葛云侠《植物生理学》实验讲义

1、植物的光合速率测定-改良半叶法目的 学习改良半叶法测定光合速率原理植物叶片的主脉两侧对称部分叶面积基本相等，其形态和生理功能也基本一致。用物理或化学方法处理叶柄或茎的韧皮部，保留木质部，以阻断叶片光合产物的外运，同时保证正常水分供应。然后，将对称叶片的一侧取下置于暗中，另一侧留在植株上保持光照，继续光合作用。一定时间后，测定光下和暗中叶片的干重差，即为光合作用的积累的干物质量。通过公式计算出光合速率。乘以系数后还可计算出C02的同化量。W2-W1A×t光合速率(mgDW·m-2 s-1)= 材料、仪器、药品1材料：任选户外一种植物。2仪器及用品：(1) 剪刀；(2) 4块湿

2、纱布；（3）带盖磁盘；(4) 30个小纸牌，去户外之前用铅笔编号（115；115）；(5) 镊子；(6) 打孔器；（7）铅笔；（8）记号笔；(9) 12个称量瓶；(10) 烘箱；(11) 分析天平；（12）干燥器；（13）毛笔。 3药品：5三氯乙酸。 方法1取样：在户外选择较绿的植物叶片10片，要注意叶龄、叶色、着生节位、叶脉两侧和受光条件的一致性。绿叶用纸牌编号（例如绿叶为1、2、3、4、5-10）。增加叶片的数目可提高测定的精确度。2处理叶柄：为阻止叶片光合作用产物的外运，可选用以下方法破坏韧皮部。抑制法：用毛笔蘸取5三氯乙酸涂抹叶柄一周。注意勿使抑制液流到植株上。3剪取样品：叶柄处理完毕

3、后即可剪取样品，并开始记录时间，进行光合作用的测定。首先按编号次序（绿叶）剪下叶片对称的一半(主脉留下)，并按顺序夹在湿润的纱布中，放入磁盘中，带回室内存于暗处。1-1.5h后，再按原来的顺序依次剪下叶片的另一半。按顺序夹在湿润的纱布中。注意两次剪叶速度应尽量保持一致，使各叶片经历相同的光照时间。4称干重：取4个称量瓶分别标上绿叶光照1、2，绿叶黑暗1、2，将各同号叶片照光与暗中的两半叶叠在一起，用打孔器打取叶圆片，分别放入相应编号的称量瓶中（即光下和暗中的叶圆片分开）。每5 个叶片打下的叶圆片放入一个称量瓶中，做为一个重复。记录每个称量瓶中的小圆片数量。打孔器直径根据叶片面积大小进行选择，尽

4、可能多的打取叶圆片。注意不要忘记用卡尺量打孔器的直径。将称量瓶中叠在一起的叶圆片分散，开盖置于105烘箱中烘10min以快速杀死细胞，然后将温度降到7080，烘干至恒重(40min左右)。取后取出加盖于干燥器中冷却至室温，用分析天平称重。5结果计算： W2-W1A×t光合速率(mgDW·m-2 s-1)= 式中 W2：照光半叶的叶圆片干重(mg)；W1：暗中半叶的叶圆片干重(mg)；A：叶圆片面积(m2)；t：照光时间(S)。 若将干物质重乘以系数1.5，便可得CO2的同化量，以mgC02·m -2S-1表示。植物叶绿素含量测定-丙酮提取法目的、意义叶绿素含量是指

5、导作物栽培生产和选育作物品种的重要指标，学习用分光光度计并结合消光系数法来测定物质含量。原理叶绿素溶于有机溶剂，如丙酮、乙醇等研磨提取或浸泡提取。叶绿色素在特定提取溶液中对特定波长的光有最大吸收，用分光光度计测定在该波长下叶绿素溶液的吸光度(也称为光密度)，再根据叶绿素在该波长下的吸收系数即可计算叶绿素含量。利用分光光计测定叶绿素含量的依据是Lambert-Beer定律，即当一束单色光通过溶液时，溶液的吸光度与溶液的浓度和液层厚度的乘积成正比。其数学表达式为：A=Kbc式中： A为吸光度；K为吸光系数；b为溶液的厚度；c为溶液浓度。叶绿素a、b的丙酮溶液在可见光范围内的最大吸收峰分别位于663

