刘欣怡 20110014057 微生物论文

1、 压力灭活细菌内生孢子 Dirk Margosch, Michael G. Ganzle, Matthias A. Ehrmann,*and Rudi F. Vogel Lehrstuhl Technische Mikrobiologie, Technische Universitat Munchen, D-85350 Freising, GermanyReceived 16 January 2004/Accepted 3 August 2004 静压灭活细菌内生孢子需要综合运用热和压强。已经确定了枯草芽孢杆菌、解淀粉芽孢杆菌和地衣芽孢杆菌的14株食物菌系菌株和5株实验室菌株对改变捣碎的胡萝卜

2、温度和压强（200至800 MPa和60到80°C)处理操作的抗性。从中可以看出芽孢间抗压能力是不同的，而且它们在800MPa及70°C条件下处理4分钟的减少量从多于6对数单位到0不等。芽孢形成时的条件深入影响它们的抗压性。芽孢抗压性不同和它们缺失吡啶二酸（DPA）有关。芽孢的亚致死性损伤可通过测定独立芽孢的检测时间来评估。温度和压力操作处理芽孢最终产生缺失吡啶二酸、相位明亮的芽孢。这些芽孢对中等温度敏感，根据一个芽孢在生长培养基上生长到可见程度所用的时间判断，它们的检测时间大大增加。通过使用缺失吡啶二酸的突变菌株枯草芽孢杆菌CPI 76.26更进一步证明吡啶二酸在抗热和抗

3、压能力中所起的作用。综合来看，这些结果表明温度和压强联合操作下芽孢失活是通过一个不含发芽的二级机制实现的。当压强处于600至800MPa之间且温度比60°C稍高时，吡啶二酸通过物理化学过程而不是生理过程被显著释放，这些缺失吡啶二酸的芽孢在中等温度下就失活且无需再依赖压强变化。计划对食物中相关靶标生物，也就是能形成高抗压性芽孢的解淀粉芽孢杆菌，进行温度和压强操作处理， 合适温度下保存食物的过程是高静压处理食物。压强处于200到800MPa之间对于消灭食物（37,39）中营养细菌很有效。室温下进行压力操作能使细菌芽孢（13）发芽，但是它们在25°C、压强高于1000MPa（36

4、,37）条件下不失活。细菌芽孢失活需要压强和合适温度联合作用，而且通过加入乳链球菌素（33,41）、降低pH（41,43）以及振荡浓缩（10，14）这些操作能提高压力操作的效力。最近现有数据显示压强在500到800MPa而温度在60到80°C的处理操作能使杆菌和梭菌的芽孢失活。关于压强对细菌营养细胞作用的研究显示一种物种（4,12）的菌株间抗压能力明显不同。同样的，一种物种不同菌株的芽孢的耐热性也表现出很大的不同。大多数有关细菌芽孢抗压性的研究是通过有限的实验室菌株完成的。因为芽孢抗压性和耐热性无对应关系，所以食品加工中有很高抗压性的靶标菌株和物种有待鉴定。此外，芽孢形成时的环境以及

5、增压中芽孢悬浮在的基质会影响枯草芽孢杆菌（1，18）芽孢的抗压性。 从100到600MPa中合适的压强能引起枯草芽孢杆菌（43,44,45）芽孢发芽。因此，压力引起发芽的芽孢会在温和温度和压强条件下就失活。环境压强下，从芽孢释放吡啶-2,6-二羟酸（DPA）是由于激活（营养）受体造成的，而且它是芽孢萌发（27）早期的一步骤。Wuytack教授（45）将100MPa引起发芽的芽孢和600MPa引起发芽的芽孢进行比较。100MPa条件引起发芽的芽孢有如下变化：失去DPA，小的酸溶性蛋白质（SASPs）退化以及ATP生成速度加快。高压下发芽的芽孢中也能观察到有DPA被释放，但是，SASPs的退化和A

6、TP生成速度观察不到变化。550MPa操作使得芽孢发芽不依赖营养受体，它们打开能释放DPA的通道，进而导致芽孢发芽过程最后几步的发生。 本课题的目的是测定从食物中分离出的大量芽孢杆菌属的芽孢的抗压性。捣碎的胡萝卜用作食物模型系统。典型菌株压力导致的失活和发芽中释放DPA被认为是导致抗压性不同的一种可能原因。用枯草芽孢杆菌突变菌株进一步检测芽孢中DPA对抗压性的作用。可通过向芽孢形成基质中添加DPA来控制该菌株的芽孢中DPA的含量。 表1、所用菌株以及他们的来源 微生物 菌株名称以及来源地衣芽孢杆菌 TMW2.492，巴氏消毒的胡萝卜（该研究中）枯草芽孢杆菌 TMW2.485，巴氏消毒的胡萝卜（

