Biochemistry-chapter_3_AA_and_primary_st(1)

1、(3) Density gradient centrifugation离心沉降是利用固体和液体之间的离心沉降是利用固体和液体之间的密度差密度差将两者分离，将两者分离，一般来说细胞、细胞碎片、蛋白质沉淀物及病毒颗粒的一般来说细胞、细胞碎片、蛋白质沉淀物及病毒颗粒的密度都大于其相应的液体环境，可以利用离心的方式使密度都大于其相应的液体环境，可以利用离心的方式使其沉降。其沉降。沉降的难易取决于几种因素：沉降的难易取决于几种因素：密度差密度差越大，离心沉降速越大，离心沉降速度越快；在密度差存在的条件下，度越快；在密度差存在的条件下，分子的质量分子的质量越大，沉越大，沉降速度越快，但降速度越快，但体积体

2、积大的分子出于阻力大，会影响其沉大的分子出于阻力大，会影响其沉降速度；降速度；液体的粘稠度液体的粘稠度越大越不容易离心。越大越不容易离心。Sedimentation coefficient (s) s = dx/dt /2r 1S (Svedberg) =10-13 秒秒 s=V (D-D)/f ，V-被离心物质的体积，被离心物质的体积，D-D-溶液密度密度差，溶液密度密度差， f为摩擦系数，为摩擦系数，离心机按转速可分为：离心机按转速可分为：普通离心机普通离心机(500一一4000rpm)、高速离心机、高速离心机(800一一25000rpm)、超速离心机、超速离心机(2500080000rp

3、m)和超高速离心和超高速离心机机(150000rpm)。分子量大于。分子量大于108者可用高速和普通离心机，者可用高速和普通离心机， 106- 108者应选用超速离心机，而小于者应选用超速离心机，而小于106者用离心和超速离心效果不者用离心和超速离心效果不好。好。 利用离心机分离物质主要采用两种方式：利用离心机分离物质主要采用两种方式：沉降速度法沉降速度法和和沉降平衡沉降平衡法法。 沉降速度法沉降速度法 主要用于分离沉降系数不同主要用于分离沉降系数不同(相差达一个数量相差达一个数量级以上级以上)的物质，这种方法采用差速离心，逐步分级增大离的物质，这种方法采用差速离心，逐步分级增大离心力，开始在

4、一个较低的速度下离心，使可溶物和不溶物心力，开始在一个较低的速度下离心，使可溶物和不溶物分开，取上清后加大离心速度，使某些沉降系数大的物质分开，取上清后加大离心速度，使某些沉降系数大的物质沉淀，然后再次去上清，加大离心力，再次获得另一种物沉淀，然后再次去上清，加大离心力，再次获得另一种物质沉淀，如此反复多次，使不同物质按沉降系数不同逐级质沉淀，如此反复多次，使不同物质按沉降系数不同逐级分开。分开。沉降平衡法沉降平衡法 当两种物质的沉降系数差别不到一个数量级当两种物质的沉降系数差别不到一个数量级时，用沉降速度法很难分开，这时要借助于沉降平衡法来时，用沉降速度法很难分开，这时要借助于沉降平衡法来获

5、得比较满意的分离效果，常用的为获得比较满意的分离效果，常用的为密度梯度离心法密度梯度离心法。这。这种方法的原理是人为造成离心管中不同的密度环境，使介种方法的原理是人为造成离心管中不同的密度环境，使介质的最大密度大于分离物的最大密度，这样分离物在离心质的最大密度大于分离物的最大密度，这样分离物在离心力的作用下，各自停留在与其密度相当的区域，从而达到力的作用下，各自停留在与其密度相当的区域，从而达到分离的目的，这一方法的要点是离心时间要足够，离心后分离的目的，这一方法的要点是离心时间要足够，离心后分层收集。分层收集。 3. Purification methods according to dif

6、ference of charge (1) Ion exchange chromatography： (2) Polyacrylamide gel electrophoresis（PAGE） (3) Isoelectric focusing electrophoresis（IEF）：）： (1) Ion exchange chromatography 离子取代优先顺序+电荷高者离子大者浓度大者 蛋白质纯化常用亲水性离子交换剂。因为亲水性离子交换蛋白质纯化常用亲水性离子交换剂。因为亲水性离子交换剂对生物大分子物质的吸附和洗脱均较温和，被分离纯化剂对生物大分子物质的吸附和洗脱均较温和，被分离纯化的

7、物质不易被破坏。的物质不易被破坏。 纤维素类纤维素类：纤维素离子交换剂是最早用于生物大分子分离：纤维素离子交换剂是最早用于生物大分子分离的介质，它具有松散的亲水网络，大孔隙、表面积大等优的介质，它具有松散的亲水网络，大孔隙、表面积大等优点。但因以无定型为主，故很难用于层析柱操作。点。但因以无定型为主，故很难用于层析柱操作。DEAE-Sephacel 是经特殊交联处理制成的珠状离子交换纤维素。是经特殊交联处理制成的珠状离子交换纤维素。葡聚糖系离子交换介质葡聚糖系离子交换介质：主要以：主要以Sephadex系的产品为主，系的产品为主，它是在它是在Sephadex G25及及G50两种凝胶过滤介质上