6、、645nm处。叶绿素a和b在663nm处的吸光系数（当溶液厚度为1cm，叶绿素浓度为g·L-1时的吸光度）分别为82.04和9.27；在652nm处，叶绿素a和b的吸光系数相同，因此提取液中叶绿素的总浓度（a+b）也可通过测定溶液在波长652nm处的吸光度（A652）求得，其计算公式为： A652×100034.5Ca十b （1） 式中：34.5为叶绿素a和b在波长652nm处的吸光系数。 所测定材料的单位面积或单位重量的叶绿素含量可按下式进行计算：C×VA×1000 叶绿素含量（mg·g-1或mg·dm-2）= （2） 式中：C为

7、叶绿素浓度（mg·L-1）或mg·dm-2）；V为提取液总体积（ml）；A为取样鲜重（g）或取样面积（dm-2）。材料、仪器、药品1材料：植物绿色叶片。在本实验中利用光合速率测定实验中取回室内的绿色半叶为试材。2仪器：(1) 分光光度计；（2）天平；(3) 研钵；(4) 滤纸；(5) 漏斗；(6) 5ml移液管；(7) 打孔器；（8）滴管；（9）剪刀；（10）25ml容量瓶；（11）毛刷；（12）擦镜纸。方法1取样：称0.5g叶片剪碎后放入研钵加入80%丙酮2.5ml，少许CaCO3，石英砂研磨成匀浆再加入3ml 80%丙酮继续研磨至组织变白在暗处静止35min后用一层干滤

8、纸过滤到25ml容量瓶80%丙酮洗研钵，清洗液也要过滤到容量瓶中，并用80%丙酮沿滤纸的周围洗脱色素，待滤纸和残渣全部变白后用80%丙酮定容至刻度。3读取吸光度：。第一个位置放盛有80%丙酮的比色皿，做为空白对照。将仪器波长调至652nm处，以80%丙酮做为空白对照调透光率100%，测定溶液在上述波长下的吸光度。4结果计算：将652nm处测得的吸光度代入公式（1）中计算叶绿素a、b浓度和总浓度。再将叶绿素a、b浓度和总浓度代入公式（2）中求出所测材料单位重量或单位面积的叶绿素a、b含量和总含量。植物组织水势测定-小液流法目的、意义 学习小液流法测定植物组织水势在栽培生产上水势也是了解植物体内水

9、分状态，制订灌溉计划的重要指标。原理 水势的测定有多种方法，可分为气态平衡法和液态平衡法。前者要求精密的仪器设备，灵敏度高，如热电偶温湿度计法；后者要求设备简单，操作方便，但灵敏度低，如小液流法和折射仪法。小液流法亦称比重法或着色法，是水势测定的最经典方法之一。 在恒温恒压下，如果植物组织的水势低于外液的渗透势，则植物组织吸水而使外液浓度变大；反之，植物组织失水而使外液浓度变小；若二者相等，则外液浓度不变，此时外界溶液的渗透势等于植物组织的水势。同一种溶液浓度不同，比重亦不同。当两个不同浓度的溶液相遇时，稀的溶液由于比重小而上浮，浓的溶液比重大而下沉。当把浸过植物组织的溶液滴回到原浓度的溶液中

10、时，如果液滴下降，说明浸泡液的渗透势高于植物组织的水势；若液滴上升，说明浸泡液的渗透势低于植物组织的水势；如果液滴不动，则表示植物组织与浸泡液的水分交换处于动态干衡中，浸泡液的渗透势等于植物组织的水势。浸泡液的渗透势依据范特荷夫公式计算： 一iCRT浸泡液的液滴不动时，植物组织的水势（MPa）w一iCRT材料、仪器、药品1材料：韭菜叶片。2仪器：(1) 5ml试管6支；(2) 10ml刻度试管6支；(3) 细滴管810支；（4）移液管8支；(5) 试管架1个；(6) 打孔器(0.5 cm2左右)1个或刀片1个；(7) 镊子、解剖针、滤纸。3药品：（1） 甲烯蓝粉末；(2) 蔗糖溶液，浓度为lm

11、ol·L-1。方法1准备器具：将试验所需要试管和滴管洗净烘干。2配制不同浓度的蔗糖溶液：测定植物组织水势时所用的溶液，一般最常用的是蔗糖溶液。取洁净干燥的10ml刻度试管6支编号（甲组），将1mol的蔗糖溶液稀释成0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6mol·L-1的6种浓度。按下表配制不同浓度的蔗糖溶液。配制好的溶液要充分混匀。蔗糖系列浓度溶液配制试管号1234561mol蔗糖加入量ml123456加蒸馏水量ml987654蔗糖浓度mol/L0.10.20.30.40.50.63准备浸泡液：取洁净干燥的5ml试管6支编号（乙组），从甲组中依次取出0.10.6 mo

