毒物分析基础法医毒物分析

1、Forensic Toxicological Analysis第二章第二章 毒物分析基础毒物分析基础 第一节第一节 检验材料及分类检验材料及分类 法医毒物分析检材可大致分为：法医毒物分析检材可大致分为：体外检材体外检材体内检材体内检材 一、体外检材一、体外检材体外检材是指未经人体消化吸收的检验材料。体外检材是指未经人体消化吸收的检验材料。包括：包括：1.侦查所得或现场搜集的可疑物侦查所得或现场搜集的可疑物 2.吞服不久的呕吐物或洗胃液吞服不久的呕吐物或洗胃液 3.急死的胃内容（其中尚有未被消化吸收的急死的胃内容（其中尚有未被消化吸收的药毒物）药毒物）特点：特点：体外检材中常尚有原形药毒物存在。

2、体外检材中常尚有原形药毒物存在。体外检材一般不能作为鉴定中毒的直接依据。体外检材一般不能作为鉴定中毒的直接依据。注意：注意： 用来作为对照参比而采集的一些检材有别于体外检用来作为对照参比而采集的一些检材有别于体外检材，应称之为对照检材或参比检材。材，应称之为对照检材或参比检材。二、 体内检材 体内检材指取自活体或尸体的检验材料。体内检材指取自活体或尸体的检验材料。 包括：包括：1.尿、血、唾液和其他体液尿、血、唾液和其他体液 2.各种内脏、毛发、肌肉、皮肤、骨骼等组织各种内脏、毛发、肌肉、皮肤、骨骼等组织 3.取自已埋尸体的组织或腐泥等。取自已埋尸体的组织或腐泥等。 特点：特点：体内检材中一般

3、已无保持原有形态或性状的药毒物体内检材中一般已无保持原有形态或性状的药毒物存在，经代谢后成为其他化合状态，但也有原体药毒物存在。存在，经代谢后成为其他化合状态，但也有原体药毒物存在。药毒物或代谢产物在不同组织或体液中的量可有很大差别。药毒物或代谢产物在不同组织或体液中的量可有很大差别。 三、体内检材与体外检材的比较体外检材体外检材体内检材体内检材定义定义体外，未经体内吸收、分布体外，未经体内吸收、分布和代谢和代谢体内，经体内吸收、分布体内，经体内吸收、分布和代谢和代谢类别类别种类多而杂种类多而杂种类相对固定种类相对固定数量数量视情形而异视情形而异相差不大相差不大毒物毒物 性状性状大多具有药毒物

4、原体大多具有药毒物原体无原有表观性状，甚至转无原有表观性状，甚至转化为代谢物化为代谢物分布分布有的均匀，有的不均匀有的均匀，有的不均匀在某一检材内分布相对均在某一检材内分布相对均匀匀毒物含量毒物含量相对较高，但不能反映总量相对较高，但不能反映总量含量较低，但可反映体内含量较低，但可反映体内总量总量检验结果意检验结果意义义一般不能作为鉴定中毒的直一般不能作为鉴定中毒的直接依据接依据一般作为鉴定中毒的直接一般作为鉴定中毒的直接依据依据第二节第二节 检材处理检材处理 一、检材处置一、检材处置1、称量及标记、称量及标记J每一检材都必须称量并加标签标记每一检材都必须称量并加标签标记J实验过程中的留存物、

5、废弃物及供试品等都实验过程中的留存物、废弃物及供试品等都应标记，检验完全结束才能丢弃。应标记，检验完全结束才能丢弃。2 2、留样、选择及取用、留样、选择及取用保留样品量一般不得少于送验检材量的三分之一。不同检材不能随意混合。分取检材应能以局部检验结果代表全部，分取部分就其外观状态、组成情况、均匀程度等尽可能与同一检材的原有性状相同。依据分析检验方法的需要（如灵敏度、检测限），尽量节省检材。优先选择原则：疑点最大、可能得到线索最多、估计含量较多、检验较易着手、检材量最多。二、检材二、检材分离净化分离净化 （一）目的：纯化（二）基本原理 1、利用形态分离 适于某些体外检材，采取分拣法。2、根据理化

