完整版FISH技术全攻略

1、FISH 荧光原位杂交技术全攻略荧光原位杂交技术Fluorescence in situ hybridization , FISH是一种 应用非放射性荧光物质依靠核酸探针杂交原理在核中或染色体上显示核 酸序列位置的方法.该技术问世与70年代中期左右,其曾多于与染色体异常的研究,近年来随着 FISH探针种类的不断增多,使得该技术逐步应 用于各种领域.该技术具有快速,平安,灵敏度高以及探针可长期保存等 特点,目前已广泛应用于细胞遗传学,肿瘤生物学,基因定位,基因作图,基因扩增及分子诊断等领域.1对于FISH操作来说,那些因素比拟重要在FISH中最重要的因素是温度、 光照、湿度和各种试剂的PH值.温

2、 度和湿度直接影响着探针和目标DNA的杂交效率；光照影响了荧光染料的强度,因此探针要避光保存,其已经杂交的片子可用防荧光淬灭剂封片 且避光保存；各种试剂pH也要精确到达要求,这也直接关系到FISH的稳 定性.2如何保证FISH操作中的温度最正确的举措是使用一些 FISH的专用仪器进行操作,如Vysis的Hybrit FISH杂交仪.如果是手工操作,首先要对 FISH操作过程中可能使用的一 些仪器进行温控水平的检查,如水浴锅、孵箱,对其中不符合要求的要进 行更换疾病诊断中的探针要求温控精度在0.5度以内.其次,要尽可能地保持操作环境温度在20度以上,对于在冬季进行的FISH操作尤为重要. 此外对

3、于需要预热以到达要求温度的试剂,在使用前必须使用温度计对其 进行测温.同时检测的样本最好不能超过 4块.操作中的行动一定要迅速. 操作者还往往无视一些小部件的温度,诸如载玻片和盖玻片.特别是在冬 季,盖玻片本身温度就低,加之探针的量本就不多 10ul,因此事先没有 预热的盖玻片会使得杂交液的温度急剧下降严重地影响了探针和目标DNA的杂交效率.因此对上述小部件的要进行预热处理,不然会影响FISH 的杂交效果.3使用荧光显微镜观察结果时,最初有清楚而明亮的信号,但随后信号急 剧衰减,几分钟后信号就消失了.这是探针本身的质量问题吗正常情况下,商业化探针即使是杂交后,如保存适当,荧光信号能保 持半年以

4、上.出现上述情况主要的原因是操作观察的过程中或是探针的保 存过程中没有采取严格的避光举措.阳光或是强的灯光都会使荧光染料发 生急剧的淬灭,从而造成了观察结果的不稳定.因此在操作和观察时,尽 可能在暗室中操作,也可以在封片观察时参加一定的 antifade 抗淬灭剂 以延缓荧光素的淬灭.4如何配制各种试剂呢强烈建议使用灭菌去离子水配制各种所需的试剂.止匕外,配制后使用 pH计检测是否符合要求.配制的各种试剂都要采用超纯级要求.每次FISH 使用新的试剂,旧的试剂最好弃置不用.洗脱液和变性液当天用当天配.5直标型探针和间标型探针有何不同为什么我们要选择直标型探针所谓的直标型探针是指DNA探针共价连

5、接荧光素基团；间标型探针那么是指DNA探针先与某个半抗原连接,诸如生物素或地高辛,然后半抗原与荧光素基团连接从而形成探针-半抗 原一荧光素基团,类似 三明治的复合物.与间标型探针相比,直标型探 针具有低背景、高特异性的特点.随着荧光染料和荧光检测技术的不断发 展,直标型探针的灵敏度也不断提升.因而在 FISH检测领域,尤其是在 疾病分型领域,探针大多采用直标型设计.6能对同一样本进行屡次的 FISH操作吗?在多数情况下,如果 FISH操作没有得到正常的结果,我们可以将探 针洗去,然后使用同样的探针进行再次的杂交.如果我们使用的是直标型 探针,还可以使用不同探针对同一样本进行反复杂交.针对不同的

6、样本, 处理方法略有不同.外周血样本的处理：1、使用镶子小心地揭去杂交区的盖玻片2、将样本片浸泡于70%、85%和100%的乙醇中各一分钟以 便充分地脱水.将片子风干后就可以进行重复的杂交了.二次杂交中建议 将变性的时间缩短一半,但不得少于 3分钟.如果对同一样本还要进行三 次杂交,变性的时间就无需减少了.对于屡次杂交,复染液浓度的降低有利于保持探针的亮度.曾有报道在同一样本片上进行了多达8次的FISH操作.也可对已经进行G带显色的样本片进行FISH操作：将样本片浸 泡于70%、85%和100%的乙醇中各二分钟以便充分地脱水.将片子风干 后就可以进行重复的杂交了.二次杂交中建议将变性的时间缩短

7、一半,但 不得少于3分钟.如果对同一样本还要进行三次杂交,变性的时间就无需 减少了.8 FISH技术有哪些主要优势 平安、快速、灵敏度高； 探针能较长时间保存； 多色标记,简单直观；可用于中期染色体及间期细胞的分析；可应用于新鲜、冷冻或石蜡包埋标本以及穿刺物和脱落细胞等多种物质 的检测.9目前能开展原位杂交这方面工作是否相对可信的公司上海舜百生物可提供原位杂交技术效劳工程,那边公司在正式接受实验 委托三周内客户需要提供探针和检测样本交付实验结果,所提供实验结果忠实于样本的实际情况.如果有相关意向可以,与那边取得联系.目 前主要集中在DNA水平方面检测,而针对 RNA这块比拟困难.10原位杂交技术的开展前景如何FISH技术作为连接分子生物学与细胞生物学的桥梁地位已为世人所 公认.尽管目前 FISH技术无法到达百分百完全杂交,特别是在应用较短 cDNA探针时存在杂交效率明显下降的问题,但随着各种新型分子探