12、l的蔗糖溶液5ml，分别加入乙组的各个试管中，盖上盖防止蒸发，放到试管架上，做为浸泡液。4向浸泡液中加待测样品：取10个待测韭菜叶片，用毛刷清洁叶表面，将基部和项部切掉。所有叶片放在一起，用刀片切成0.3cm左右的切段，分别放入浸泡试管（甲组）中，每管10段。每个试管中的叶切段数量要一致，并且每个试管中来自每个叶片的切段数量相同，以保证各个试管中的样品水势尽可能的一致，将叶片切段全部浸没在溶液中，盖上盖子。5溶液平衡：叶切段浸泡30min，期间轻轻摇动试管数次，以加速水分平衡。确定着色时甲烯蓝用量：用解剖针分别放入少许甲烯蓝粉末在装有5ml水的试管中，使甲烯蓝充分溶解，将浸泡液充分混匀。用白色

13、做背景，直至观察到淡蓝色的，确定这时甲基蓝用量。6平衡情况检测：叶切段浸泡30min后，用解剖针分别放已定的甲烯蓝粉末用量在甲组每个试管中，使溶液着色，但甲烯蓝粉末不宜加过多。将浸泡液充分混匀。用细滴管吸取有色溶液少许，插入相应浓度的乙组试管中，使滴管尖端位于溶液中部，然后轻轻挤出1小滴有色溶液，小心抽出滴管(注意勿搅动溶液)，观察有色小液滴的升降情况并做好记录。有色浸泡液小滴在原浓度溶液中的运动情况记载液滴表现蔗糖浓度 mol/L样品水势MPa0.10.20.30.40.50.6液滴表现为上升、静止不动或下降，用“”“”“”表示。7结果计算：将确定的蔗糖溶液浓度带入公式 一iCRT中计算植物

14、组织的水势。式中：为渗透势，单位为MPa；i为范特荷夫系数或等渗系数，对于不解离的蔗糖溶液为1.0；C为与组织水势相等的蔗糖溶液的摩尔浓度，或液滴上浮、下沉的两个相邻蔗糖浓度的平均值，单位为mol·L-1；R是理想气体常数，0.0083 MPa·L ·mol -1·-1；T是绝对温度,即273+t（t为实验时的温度）。植物根系活力测定-甲烯蓝法目的 学习用分光光度计并绘制标准曲线来测定物质含量原理根系活力测定方法：TTC法、-萘胺氧化法、甲烯蓝法。TTC法原理：呼吸作用中的脱氢酶活性与根系活力成正相关。TTC (无色)+2H+2eTTCH ( 红色)-萘

15、胺氧化法原理：-萘胺的氧化能力与呼吸作用密切相关。-萘胺(无色)+O-羟基-1-萘胺( 红色)甲烯蓝法原理：植物根系对溶质吸收最初具有吸附的特点被吸附物质是以单分子层形式均匀地覆盖在根系表面根据根系对某种物质（常用甲烯蓝）吸附量来测定根的吸收面积被吸附的数量可根据供试溶液浓度的变化用比色法测出已知lmg甲烯蓝成单分层时可覆盖1.1m2的面积，据此可求出根系的总吸收面积。 总吸收面积=（ C1C1）×V1+(C2C2)×V2×1.1当根系在甲烯蓝溶液中已达吸附饱和而仍留在溶液中时，根系的活跃部分能把原来吸附在表面的物质吸收到细胞中去，因而可继续吸附甲烯蓝。从后一个吸

16、收量求出活跃吸收面积，可作为根系活力的指标。活跃吸收面积=(C3C3)×V3×1.1活跃吸收面积(%)=活跃吸收面积（m2）×100 / 根的总吸收面积（m2）比面积=根的总吸收面积（cm2）/根的体积（cm3） 材料、仪器、药品 1材料：小麦幼苗根系，在取样时应十分小心，以免将根系折断或损伤。 2仪器：(1) 分光光度计；(2) 小烧杯6个；(3) 吸水纸；(4) 10或25ml量筒1个(依根系大小而定)；(5) 移液管lml和10ml各1支；(6) 10ml试管16支；（7）试管架1个。3药品：(1) 0.075mg/ml 甲烯蓝溶液（浸根，用后器皿要刷洗干净

