吸入性及食物性过敏原特异性IgE抗体检测SOP欧蒙

1、吸入性及食物性过敏原特异性IgE抗体检测 欧蒙印记法1 .目的：标准实验室吸入性及食物性过敏原特异性IgE抗体的检测操作.2 .范围：XXX医院xxx科3 .测定原理：采用免疫印迹法原理. 经缓冲液预处理的检测膜条与患者样本进行温育.如果样本阳性,IgE类特异性抗体与相应的过敏原结合.在洗涤之后,参加酶标单克隆的抗人IgE抗体酶结合物进行第二步温育,以形成复合物.在孵育之后,冲洗掉未结合的酶-抗-IgE , 然后参加底物液,发生颜色反响.终止反响之后,风干判读结果.4 .标本：4.1 病人准备：要求患者在安静状态下；晨起的精神、体力、情绪等因素的影响较小,是标 本采集的最正确时间；抽取肘部静脉

2、血或毛细血管血.4.2 标本种类：人血清或者 EDTA肝素或柠檬酸抗凝血浆.4.3 标本稳定性：彳f测样本于 2-8.C条件下通常可保存 14天.稀释后的样本应在同一个 工作日内检测.4.4 标本稀释：4.4.1 患者样本不需稀释,直接检测方案a.4.4.2 如果样本量过少,可用已稀释的通用缓冲液 1:11稀释血清或者血浆样本,然后过夜 温育方案b.例如：100ul血清用1.0ml已稀释的通用缓冲液稀释,并用旋涡混匀 器充分混匀,不适合用加样枪混匀.4.4.3 如果使用特定的温育盘ZD9897-0130用于减少血清用量打的实验,使用这种温育 盘未稀释血清用量可以减少至400ul 方案c.4.5

3、 标本容器：一般用真空采血管中的血清促凝管红色头盖或抗凝管紫色或绿色头盖.4.6 标本最小用量：血清最小用量1ml.4.7 标本运送：标本采集于真空采血管后应尽快送实验室分析,物流系统可加快标本传递速 度.假设标本不能及时转运到实验室,应将真空采血管内的标本置冰瓶或冷藏箱内,运 送过程中应预防剧烈震荡.当天无法运送的标本应别离血清后冷藏.5 .试剂：5.1 来源：欧蒙公司.5.2 规格：16*1人份/盒5.3 试剂盒组成和代号：主要组分：16人份的试剂盒成分规格包被过敏原的检测膜条：ts20, w1, w6, ds1, h1, e1, e2, i6,ms1, u80, f1, f2, f13,

4、 f14, f27, f88, fs33, fs34, f24, f23,CCD16x1酶结合物：碱性磷酸酶标记的抗人IgE 小鼠,直接使用1x20ml通用缓冲液：10倍浓缩1x100ml色原/底物液：NBT/BCIP四陛硝基苯胺兰/5-澳-4-氯咤-3-口引喋-磷酸盐,直接使用1x30 ml温育盘2 x 8 槽塑料封膜1张产品说明书1份5.4 储存和稳定性：2-8° C保存,不要冰冻.未开封前,试剂盒可稳定至所标示的有效期.已稀释的缓冲液必须在一个工作日内用完.5.5 试剂的准备和稳定性：5.5.1 试剂在使用前均应在室温18-25 C平衡30分钟左右.5.5.2 包被过敏原的检测

5、膜条：直接使用.为预防膜条发生冷凝,只有当膜条平衡到室温后才可翻开包装.取出膜条后应立即密封好原包装并将其保存于2-8 ° C5.5.3 酶结合物：直接使用.使用前充分混匀.通用缓冲液：10倍浓缩.在稀释前应充分混匀.用干净的吸管从瓶中吸取需要量用蒸储水或去离子水1:10稀释.由于欧蒙印迹法中使用了特殊的膜条,因而需要用已稀释的通用缓冲液稀释患者样本和清洗检测膜条.如需温育一条检测膜条,可取 5ml浓缩缓冲液用45ml蒸储水或去离子水稀释. 稀释后的缓冲液应在同一个工作日用完.5.5.4 底物液：直接使用,因对光敏感,使用后应立即盖紧瓶盖.6 .临床标本测定：操作流程预处理:将检测所