6、性质分离、根据理化性质分离利用比重不同利用比重不同 1）分子或颗粒大小差异分子或颗粒大小差异2）挥发性能不同挥发性能不同3）溶解性能差异溶解性能差异4）化学性质不同化学性质不同5）分子被吸附性能差异分子被吸附性能差异6）离心、分液器离心、分液器方式过滤、离心、超滤膜、过滤、离心、超滤膜、透析膜、分子筛、大透析膜、分子筛、大孔树脂等孔树脂等水蒸汽蒸馏、解热水蒸汽蒸馏、解热挥发等挥发等沉淀、液液萃取或直沉淀、液液萃取或直接萃取接萃取缀合物水解、酶解；缀合物水解、酶解；金属毒物硝化；沉淀金属毒物硝化；沉淀蛋白等蛋白等固相萃取固相萃取检材处理的基本步骤检材处理的基本步骤分离1使待测物使待测物与大多数与

7、大多数杂质分开杂质分开2分离后进分离后进一步去除一步去除干扰物干扰物净化3使分散在使分散在大体积的大体积的待测物分待测物分散在小体散在小体积中积中富集定容4将待测物溶将待测物溶于一定量的于一定量的准确体积的准确体积的溶液中，便溶液中，便于计量。于计量。综合使用，没有严格区分综合使用，没有严格区分 （三）方（三）方 法法法医毒物分析中常用提取净化方法示意图法医毒物分析中常用提取净化方法示意图毒物合成毒物天然药毒物杀虫药杀鼠药液-液萃取法液-固萃取法（1）气体毒物挥发性毒物顶空法蒸馏法扩散法驱气法（2）金属毒物有机质破坏法等（3）水浸出无机毒物透析法（4）毒物分析中大多数化合物的前处理属于第（毒物

8、分析中大多数化合物的前处理属于第（1）类，）类，其基本操作流程如下：其基本操作流程如下： 预处理 分离、净化衍生化（必要时）浓缩-定容1.预处理预处理检材制备（1）固体固体:粉末粉末组织组织:匀浆匀浆碱性毒物碱性毒物： pHpKa 1-2；酸性毒物酸性毒物: pHpKa 1-2；不稳定化合物不稳定化合物: 缓冲液缓冲液调整pH值加入蛋白质沉淀剂或者加热，透析，超滤 去除蛋白质 结合物解离酸水解酸水解酶水解酶水解（2）（3）（4）分子量较大的酸性阴离子（在酸侧沉淀）：分子量较大的酸性阴离子（在酸侧沉淀）： 钨酸、磷钨酸、三氯醋酸、高氯酸等钨酸、磷钨酸、三氯醋酸、高氯酸等 钨酸适于酸中性毒物不适于

9、生物碱钨酸适于酸中性毒物不适于生物碱重金属盐（在碱侧沉淀）重金属盐（在碱侧沉淀）高浓度中性盐（脱水盐析）硫酸铵只能用于高浓度中性盐（脱水盐析）硫酸铵只能用于碱性毒物不能用于酸中性毒物碱性毒物不能用于酸中性毒物有机溶剂（变性沉淀）：适于新鲜检材有机溶剂（变性沉淀）：适于新鲜检材常用蛋白质沉淀剂：结合物的解离：结合物的解离： 适于蛋白结合率较高或其它结合度高的药毒适于蛋白结合率较高或其它结合度高的药毒物。物。 酸水解：酸水解：药物易分解药物易分解合适酸碱度、温度、水解时间合适酸碱度、温度、水解时间 酶水解：酶水解：药物较稳定药物较稳定合适酸碱度、室温（体温）合适酸碱度、室温（体温）-葡糖醛酸苷酶、