17、）；（2）0.01mg/ml 甲烯蓝溶液（制标准曲线用）。方法 1绘制甲烯蓝溶液的标准曲线：取7支试管，编号，按下表配制标准溶液。甲烯蓝标准溶液配制试管号12345670.01g甲烯蓝加入量ml0123456加蒸馏水量ml10987654甲烯蓝溶液浓度mg/ml0.0.0010.0020.0030.0040.0050.006把各试管中的溶液混匀后，利用分光光度计测定在波长660nm下的吸光度，测定时以1号试管(蒸馏水)为空白对照调透光率100%。然后，以甲烯蓝系列浓度为横坐标，以吸光度为纵坐标绘制标准曲线。2测定体系体积：取待测小麦5株，将根系洗净控干后，浸在事先装有一定体积水的10ml或25

18、ml量筒里(或用体积计)，用排水法测定根系体积。3测定根系活力：（1）取3个小烧杯编号各加入0.075mg/ml甲烯蓝溶液5ml从每个烧杯中取出0.5ml溶液分别加入到3个10ml试管中稀释15倍，混匀在660nm下测定吸光度。在标准曲线上查出相应的浓度，算出0.075mg/ml甲烯蓝的精确含量。（2）从量筒中取出根系用滤纸把水吸干放入第一个盛有甲烯蓝溶液的小烧杯里，浸1.5min取出，将根系上多余的甲烯蓝液控回到原烧杯中去，再放入到第二个小烧杯中浸1.5min取出后，同样控净溶液，再放到第三个小烧杯中浸1.5min取出控净溶液。（3）浸过根系的3个小烧杯中分别取出甲烯蓝溶液lml分别放入三支

19、试管中，稀释15倍，摇匀在660nm波长下读取吸光度。在标准曲线上查出相应的浓度，最后算出每杯溶液中剩余甲烯蓝的毫克数。 4结果计算：测定数据填入表36，并按下列公式求出根的吸收面积。 总吸收面积=（ C1C1）×V+(C2C2)×V×1.1根的总吸收面积（cm2）根的体积（cm3） 活跃吸收面积=(C3C3)×V×1.1活跃吸收面积（m2）×100总吸收面积（m2） 活跃吸收面积(%)= 比面积= 分光光度计的操作注意事项 （1）在开机前，需先确认仪器样品室内是否有物品挡在光路上，光路上有阻挡物将造成仪器故障。 （2）连接仪器电源线

20、，确保仪器供电电源有良好的接地性能。接通电源，让仪器预热至少二十分钟，使仪器进入热稳定工作状态。 （3）用波长选择旋钮设置所需的波长 （4）在测定前要调零和调透光度T为100%。在每次更换波长时也都要调零和调100%。 （5）为了防止光电池疲劳，在不测定时应经常关闭光源的光路闸门。光电池不要连续照光太长时间（最好是间歇半小时后再继续使用）。 （6）比色皿放入比色架前应用细软而吸水的纸或擦镜纸擦干，擦干时应注意保护其透光面，勿使产生斑痕，否则会影响透光度。在拿比色皿时只能捏住两面毛玻璃。 （7）测定时比色皿要用被测溶液冲洗2-3次，注意清洗时要使清洗液接触比色皿内壁的所有部分，避免被测溶液浓度的

21、改变。被测液中不能有气泡、悬浮物，否则影响样品测试的精度。倒入比色皿中，液面高度约为比色皿高度的4/5。 （8）仪器在使用时，应常关闭光路闸门来检查零点。 （9）比色皿放入比色皿架内时应注意它们的位置，尽量使它们前后一致，否则容易造成分析误差。 （10）每次使用后应检查样品室是否积存有溢出溶液，经常擦拭样品室，以防废液对部件或光路系统的腐蚀。 （11）仪器使用完毕后应关闭电源，盖好防尘罩。分光光度计测定物质含量的原理利用分光光计测定物质含量的依据是Lambert-Beer定律，在稀溶液中，即当一束单色光通过溶液时，溶液的吸光度与溶液的浓度和液层厚度的乘积成正比。其数学表达式为：A=Kbc式中：

22、 A为吸光度；K为吸光系数；b为溶液的厚度；c为溶液浓度。实际操作时往往用一系列不同浓度的标准溶液，在比色计上测得相应的吸光度A,然后绘制吸光度-浓度曲线，测定未知样品时，只要在同样条件下测得吸光度A，便可在标准曲线上查得样品的浓度。植物抗逆性鉴定-外渗电导法目的 学习外渗电导法测定植物抗性原理细胞膜的选择透性是其维持生理功能的最重要的条件之一。各种逆境伤害都会造成质膜选择透性的改变或丧失，因而增大细胞膜通透性，细胞内的物质(尤其是电解质)大量外渗，从而引起组织浸泡液的电导率发生变化。 材料、仪器、药品1材料：韭菜六株整株水洗无离子水洗滤纸吸水2仪器：(1) 20ml具塞试管；(2) l0ml