6、需的膜条朝上放置于温育槽中,分别参加1.0ml通用缓冲液,于室温温育5分钟后吸去温育槽中的液体.血清温育手动：第一次：a 省时：在温育槽中分别参加 1.0ml未稀释的患者样本,在摇摆摇床上室温18-25 C温育60分钟.b(省血清量):将至少1.0ml已稀释的样本在摇床上室温温育过夜(12-24小时),温育时需加盖以防挥发.c(兼具省时和省血清量 ):在每条特殊温育槽 (ZD9897-0130)中参加400ul未稀释的患者样本,在摇床上室温温育60分钟.自动：方案b中,1:11稀释样本过夜温育,反响液体量为1.65ml (1.5ml通用缓冲液加150ul的样本).清洗：手动：吸去每个温育槽内白

7、液体,在摇床上用1.0ml通用缓冲液清洗膜条 3次,每次5分钟. 自动：1:11稀释样本过夜温育的方案b中,第一步清洗时的缓冲液的量为1750ul.酶结合物温育在每个温育才t中参加 1.0ml酶结合物(碱性磷酸酶标记的抗人IgE,单克隆),于摇床上室温温育 60分钟.第二次：清洗：吸去每个温育槽内液体,在摇床上用1.0ml通用缓冲液1#洗膜条 3次,每次5分钟.色原/底物温育 在每个温育槽中分别参加1.0ml色原/底物温育,于摇床上室温温育10分钟.第三次：终止反响：吸去槽内液体,用蒸储水或去离子水清洗膜条3次,每次1分钟.结果判断：将检测膜条放置在结果判断模板中,风干后判定段结果.7 .性能

8、指标：7.1 检测范围：欧蒙印记法是一种半定量检测方法.7.2 精密度：通过比拟同一样本在相同时间内屡次检测结果的差异来研究批内差异；批间差 异为用不同批号产品在不同时间对同一样本进行检测所得的差异.每一次实验,抗原 带着色的深浅都在额定范围内.该欧蒙印迹法试剂具有很好的批内和批间重复性.7.3 灵敏度：采用 Pharmacia CAP系统为参考方法,本检测系统的灵敏度对于牧草(g6)为90% 白桦(t3)为90% 屋尘蛾(d1)为83% 粉尘蛾(d2)为84% 猫(e1)为98% 马 (e3)为 82%.7.4 方法学比拟：与 Pharmacia CAP系统相比拟,该试剂具有很好的特异性和灵

9、敏度.7.5 特异性：采用Pharmacia CAP系统为参考方法,本检测系统的特异性为牧草 (g6)为100%白桦(t3)为92%屋尘蛾(d1)为100%粉尘蛾(d2)为86% 3s(e1)为91%马(e3)为100%7.6 交叉反响：由于过敏原之间具有相似的结构,如化学组成相似或植物学上的相关性,在 过敏原之间可出现交叉反响,患者体内的特异性IgE抗体也可与同源性蛋白过敏原上的相同表位结合.8 .方法的局限性：8.1 干扰因素：血红蛋白浓度小于5 mg/ml的溶血、甘油三脂浓度小于20 mg/ml的脂血和胆红素浓度小于0.4mg/ml的黄疸对检测结果没有影响.8.2 利用该检测结果进行诊断

10、时,最好结合病人的病史、临床体征和其他检查结果.9 .检测结果的判断及解释：9.1 方法：将温育后湿的检测膜条置于结果判定模板的塑料膜上进行目测判断结果时,判断模板可从欧蒙订购, 或者用专用的软件判断检测结果并与标志对齐.用吸水纸小心吸去膜条上的水分, 待膜条完全干透后,将粘附于塑料膜上, 潮湿的膜条上会出现背景 颜色,因而必须等膜条完全干透后才能判断结果.9.2 目测判断结果时,将检测膜条上出现清楚可见的,且与结果判定模板上标记位置相同的 条带记录在结果判定模板上.9.3 软件判读结果,见其操作指南.9.4 在检测膜条的下端有一条指示带,如果这条指示带出现清楚可见的颜色反响,说明实验 各步操

11、作正确.如果指示带没有出现颜色反响,那么说明实验操作不当,应该重新检测.9.5 鞋鱼/妒鱼/鲤鱼打的检测结果,仅供研究,不用于临床诊断.9.6 结果的判断：在判断结果时必须考虑到条带饿肚肚位置和颜色强度,通过比拟结果判断模板和已温育的检测膜条可确定抗相应过敏原IgE抗体.条带大的颜色强度可分为 4类:类别结果条带特性0阴性：无临床意义未出现条带+低浓度抗过敏原IgE抗体,局部临床意义弱条带+中浓度抗过敏原IgE抗体,通常具有临床意义清楚的条带+高浓度抗过敏原IgE抗体,许多病例出现临床病症染色很深的条带膜条上包被抗原位置：的缩写过敏原1ts20树组合2 柳树/杨树/榆树2w1普通豚草3w6艾高