7、该研究中）枯草芽孢杆菌 CIP76.26(2)枯草芽孢杆菌 YMW2.484，巴氏消毒的胡萝卜（该研究中）枯草芽孢杆菌 DSM347，枯草芽孢杆菌 DSM6405枯草芽孢杆菌 TMW2.469枯草芽孢杆菌 DSM618枯草芽孢杆菌 DSM 10T枯草芽孢杆菌 TMW2.476，黄素腺嘌呤二核苷酸110，粘丝面包(34)枯草芽孢杆菌 TMW2.483，黄素腺嘌呤二核苷酸109，粘丝面包(34) 芽孢杆菌物种 TMW2.480，黄素腺嘌呤二核苷酸94，粘丝面包(34)a解淀粉芽孢杆菌 TMW2.474，黄素腺嘌呤二核苷酸99，粘丝面包(34)b解淀粉芽孢杆菌 TMW2.475，黄素腺嘌呤二核苷酸W

8、e，粘丝面包(34)b解淀粉芽孢杆菌 TMW2.477，黄素腺嘌呤二核苷酸108，粘丝面包(34)b解淀粉芽孢杆菌 TMW2.478，黄素腺嘌呤二核苷酸77，粘丝面包(34)b解淀粉芽孢杆菌 TMW2.479，黄素腺嘌呤二核苷酸82，粘丝面包(34)b解淀粉芽孢杆菌 TMW2.481，黄素腺嘌呤二核苷酸97，粘丝面包(34)b解淀粉芽孢杆菌 TMW2.482，黄素腺嘌呤二核苷酸11/2，粘丝面包(34)ba 16 S rRNA基因的部分序列已被测定；1506对碱基中分别有1500对和1409对和枯草芽孢杆菌DSM 4424和嗜盐菌DSM 11031T相同。b 菌株按照于16 S rRNA的序列

9、重新分类为解淀粉芽孢杆菌并随意扩增多样的DNA序列。 材料与方法菌株，生长条件以及孢子悬浮液的准备。表1展示了该研究中所用的菌株以及他们的来原。30°C 条件下，菌株培养在有氧的ST1液体培养基（默克公司，达姆施塔特，德国）中。为了准备菌株芽孢悬浮液，需要在ST1琼脂上平铺0.1ml新鲜过夜培养物，此外除非另外说明否则还需添加添10mgMnSO4.H2O公升-1。菌株CPI 76.26（2）培养在ST1或者含有额外DPA（50g ml-1）来控制芽孢中DPA含量的ST1上。为了研究矿物质对抗压性的影响，在ST1琼脂中加入5mMCaSO4 · 2H2O，MnSO4 ·

10、; H2O，or ZnSO4 · 7 H2O。温育琼脂平板直到在相差显微镜下检测到90%至99%的细胞中含有相差鲜明的芽孢。通过使用10ml无菌蒸馏水冲洗平板表面来从平板上收集野生型菌株芽孢。收集后，再洗涤芽孢悬液四次，即5°C、3000g下离心分离15分钟、无菌蒸馏水中重悬浮，然后80°C条件下保存至使用。在第二次和第三次洗涤间，芽孢悬浮液要在80°C下巴氏消毒10分钟，目的是杀死所有营养体。七天生长后菌株CPI 76.26的芽孢准备完毕，而且省略加热步骤。显微镜的观察结果证实多于99%的细胞已经形成了芽孢。在ST1琼脂平板上进行细胞计数。适当稀释后平

11、铺在螺旋状板（IUL，柯尼希斯溫特，德国）上，将平板在30°C下培育30小时。压力操作。用作增压媒介、需要加热杀菌并捣碎的胡萝卜在当地超级市场就能获得。或者也可以使用调整到和捣碎的胡萝卜pH相同（pH5.15）的Tris-His缓冲液（THB；10mM三氨基甲烷盐氯化氢，20mM组氨酸氯化氢）。在增压媒介中接种芽孢至芽孢浓度为每毫升含有2.2 1079.6108个芽孢，然后将媒介转移到2ml艾本德反应管中，管子用硅质塞子密封以免接触外界空气，接着在冰中保存至进行操作。用内体积为15ml的麦博仪器在温度从60到80°C、压强从0.1到800MPa的变化中对样品加压。乙醇蓖麻油