8、引入功能两种凝胶过滤介质上引入功能基后，产生的多种离子交换介质。该类介质容量大，价格基后，产生的多种离子交换介质。该类介质容量大，价格较低，但由于流速、体积受外界影响较大，逐渐被新一代较低，但由于流速、体积受外界影响较大，逐渐被新一代的的BioProcess凝胶所代替。凝胶所代替。琼脂糖系琼脂糖系（agarose)：琼脂糖凝胶介质上引入功能基得到的：琼脂糖凝胶介质上引入功能基得到的多种离子交换剂。其中，新一代多种离子交换剂。其中，新一代BioProcess系列凝胶，具有系列凝胶，具有流速高，载量大，理化稳定性好，可就地清洗，并可反复流速高，载量大，理化稳定性好，可就地清洗，并可反复使用，是目前

9、使用最多的离子交换介质。使用，是目前使用最多的离子交换介质。Test-tube methods for selecting ion exchange conditions(2) SDS-Polyacrylamide gel electrophoresis （SDS-PAGE） Monomer：acrylamide，Methylenebisacrylamide; Accelerator：TEMED （N,N,N,N-Tetramethylethylenediamine）; Initiator：Ammonium Persulfate； Denaturant：SDS； Reductant：-Merc

10、aptoethanol;SDSPAGE(3) Isoelectric focusing electrophoresis （IEF）Principle of IEF10 or 20 FractionsAmpholytes generate pH gradient (pH 3-10)7.59.57.5pI 4.57.57.57.5pI 4.59.59.59.59.5pI 4.5 3 4 5 6 7 8 9 10 Anode(+)Cathode(-)ACIDBASEProteins Migrate to their pI ( 0 net charge)Principle of IEF 10 or 2

11、0 FractionsHarvest with Vacuum Source7.59.57.5pI 4.57.57.57.5pI 4.59.59.59.59.5pI 4.5 3 4 5 6 7 8 9 10 Anode(+)Cathode(-)ACIDBASE2-D electrophoresis Condition ACondition B34710pH+-+SAMPLE PREPARATIONFIRST DIMENSIONSECONDDIMENSIONSTAININGIMAGINGANALYSIS &EXTRACTIONMASS SPECTROMETRICIDENTIFICATION

12、 OF SPOTS2-D Expression Proteomics Methodology Types of proteins Proteomics - study of large sets of proteins, such as the entire complement of proteins produced by a cell E. coli has about 4000 different polypeptides (average size 300 amino acids, Mr 33,000) Fruit fly (Drosophila melanogaster) abou

13、t 16,000, humans, other mammals about 40,000 different polypeptides4. Purification methods according to interaction of a protein with other compounds Affinity chromatography ：(2) Adsorption : (3) Hydrophobic chromatography:固相载体(1)(2)(3)ABSampleWashingElutionXB亲和基团配体XBAA（1）Affinity chromatographyTypi

14、cal affinity purification金属螯合亲和层析金属螯合亲和层析，其原理是利用蛋白质表面的一些氨基，其原理是利用蛋白质表面的一些氨基酸，例如酸，例如: :组氨酸等能够与多种过渡金属离子如组氨酸等能够与多种过渡金属离子如Cu2+Cu2+，Zn2+Zn2+，Ni2+Ni2+，Co2+Co2+，Fe3+Fe3+发生特殊的相互作用，利用这个原理发生特殊的相互作用，利用这个原理对蛋白质加以分离。因此偶联了合适金属离子的琼脂糖凝对蛋白质加以分离。因此偶联了合适金属离子的琼脂糖凝胶就能够选择性的吸附那些含有组氨酸的蛋白和对金属离胶就能够选择性的吸附那些含有组氨酸的蛋白和对金属离子有吸附作用

15、的多肽、蛋白和核苷酸。半胱氨酸和色氨酸子有吸附作用的多肽、蛋白和核苷酸。半胱氨酸和色氨酸也能与固定金属离子产生结合作用，但这种结合力要远小也能与固定金属离子产生结合作用，但这种结合力要远小于组氨酸残基与金属离子的结合力。于组氨酸残基与金属离子的结合力。(2) Adsorption （Hydrophobic Interaction Chromatography，HIC）u 疏水作用层析是根据分子表面疏水性差别来分离蛋白质和多肽等生物疏水作用层析是根据分子表面疏水性差别来分离蛋白质和多肽等生物大分子的一种较为常用的方法。蛋白质和多肽等生物大分子的表面常常暴大分子的一种较为常用的方法。蛋白质和多肽等生物大分子的表面常常暴露着一些疏水性基团，我们把这些疏水性基团称为疏水补丁，疏水补丁可露着一些疏水性基团，我们把这些疏水性基团称为疏水补丁，疏水补丁可以与疏水性层析介质发生