23、移液管；(3) 洗瓶；(4) 温度计；(5) 玻棒、镊子；(6) 打孔器；(7) 剪刀及定距离刀片；(8) 带盖白瓷盘2个；(9) 滤纸、纱布、铅笔；(10) 电导率仪；(11) 天平(1万或1千)；(12) 温箱；(13) 水浴锅；(14) 恒温水浴；(15) 真空泵；(16) 真空干燥器；(17) 负压表；(18) 振荡器。 ，3药品：(1) 洗液；(2) 去污粉；(3) 无离子水。方法1清洗用具：由于电导率仪对溶液中的电解质含量变化极为灵敏，所用玻璃器皿或其它用具如不洁净，就会严重影响实验结果，所以实验开始前必须首先清洁实验用具。玻璃用具和打孔器先用去污粉(或洗液)清洗，再分别用自来水、

24、无离子水冲洗数遍，然后放入(或倒置在)洗净且垫有洁净滤纸的瓷盘中，并用盖子或洁净纱布盖好。2材料逆境胁迫：韭菜(低温处理)： 三株韭菜-20 15min冷藏5min3外渗电导率测定：取6个20ml试管，编号。向每个试管中加20 ml无离子水。在测定前先将各个试管中的浸泡液上下搅拌或摇匀再测定电导率值。测定时要将电极头部完全浸入溶液中。记录电导率。电极在每次测定之后都要有无离子水洗净并用吸水纸吸干4取材处理：韭菜(低温处理)：低温处理及对照韭菜叶片分别切段，2cm长，10段分别浸在20ml无离子水，浸30min，期间要不断摇动测电导率加盖，煮沸5min冷却至室温后，测电导率。5结果计算：较常用的

25、是电解质渗出率，也称为相对电导率。浸泡液电导率值本底电导率值煮沸后电导率值本底电导率值 电解质渗出率（%）= ×100处理电导率值对照电导率值处理煮沸后电导率值对照电导率值伤害率（%）= ×100 电导率仪的操作DDSllA型电导翠仪的使用要点： (1) 将校正、测量开关拨在“校正”位置。 (2) 开电源开关，指针稳定后，调节校正调节器使指针到满度。 (3) 当使用(1)一(8)量程来测量电导率低于300µS·cm-1的液体时，选用“低周”，这时将高低周开关拨向“低周”即可。当使用(9)一(12)量程测定300µS·cm-1一105&

26、#181;S·cm-1范围的液体时，则将高低周开关拨向“高周”。表92 电导率仪的测定范围及其性能(4) 将量程选择开关拨到所需测量范围，如预先不知被测溶液电导率的大小，应先拨在高测量档，然后逐档下降，以防表针打弯。 (5) 将电极固定在电极杆上，调节电极常数调节器，使其位置与该电极常数一致。将电极插头插入电极插口内，旋紧插口上的固定螺丝，再将电极浸入待测溶液中。 (6) 调节校正调节器指示满度，为提高测量精度，当使用911档时，校正必须在电极浸入待测液中的情况下进行。 (7) 将校正测量开关拨向测量，这时指示数乘以量程开关的倍率即为被测液的实际电导率。用1、3、5、7、9、11各档

27、时，读表头刻度上面的值(010)，用2、4、6、8、10各档时，读表头刻度下面的值(030)。 (8)当用001或0一n3PS·cm”这两档测量高纯度水时，应在电极未浸入水之前，调节电容补偿调节器，使指针指示最小，然后开始测量。 (9)如果要了解测量过程中外渗电导率的变化情况，可将10mv输出接至自动记录仪上即可。 (10)测量高电导的样品溶液时，该仪器的灵敏度和精度会降低，因此，最好先将溶液稀释后再进行测定。 (11)为了防止漏电，在进行测定工作时，仪器下面要垫绝缘布或塑料板，附近也不能有电源变压器、电动机等强磁场。仪器外壳必须有良好的接地线。植物组织丙二醛含量测定目的、意义 学习用分光光度计并结合消光系数法来测定物质含量丙二醛(MDA)是细胞膜脂过氧化作用的产物之一，它的产生还能加剧膜的损伤。因此，丙二醛产生数量的多少能够代表膜脂过氧化的程度。原理H+ MDA+TBA 3，5，5一三甲基恶唑2，4一二酮 (粉红色) 532nm波长下有吸收峰 由于硫代巴比妥酸与其它物质反应，并在该波长处有吸