12、（80:20，体积/体积）是压强传动液。升压和降压的速度是2MPas-1。所有数据需指出耐压时间不包含升压和降压花费的时间。压敏元件的温度依靠水浴来维持，同时样品的温度通过伸入样品容器中的压力容器里的热电偶进行检测。为了平衡样品温度，样品需要在升压操作前4分钟放入压力容器。升压时，因为绝热加热样品温度会升高大约20°C。温度80°C、压强600或800MPa的操作下，其温度曲线展示在图表2和3中。压强为400MPa的操作能获得有比较性且有有相似之处的温度曲线（数据未展示）。降压后，样品管保存在冰中直至进行平板计数以及测定DPA释放量的操作，然后保存在20°C条件下

13、直至进行检测滞后时间。对于每一个压强和温度的组合，检测8个不同恒压时间值中6个时间值的失活动力学。每一项实验中，未处理的样品作为对照用来确定芽孢初始数。图中展示了至少两个独立实验的数据，而且其标准差一般为0.66个对数单位或更少。 表2、600MPa及80°C操作处理捣碎的胡萝卜时的压强温度曲线进程时间 压强（MPa） 温度（°C） 0.0 0.1 79.9 2.5 208 93.9 4.5 439 98.9 5.3 604 101.7 6.0 597 99.8 7.0 592 94 8.1 589 89.3 9.1 588 86.3 11.1 588 83.3 13.0

14、587 82.1 16.0 588 80.1 测量释放的DPA。芽孢DPA的释放量通过测量压强操作处理过的上清液和未处理的芽孢悬液两者中的DPA浓度来确定。样品中DPA浓度的分析检测是用一个Polyspher OAKC层析柱（默克，达姆施塔特，德国）通过高效液相层析方法完成的。流速为每分钟0.4ml，流动相是含5%乙腈的5mM硫酸，层析柱的温度是70°C。用280nm紫外检测器（Gynkotek，格梅尔林，德国）进行探测。芽孢的DPA总含量通过检测121°C下热处理20分钟的芽孢悬液中DPA的量来确定，因为121°C下热处理20分钟能使芽孢（19）充分释放DPA。

15、压力处理下释放的DPA量和芽孢中总DPA量有关。图中展示了至少两个独立实验的数据，而且标准差一般低于5%。 检测滞后时间。测量营养细胞种群异质性的首推方法是测定滞后时间。将经过压力处理或没经过处理的含有已知细胞量的孢子悬液置于ST1液体培养基中稀释，最终得到浓度分别为每毫升含有5个、2.5个或1.25个孢子的溶液。对于这三种稀释液中每一种溶液，均将12200L培养物转移到微量滴定板上，并且为了检测生长规律，30°C下12小时内用Spectraflour微量滴定板读数器（帝肯，格罗迪，澳大利亚）每隔30分钟测定一次590nm时的吸收量。假设每当平均12个培养物中有2个或2个以上不产孢子

16、时，就给200L培养物芽接一个孢子。不断重复操作直至在已知样品中能观察到至少96个独立孢子。以小时为单位，培养物生长到0.02密度所用的时间即为要检测的时间。 表3、800MPa及80°C操作处理捣碎的胡萝卜时的压强温度曲线进程时间 压强（MPa） 温度（°C） 0.0 0.1 79.3 2.5 172 91.7 4.5 403 98.8 5.7 512 98.6 6.5 621 97.9 7.3 816 101 8.0 809 98.4 9.1 804 92.9 11.0 801 86.2 13.0 800 83.2 16.0 800 81.6图1、记录压力和热处理后捣碎

17、的胡萝卜中枯草芽孢杆菌TMW2.485（A）和地衣芽孢杆菌TMW2.492（B）的孢子数量（N）。用相对于未处理的样品中孢子数(N0)的比率来描述孢子数。图中展示了至少两个独立实验的数据，而且标准差一般小于0.66个对数单位。其显示的孢子数(log N/N0 -7)低于检测范围。 结果 温度和压力对枯草芽孢杆菌和地衣芽孢杆菌的孢子失活的影响。为了检验食物菌系内生孢子的失活，将从巴氏消毒胡萝卜中分离出的枯草芽孢杆菌TMW2.485菌株和地衣芽孢杆菌TMW2.492菌株的孢子置于捣碎的胡萝卜中，并对捣碎的胡萝卜进行200到800MPa的压力处理和60到80 °C的热处理。对于每一个参数组

