%.3 结论应用Charm II放射免疫分析方法测定鳗鱼样品的磺胺类药 物残留,该检测方法可靠,灵敏度高,特异性强,快速简便,达 到了日本、欧美等国磺胺类最大残留限量的检测要求,能够进行大批量