10、硫酸脂酶等葡糖醛酸苷酶、硫酸脂酶等水解与酶解的比较水解与酶解的比较OOONCH3OOHOHOHOHO6-acetyl-morphine-3-glucuronideCCH3O水解OHOOHNCH3OOONCH3OOHOHOHOHO6-acetyl-morphine-3-glucuronideCCH3O酶解CCH3OOHOONCH3morphine6-acetyl-morphine原理：利用待测物在互不相溶的两种溶剂之中的溶解度 差异，使待测物从一种溶剂转移至另一种溶剂中（1 1）分配比（distribution coefficient)distribution coefficient)和萃取效率

11、分配比：D=CD=C0 0/C/CA A D D与溶质、溶剂、温度、溶质存在状态（浓度）有关 萃取率：fn=1-VAn/(VA+DV0)n萃取原则：少量多次2.2.液液萃取( (liquid-liquid extraction,LLE)liquid-liquid extraction,LLE)水相：药毒物转移到水相并以有利萃取形式存在（pHpH） 注意需先沉淀蛋白、除油脂、调节酸碱度有机相：沸点不高的溶解度大的单一或混合溶剂 萃取方式： 一次，多次或连续萃取 破乳：静置、盐析、加破乳剂、适当加热、高速离心 萃取液：脱水，无水硫酸钠 （2 2）萃取方法：先制成水溶液再萃取）萃取方法：先制成水溶液

12、再萃取（3 3）改良）改良StatsStats一一OttoOtto法法 改良改良StatsStats一一OttoOtto法法优点：优点：系统分析（方向不明，目前常用于开棺检材）系统分析（方向不明，目前常用于开棺检材）缺点：缺点：检材用量大、过程繁琐、回收率低检材用量大、过程繁琐、回收率低改进：改进：以此为基础的各种改良法以此为基础的各种改良法注意：注意：分子量大的碱性物质在酸性下有可能分子量大的碱性物质在酸性下有可能 形成离子对，在氯仿中有一定溶解度，形成离子对，在氯仿中有一定溶解度， 不宜用氯仿萃取不宜用氯仿萃取 3.3.固相萃取固相萃取原理：原理：利用待测物与杂质固定相和洗脱液利用待测物与

13、杂质固定相和洗脱液之间吸附、分配、分子大小差异等进行之间吸附、分配、分子大小差异等进行分离分离类型：类型：正相、反相、离子交换等正相、反相、离子交换等（或液固萃取，liquid-solid extraction） （solid phase extraction,SPE)（1）正相液固萃取）正相液固萃取机理：固定相极性大于洗脱液机理：固定相极性大于洗脱液固定相：常用硅胶，键合极性丙氰基、二醇基、丙氨基固定相：常用硅胶，键合极性丙氰基、二醇基、丙氨基（2） 反相液固萃取反相液固萃取机理：固定相极性小于洗脱液机理：固定相极性小于洗脱液固定相：常用硅胶，键合非或弱极性的固定相：常用硅胶，键合非或弱极性

14、的C Cl8 l8 、C C8 8、苯基等苯基等（3）离子交换固相萃取）离子交换固相萃取机理：易带电荷待测物质与固定相形成离子对机理：易带电荷待测物质与固定相形成离子对类型：类型： 阳离子阳离子 阴离子阴离子 磺酸基团磺酸基团 季铵盐季铵盐反相萃取基本步骤：反相萃取基本步骤：（1 1）柱活化：水，甲醇洗涤）柱活化：水，甲醇洗涤（2 2）待测样品处理：调节）待测样品处理：调节pH,pH,去颗粒性物质去颗粒性物质 （D D1010-3-3）（3 3）样品过柱：待测物被保留样品过柱：待测物被保留（4 4）洗涤）洗涤: :洗弃杂质洗弃杂质（5 5）洗脱）洗脱: :有机溶剂洗脱出待测物有机溶剂洗脱出待测