18、合，失活规律由8个不同恒压时间确定。图1展示了16分钟恒压操作处理后的孢子数量。地衣芽孢杆菌TMW2.492的芽孢表现出的抗压性比枯草芽孢杆菌TMW2.485的芽孢的抗压性高。实验中观察到，在70°C、200或400MPa下两种菌株中失活量少于2个对数单位，并且随着压强和温度的提高芽孢失活量会增加。在80 °C温度下600或800MPa恒压处理16分钟，两种菌株的芽孢都几乎全部失活。 枯草芽孢杆菌菌株和解淀粉酶芽孢杆菌菌株的抗压性的变化。为了检测两物种的18个菌株的抗压性的变化，其中13株是食物菌系菌株而另5株菌株从物种枯草芽孢杆菌和解淀粉芽孢杆菌的菌株集中分离出的，将它们

19、置于捣碎的胡萝卜中进行压力处理。图2（A）展示的是800MPa压强及70°C温度下10株枯草芽孢杆菌菌株的失活变化规律。能观察到抗压性有很大变化。3株实验菌株形成的芽孢对压强很敏感并且1分钟内芽孢数量就减少了6个数量级。4株食物菌系菌株以及1株实验室菌株的孢子抗压性强些，16分钟后芽孢数量减少了多于4个数量级。从粘稠状面包中分离出的2株菌株形成的芽孢具有很高的抗压性，16分钟恒压处理后失活量少于2个数量级。这些菌株比解淀粉芽孢杆菌TMW2.492菌株抗压性强（图中1B和2A进行了比较）。 恒压操作持续时间（分钟）图2、记录800MPa及70°C操作下捣碎的胡萝卜中枯草芽孢杆

20、菌和解淀粉芽孢杆菌的孢子数量。（A）枯草芽孢杆菌TMW2.485（），TMW2.484（），DSM347（），DSM6405（），FAD94(),DSM618（），TMW2.469（），DSM10T（），FAD110（）以及FAD109（）。（B）解淀粉芽孢杆菌FAD82(),FAD11/2(),FAD99（），FAD77（），FAD108（）以及FAD We（）。图中展示了至少两个独立实验的数据，而且标准差一般小于0.66个对数单位。曲线下跌到坐标轴一下表示芽孢数量低于检测范围（log N/N0 =-6，在此N和N0和图1中定义相同)）。 恒压操作处理时间（分钟）图3、70°CTH

21、B热处理操作下，持续高压密封和压力脉冲对芽孢杆菌芽孢数量和芽孢释放DPA的影响。（A）枯草芽孢杆菌TMW2.485；（B）解淀粉芽孢杆菌FAD82；（C）地衣芽孢杆菌TMW2.492。和表示芽孢数量；和表示相对于芽孢起始DPA含量的DPA释放比率。和表示800MPa压强下持续高压密封；和表示压力脉冲操作，800MPa压强下每2分钟一次0.1MPa脉冲。枯草芽孢杆菌、解淀粉芽孢杆菌和地衣芽孢杆菌三者孢子中DPA含量分别为每个109孢子含有1.45±0.15， 0.96±0.13和0.39± 0.05 mM。图中展示了至少两个独立实验的数据。测定芽孢数量和DPA释放量

22、的标准差一般分别小于0.66个对数单位和5%。曲线下跌到坐标轴一下表示芽孢数量低于检测范围（log N/N0 =-6.4，在此N和N0和图1中定义相同）。 图2展示了解淀粉芽孢杆菌的7株菌株的芽孢失活情况。这些菌株之前都是从同一来源即粘稠状面包中分离出的，并且本质上对热和压强表现出一样的抗性。16分钟恒压处理后，有90%到100%的芽孢仍具有活性。在所有我们研究的菌株中，解淀粉芽孢杆菌形成的芽孢抗压性最强，这些芽孢处于捣碎的胡萝卜中在800MPa和70°C条件（图2B）下能坚持16分钟不减少数量。 形成孢子的环境条件对内生孢子抗压性的影响。孢子形成时的温度和芽孢中矿物质含量影响枯草芽

23、孢杆菌ATCC19659的孢子对压强和热的抗性（18）。我们的目标是鉴定食物菌系的枯草芽孢杆菌的芽孢的抗压性是否也受相似影响控制。形成孢子的环境条件深深影响抗压性。例如，从30°C、44°C和48°C的培养物中获得的孢子在800MPa、70°C下恒压处理1秒后，分别失活了2.5、5和6数量级个孢子。而从30°C且含有5 mM CaSO4, ZnSO4和 MnSO4的培养物中获得的孢子失活了4数量级个，这表示矿物质的存在降低了芽孢对高压和高温处理的抗性。 压力致使细菌内生孢子释放DPA。细菌内生孢子中高含量的DPA是影响它们抵抗化学及物理压力的重