12、4ds1尘螭组合1 屋尘螭/粉尘螭5h1屋尘6e1猫毛7e2狗上皮8i6螳螂Q霉菌组合1 点青霉/分枝孑6霉/烟曲霉9msi/交链抱霉10u80W11f1鸡蛋白12f2牛奶13f13花生14f14黄豆15f27牛肉16f88羊肉/羊羔肉17fs33海鱼组合1 鳄鱼/龙虾/扇贝18fs34淡水鱼组合 1 鞋鱼/妒鱼/鲤鱼19f24虾/对虾20f23蟹21CCDCCD标记物aInd指小中10 .考前须知：10.1 本检测试剂仅用于体外诊断.10.2 试剂盒中局部试剂含有毒性的叠氮钠,应预防接触皮肤.10.3 试验的所有样品均应作为传染性物品处理.11 .临床意义：过敏反响是一种对异物的超敏反响.这

13、些异物通常无害,但在过敏反响患者中, 那么产生强烈的反响.最常见的过敏反响为I型过敏反响,其特征是形成特异性igE抗 体.一旦跟过敏原接触很快就会产生诸如发红,水肿以及瘙痒等病症.典型的过敏反应有鼻炎、通常所说的花粉热、 结膜炎和哮喘.接触过敏原的次数越多,过敏反响就 会越严重.如果发生系统性过敏反响,可能会出现危及生命的严重反响全身性过敏反响.吸入性过敏反响可由季节性过敏原树、草或种子的花粉引起,也可由常年性过敏原尘蛾、霉菌抱子、宠物的唾液和皮屑引起.除了空气传播的过敏原 如花粉、灰尘和霉菌可引起过敏反响外,还有食物也可引起过敏反响.最常见的食物过敏原有花生、大豆、小麦、贝类、鱼、牛奶、蛋类

14、和坚果.食 物过敏反响是IgE介导的过敏反响,在摄入食物后的几个小时内可出现相应的病症. 可能的病症为唇、舌、喉部灼痛或瘙痒、恶心、腹部痉挛、腹泻和红斑,甚至可出现 哮喘、气短、心跳加速、恐慌和精神错乱.有时坚果、贝类、鱼和花生甚至能引起全 身型过敏性反响或者致死性过敏反响.由于保守的植物性过敏原引发的IgE抗体和相关植物制作的食物或者非食物类过敏原发生交叉反响.如对于白桦树花粉过敏的患者可能对苹果、胡萝卜、芹菜、榛果、马铃薯或者称猴桃过敏.许多过敏原是含有低 聚糖侧链的糖蛋白类, 这些侧链结合在过敏原的蛋白骨架上.有时,患者体内会产生针对这种糖类结构的抗体.CCD是“引起交叉反响的糖类抗原决

15、定簇的简写.CCD1遍存在于大量植物或动物类过敏原中. 由于它们结构的相似性,CCD可引起很强的交叉反因. 但大多数情况下,认为它们与诊断无关,但同时又对体外诊断阳性结果的解释造成影响.因此,引入抗CCD类的特异性IgE抗体的检测可能会提供有用的信息,尤其当IgE阳性结果与临床表现不符时,会为我们解释检测结果提供帮助.该试验可对特异性过敏原IgE进行测定,以确定究竟是对哪一种物质过敏.12 .平安防护举措及处理12.1 按要求穿白大褂,带一次性手套.12.2 处理试剂和样本时需戴一次性手套,操作后应彻底洗手.所有样本及使用后的试剂盒 应视为潜在的传染性物质,废弃处理时,根据当地政府和有关国家规定进行.12.3 如果发生污染,视污染范围,部位选择适宜的处理方法以下浓度84消毒液均由原液配置成：12.3.1 血液标本污染台面,用 7000mg/L的84消毒液浸泡抹布,擦拭污染区域,小心处理 容器碎片,消毒后置于利器盒内12.3.2 血液标本溅洒在白大褂上,应脱去衣物