15、物,(,(D10D10-3-3)固相萃取装置固相萃取装置加压负压常见操作方式：常见操作方式：待测物随洗脱液洗脱，杂质保留，如柱层析净化。杂质随清洗液被清洗，待测物保留，待测物再用洗脱液洗脱，如反相萃取。杂质和待测物均保留，待测物再用选择性洗脱液洗脱。 固相萃取优点无需大量溶剂简便不易乳化缺点价格高组织样本易堵塞固定相 萃取针萃取针 插入插入水溶液（尿、血清）水溶液（尿、血清） 直接进气相色谱直接进气相色谱SPME技术于技术于1990年由加拿大年由加拿大Waterlop 大学大学Pawliszyn首创，首创，被称为样品处理技术上的一次革命，集采样、萃取、浓缩、被称为样品处理技术上的一次革命，集采

16、样、萃取、浓缩、进样于一体，实现了真正意义上的无溶剂萃取技术。进样于一体，实现了真正意义上的无溶剂萃取技术。4.4.固相微萃取（solid phase micro extration,SPME)solid phase micro extration,SPME)固相微萃取固相微萃取(SPME) 特点特点简单：操作方便，只需按动手柄。 快速：可以节省样品预处理的70%时间。 经济：无需溶剂及注射器，每个萃取头可以反复使用50次以上。（最多达200次左右） 无毒害：由于无需溶剂，使操作人员的工作环境得到改善，同时使实验室排出的毒液减低到最小量，为我们生活的环境作出贡献。 适用性强：可以随身携带，现场

17、采样，并可在任何型号的GC（或HPLC）仪器上直接进样。SPME组成组成SPME装置由两部分构成，手柄（Holder）和萃取头（Fiber）状似一支色谱注射器。 手柄：手柄：用于按装萃取头，可永久使用。用于按装萃取头，可永久使用。萃取头：萃取头：是一根涂不同色谱固定相或吸附剂的熔融石英纤维，接不锈是一根涂不同色谱固定相或吸附剂的熔融石英纤维，接不锈钢丝，外套细的不锈钢针管（保护石英纤维不被折断及进样），纤维钢丝，外套细的不锈钢针管（保护石英纤维不被折断及进样），纤维头可在针管内伸缩。头可在针管内伸缩。 原理原理 当被分析物在萃取头与萃取体系之间达到平衡，分析物与萃取头之间有一分配系数K，吸附于

18、萃取头上分析物的量（N）与萃取体系中分析物的初始浓度（C0）、萃取头体积Vf 有如下关系： N=KVf C0 其中K值取决于萃取头一定的固定相类型、分析物的性质，Vf 为常数，因此N与C0之间存在线性关系。这是SPME的定量基础。SPME操作步骤操作步骤 样品萃取样品萃取 ：1. 1. 将将SPMESPME针管穿透样品瓶隔垫，针管穿透样品瓶隔垫，插入瓶中。插入瓶中。2. 2. 推手柄杆使纤维头伸出针管，推手柄杆使纤维头伸出针管，纤维头可以浸入水溶液中（浸纤维头可以浸入水溶液中（浸入方式）或置于样品上部空间入方式）或置于样品上部空间（顶空方式），萃取时间大约（顶空方式），萃取时间大约2-302-

19、30分钟。分钟。3. 3. 缩回纤维头，然后将针管退缩回纤维头，然后将针管退出样品瓶。出样品瓶。SPME-GC实验过程实验过程三、其他前处理技术三、其他前处理技术（一）化学衍生化技术气相衍生化目的：增加挥发性增加挥发性加强热稳定性加强热稳定性改善色谱行为改善色谱行为提高灵敏度、提高灵敏度、加强选择性加强选择性衍生化目的：适应分析检测的需要液相衍生化目的：提高灵敏度提高灵敏度改善色谱行为改善色谱行为衍生试剂要求： 反应迅速，条件易实现反应迅速，条件易实现 反应定量进行反应定量进行反应副反应少，效率高反应副反应少，效率高过量衍生试剂易与待测物衍生产物分离过量衍生试剂易与待测物衍生产物分离衍生试剂易