24、要因素，同时压力导致释放DPA被认为触发了独立营养受体中的孢子的萌发。为了检验细菌内生孢子抗压性的变化是否和压力引起各自孢子释放DPA有关，在对具有较低、中等以及较高抗压性的芽孢，如枯草芽孢杆菌TMW2.485、地衣芽孢杆菌TMW2.492和解淀粉芽孢杆菌Fad82，进行800MPa、70°C处理操作后，测定各自的DPA释放量。实验在THB中进行，因为胡萝卜中的化合物会影响DPA的量化。图3中将芽孢中DPA的释放量和芽孢减少的数量进行了比较，发现抗压性和DPA总含量无关（图3）。相同pH条件下，将THB中芽孢失活量和打碎的胡萝卜中芽孢失活量进行比较，没有观察到显著性差异。芽孢在失活前

25、或失活时释放DPA。例如，瞬时压强操作后，地衣芽孢杆菌TMW2.494的芽孢减少了2.6个对数单位并且DPA总含量的85%从芽孢中释放出来。2分钟恒压处理后，具有较低和中等抗压性的枯草芽孢杆菌芽孢和地衣芽孢杆菌芽孢分别释放了96%、90%的DPA。那些压力处理了2分钟的芽孢和本质上失去了全部DPA的芽孢在70°C、0.1MPa下会失活。在这个为了芽孢释放DPA的短压力脉冲发生之后，70°C、0.1MPa下的失活变化规律和70°C、800MPa下的失活变化规律相同。因此，压力引起DPA缺失的孢子的形成过程伴随着耐热性的丧失，并且一旦芽孢失去多于90%的DPA，压力就

26、不再进一步影响芽孢失活。与此相反，具有高抗压性的解淀粉芽孢杆菌Fad82的芽孢在800MPa压强处理2分钟后只释放自身DPA含有量的58%，并且失去了58%DPA的芽孢对热不敏感。 DPA对DPA不足的突变枯草芽孢杆菌CIP76.26的抗压性和耐热性的作用。为了更细致地阐述DPA对细菌内生孢子抗压性的作用，检测热处理或压力处理抑或热和压力联合处理过的DPA不足的枯草芽孢杆菌CPI76.26突变菌株的失活量。从缺失DPA菌株的培养物中得到的芽孢，其DPA量只占从有DPA（2）培养介质中得到的芽孢中DPA含量的16%。巴拉萨等的结果在本次研究中已得到证实（数据未显示）。CIP76.26的缺失DPA

27、的芽孢在65°C、0.1MPa条件下失活（图4）。和环境压力下的失活相比，65°C、600MPa条件下的失活实质上没被加速，不考虑压力操作头三分钟内的孢子失活，在此期间温度会因为绝热加热而升温到65°C。含有DPA的孢子对热敏感；但是，如果忽视压力操作的头三分钟，因为在这段时间内压力下失活加速归结为温度因绝热加热上升的缘故，那么65°C、600MPa条件下的失活比得上DPA缺失的芽孢的失活（图4）。比较枯草芽孢杆菌和地衣芽孢杆菌野生菌株的芽孢，发现CPI76.26的含有DPA的芽孢在65°C、600MPa处理两分钟后，在压力脉冲65°

28、C、0.1MPa作用下会失活。简言之，含有DPA的芽孢具有耐热性，而无论缺失DPA的芽孢是从不含DPA的培养基中培养得到的还是通过压力脉冲使芽孢释放DPA得到的，它们都对热敏感。 恒压处理时间（分钟）图4、热处理（65°C，0.1MPa）、热和压力联合处理（65°C、600MPa）或者压力脉冲操作（65°C、600及0.1MPa）对缺失DPA的枯草芽孢杆菌突变体CPI76.26的芽孢失活的作用。芽孢的来源是含有外来DPA的配培养基（，和）或者不含外来DPA的培养基（，和）。和表示600MPa、65°C条件下持续高压密封；和表示600MPa、65°

29、;C处理2分钟并伴随0.1MPa、65°C的压力脉冲；和表示0.1MPa、65°C的处理条件。图中展示了至少两个独立实验的数据，并且其标准差一般小于0.66个对数单位。曲线下跌到坐标轴一下表示芽孢数量低于检测范围（log N/N0 =-6，在此N和N0和图1中定义相同)）。 压力处理过的芽孢的检测时间的分配：发芽或亚致死性损伤？一些作者（45）把芽孢在至少550MPa高压密封处中释放DPA看做芽孢萌发的结果，然而其他作者提出压力引起的DPA非生理性释放（27）在减压后会触发芽孢发芽。为了区别这两种假设，我们确定芽孢个体在压力处理前和处理后的检测时间。所有样品中检测到芽孢萌发

30、和外生长有明显的时间分配，这表明同一样品中的芽孢个体的生理状态有很大不同。一小部分芽孢的发芽速度比一般快，然而另有一小部分芽孢显示出检测时间被延长（图5）。图5A展示了枯草芽孢杆菌TMW2.485未处理的单个芽孢以及在200MPa、70°C下处理16分钟的单个芽孢的检测时间。加压处理的孢子表现出检测时间的分布，当和未处理的芽孢比较时检测时间变长，这表明是压力引起的亚致死性损伤而不是压力引起的发芽。从地衣芽孢杆菌TMW2.492（图5B）未处理和800MPa、70°C下处理4分钟的芽孢中能得出相似的结果。观察到的最短检测时间是12小时，并且90%未处理的芽孢的检测时间低于31

31、小时。当TMW2.492菌株在70°C、0.1MPa条件下处理10分钟后，90%的芽孢的检测时间变为23小时或更少（图5B），这表明 热激活了芽孢的萌发。相比之下，加压处理（800MPa、70°C）的样品中的芽孢有90%在81小时后才观察到发芽和外生长。没有一个芽孢表现出的检测时间低于20小时，这表明群体中所有芽孢都因操作处理受损伤。100MPa、20°C下处理TMW2.492菌株30分钟然后储存在-20°C环境中不会改变检测时间的分布。 为了研究DPA对芽孢萌发的影响，要确定DPA缺失的枯草芽孢杆菌CIP76.26的含有或不含DPA的未处理芽孢的检测时

32、间，然后和压力处理后的芽孢的检测时间进行比较（图5C）。含有DPA的芽孢比缺失DPA的芽孢表现出的检测时间更短，这表明在不存在任何其他压力因素的情况下缺失DPA会延迟芽孢发芽。在600MPa、65°C条件下处理8分钟后，会观察到含有DPA和缺失DPA的芽孢的检测时间的分布是相同的。 检测时间（小时） （纵坐标：累积频率）图5、枯草芽孢杆菌TMW2.485（A）、解淀粉芽孢杆菌TMW2.492（B）以及缺失DPA的枯草芽孢杆菌突变体CPI76.26（C）三者的芽孢的检测时间。（A）未处理的芽孢（，n=97）以及200MPa、70°C条件下处理16分钟的芽孢（，n=97）。（B

33、）未处理的芽孢（，n=282）以及800MPa、70°C条件下处理4分钟的芽孢（，n=110），100MPa、20°C条件下处理30分钟的芽孢（，n=183）或者0.1MPa、70°C条件下处理10分钟的芽孢（，n=177）。（C）含有DPA的芽孢（，；n=96），缺失DPA的芽孢（，；n=184），未处理的芽孢（，）以及600MPa、65°C条件下处理8分钟的芽孢（，）。讨论 一般认为压力导致的细菌内生孢子的失活是依靠压力引起孢子发芽、发芽的孢子失活来实现的。在本研究中，要测定食物菌系杆菌菌株以及参考杆菌菌株的抗压性。检查典型菌株释放DPA的作用，它可

34、能是抗压性不同的一个原因。此外，我们的目标是阐明从食物中分离出的高抗压性孢子在经过加压处理后改变了性能，即失去DPA和耐热性，是否可以归因于压力引起的发芽或亚致死性损伤。 杆菌物种芽孢的抗压性的变化性。在本研究中，比较食物菌系的14株杆菌菌株以及实验室培养的5株杆菌菌株对热和压强联合操作的抗性水平。当压强超过400MPa、温度超过60°C而且压强和温度都增加使芽孢失活提高(15,20,30,32,35)时，可以观察到枯草芽孢杆菌TMW2.485的芽孢和地衣芽孢杆菌TMW2.492的芽孢都大量失活，这和文献数据是一致的。到目前为止，芽孢杆菌只有一些实验室菌株能获得芽孢失活动态变化数据。

35、我们注意到密切相关的物种枯草芽孢杆菌、地衣芽孢杆菌和解淀粉芽孢杆菌三者的食物菌系菌株的抗压性具有很大变化性。使用两株瑞迪等人（31）发现的梭状属肉毒杆菌E类菌株也能在同一物种内观察到抗压性的不同。引人注目的是，本研究中使用的地衣芽孢杆菌TMW2.492菌株和其它来自食物菌系的枯草芽孢杆菌和解淀粉芽孢杆菌菌株相比表现出中等抗压性，但是比枯草芽孢杆菌的其它有文献数据记载的菌株的抗压性要高。这个发现强调了为在食品保存中建立加压处理过程，研究食物菌系是必要的。 研究中观察到之前从粘稠状面包中分离出的枯草芽孢杆菌和解淀粉芽孢杆菌菌株具有最高抗性。粘质中形成的杆菌的芽孢比其它枯草芽孢杆菌和解淀粉芽孢杆菌菌

36、株的芽孢耐热性更强，这是因为这些芽孢在相当于100°C热处理40到60分钟（34）的烘烤等过程中存活了下来。这个发现可暗示耐热性和抗压性间有关联。但是，对于这些粘质中杆菌的菌株来说耐热性（34）和抗压性无关联。此外，解淀粉芽孢杆菌芽孢的抗压性比对湿热具有很高抗性的嗜热脂肪土芽孢杆菌芽孢的抗压性强很多。同样地，六株芽孢杆菌菌株的芽孢的抗压性和他们的耐热性无对应关系（24）。因此，那些用于确定生产过程中食物热处理合适条件的靶标微生物不适合用作要加压处理的靶标微生物。根据已经发行的资料可得，和芽孢杆菌、嗜热芽孢菌、脂环酸芽孢菌及包含梭状肉毒素A类和E类菌株（1,5,9,10,11,16,1

37、8,20,23,29,30,31,32,41,45）在内的梭菌属的芽孢相比，解淀粉芽孢杆菌Fad11/2、Fad77、Fad82、Fad99和Fad108的芽孢具有更强的抗压性。 因此，目前我们认为它们是食物加压灭菌中的靶标微生物。 孢子形成时的条件对抗压性的影响。我们观察到枯草芽孢杆菌TMW2.485 的孢子的抗压性依赖孢子形成时的条件而具有很大的变化性。实验中我们观测到抗压性随着孢子形成温度的上升而降低，这和Igura等人的实验结果是一致的。我们能更进一步说明向形成孢子的培养基中添加矿物质会降低孢子的抗压性。孢子形成时的温度和和孢子的矿化作用两者对抗压性的影响和对耐热性的影响是相反的。检测

38、时间可作为生物异质性和亚致死性损伤的一种测量方法。确定独立营养细菌细胞的检测时间被认为是测量一个群体（3）生物异质性的一种合适方法，同时也应用于检验热处理的植物乳杆菌（40）细胞的亚致死性损伤。在本研究中，该方法被应用于确定杆菌属的未处理或已加压处理的芽孢的种群异质性。同基因的细菌培养会出现生物异质性，一是因为培养容器中的化学和物理梯度，二是因为基因表达中的统计事件。掌握细菌培养的生物异质性这一方面的知识是构建细菌生长和失活（16,22）的数学模型的先决条件。对于植物乳杆菌的营养细胞，我们观察到在运用亚致死压力后，检测时间急剧增加。此外基于压力操作，我们注意到检测时间有较广的分布，并且所给样品

39、的芽孢进行萌发和生长需要24到29小时。正如本研究以及大部分其他有关细菌内生孢子因压力而失活的研究所展示的，该结果在平板计数确定芽孢数量的系统误差之内。为了实现存活下来的芽孢中生长的多于99%，要求琼脂板保温要超过96小时，且保温时间不足会导致降低芽孢数量。但是，本实验中使用粘质中的芽孢杆菌菌系，过长的保温时间也会产生系统误差。那些24小时内发芽的孢子会迅速覆盖整个琼脂平板，如此会无法计算那些后来才发芽的孢子。 耐热性以及压力引起释放DPA：发芽还是亚致死性损伤？在环境温度下多达250MPa的合适压强引起孢子发芽和营养引起孢子发芽类似（6,13,17,45）。合适压强下压力引起的发芽会导致孢子

40、释放DPA，并且得到和营养细胞孢子相比对热和压力敏感的黑相孢子。在压强达500MPa、环境温度（25到40°C）条件下，孢子发芽是由不同于低压时（44,45）的一种机制引起的。压力法可导致芽孢非生理性失去DPA，并使得解压后芽孢的萌发不依赖营养受体（27,28,44）。 在该工作中，800MPa、70°C操作处理后，我们观察到芽孢杆菌属的芽孢失去DPA而且热敏感度提高，这被认为可能是发芽这一生理过程导致的结果，或者是芽孢物理化学性失去DPA的结果。枯草芽孢杆菌TMW2.485的芽孢在致死压力处理后仍相位明亮（图1，数据未显示），这反驳了压力引起发芽这一原因。为了促进区分压力

41、引起的发芽和压力引起的亚致死性损伤，我们检验了单个芽孢的检测时间的分布。热诱导芽孢萌发会减少检测时间，这表明我们的实验装置适合用来检测芽孢失活。中压处理（100MPa、20°C）芽孢不影响检测时间；但是，冷藏后再进行压力处理（7）时，压力对芽孢萌发的激活作用（44）可能会反转。200MPa、70°C或800MPa、70°C处理芽孢会增加检测时间，使其翻2到4倍，这表明联合运用热和压力不会引起萌发，相反地，会导致亚致死性损伤。使用DPA缺失的突变枯草芽孢杆菌CPI76.26的实验证明了检测时间增加的部分原因是加压处理的芽孢缺失DPA。压力造成的其他损伤可能包括皮层裂

42、解酶的失活。因此，联合运用热和压强处理操作中的DPA的丧失可以看做一个物理化学过程的结果。高温高压处理后，DPA的丧失在解压后不会导致孢子开始发芽，这和低温高压处理后所发现的结果形成鲜明的对比。DPA的释放可能是由于芽孢的质膜、皮质或外膜的渗透性增强导致的。从中，压力法能增强细菌膜的渗透性及损伤完整膜蛋白功能（25,42）得到很好的证明。 芽孢释放DPA伴随着芽孢热敏感性的提高。比较加压处理过的枯草芽孢杆菌、地衣芽孢杆菌和解淀粉芽孢杆菌的孢子的热敏感性和DPA释放量可以得到如下结论：要想获得热敏感芽孢必须失去全部DPA（未处理的芽孢失去的DPA要多于90%）。这些不含DPA、相位明亮的芽孢不如

43、休眠的芽孢耐热性强，但是它们的抗压性和耐热性远强于杆菌营养细胞（16）。要想获得不含DPA、热敏感的芽孢需要联合运用压力和热进行处理。但是，一旦超过90%的DPA从细胞中被释放出来，芽孢的失活就不再受压力影响。800MPa、70°C处理2分钟并伴随一个压力脉冲以使DPA从芽孢中释放完全，然后800MPa、70°C或者0.1MPa、70°C 进一步处理对枯草芽孢杆菌和地衣芽孢杆菌的影响相同。对DPA缺失的突变枯草芽孢杆菌CPI76.26也有相似影响。对于解淀粉芽孢杆菌，800MPa、70°C处理2分钟后只有58%的DPA从芽孢中释放出来并且芽孢仍具有耐热性

44、。因此，杆菌芽孢的失活可看做一个要经历两个阶段的过程。首先，因为联合运用热处理和压力处理，会形成亚致死性损伤的、不含DPA的热敏感性孢子。第二，这些孢子被不依赖压力水平地热灭活。这个所提到的热和压力导致芽孢失活的机制可以解释为什么在一些情况中能发现芽孢耐热性和抗压性间的联系，而在其它情况中这种联系不存在。 总之，我们观察到杆菌内对压力和温度操作的抵抗性具有极大的变化性。着重提出温度和压力操作处理食物过程中的相关靶标微生物，也就是说，能形成高抗压性孢子的5株解淀粉芽孢杆菌菌株（Fad11/2、Fad82、Fad77、Fad99和Fad108）。我们的数据表明在本研究所用的压力和温度范围中，即温度

45、大于60°C 和压强大于600MPa，芽孢失活的机制是一个2级机制。第一，压力和温度作用形成亚致死性损伤的、不含DPA且相位明亮的芽孢。第二，不依赖压力，这些芽孢被中火加热就会失活。因此，芽孢对压力和温度联合操作的抗性大小取决于它们自身保留DPA的能力以及不含DPA的芽孢的耐热性。这个机制可以解释为什么一些有关芽孢的耐湿热性的重要芽孢性能也和抗压性有关，而其它性能和抗压性无关联。此外，它使得用最低操作强度的压力脉冲处理食物以使细菌内生孢子安全失活成为可能。 鸣谢 我们感谢Annegret Beck，Margot Maier和Matthias Werner的援助。我们感谢Walter

46、P. Hammes提供粘丝面包菌系。 德国联邦环境基金会为研究提供经济支持（拨款13053/20）。 参考文献1. Ananta, E., V. Heinz, O. Schlu¨ter, and D. Knorr. 2001. Kinetic studies onhigh-pressure inactivation of Bacillus stearothermophilus spores suspended infood matrices. Innov. Food Sci. Emerg. Technol. 2:261272.2. Balassa, G., P. Milhaud, E

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