20、获得衍生试剂易获得衍生化方式：气相：柱前、柱上气相：柱前、柱上液相：柱前、柱后液相：柱前、柱后（1 1）硅烷化反应）硅烷化反应 -OH -O-SiR3 -COOH -COO-SiR3 -SH + R3Si-X -S-SiR3 -NH2 -NH-SiR3 -NH =N-SiR3 最常用衍生化试剂：BSTFA、MSTFA1.气相色谱中的常用衍生化方法（2 2）酰化反应）酰化反应 适用对象：适用对象： -OH、 -SH 、-NH2 酸酐法：酸酐法：酸酐（吡啶或四氢呋喃溶剂）卤代酰基法卤代酰基法：乙酰氯，苯甲酰氯，三氟乙酸酐，七氟丁酸酐，三氟乙酰咪唑，和七氟丁酰咪唑等 （3 3）酯化反应）酯化反应 适

21、用化合物：-COOH方法：重氮烷烃法，卤化硼催化法，氢氧化铵盐分解法和无机酸催化法。RCOOH+CH2N2RCOOCH3+N2RCOOH+CH3OHRCOOCH3+H2ORCOOH+(CH3)4NOH RCOON(CH3)4+H2ORCOOH+CH3OHRCOOCH3+H2O （4 4）烷基化反应）烷基化反应 2 高效液相中的常用衍生化方法高效液相中的常用衍生化方法 -NH-NH2 2，-NH -NH 对硝基苯对硝基苯甲酰氯甲酰氯对甲基苯对甲基苯磺酰氯磺酰氯异硫氰酸异硫氰酸苯酯苯酯2 2, ,4-4-二硝二硝基氟苯基氟苯-COOH -COOH 对溴代苯甲对溴代苯甲酰甲基溴酰甲基溴萘酰甲基萘酰甲

22、基溴溴-OH-OH2 2, ,5-5-二硝二硝基甲酰氯基甲酰氯-CHO-CHO，-C=O-C=O2 2, ,4-4-二硝二硝基苯肼基苯肼（1）紫外-可见衍生化（2）荧光衍生化）荧光衍生化 衍生化试剂有丹酰氯，荧光胺，衍生化试剂有丹酰氯，荧光胺，芴代甲氧苯酰氯，吡哆醛及香豆素芴代甲氧苯酰氯，吡哆醛及香豆素等。等。历史：历史：snyder，1970年提出并使用适用仪器：适用仪器：高效液相色谱 气相色谱原理：原理：色谱柱一般分为预处理柱（也称富集柱） 和分析柱。通过阀件实现柱的切换，使样 品先在预柱上进行痕量富集，并除去大量 杂质，然后进入分析柱进行分离分析。优点：优点：在线处理样本、速度快、操作简

23、单（二）柱切换技术第三节第三节 定性与定量定性与定量 1、 定性分析 定性分析即确证检材中是否含有某定性分析即确证检材中是否含有某种或某几种药毒物，通常亦称检识或检出。种或某几种药毒物，通常亦称检识或检出。检出对象也包括药毒物在体内的代谢物，有检出对象也包括药毒物在体内的代谢物，有时也包括一些需要确证的非毒性化学物品。时也包括一些需要确证的非毒性化学物品。 定性分析的关键是检验结果的可靠性，定性分析的关键是检验结果的可靠性，因此应选择合适的方法，反复验证。检验中因此应选择合适的方法，反复验证。检验中应避免因干扰作用而出现的假阳性或假阴性应避免因干扰作用而出现的假阳性或假阴性结果。结果。 2、定

24、量分析 定量分析即确定某种或某几种药毒物在检材的定量分析即确定某种或某几种药毒物在检材的含量，通常也称之为含量测定。含量，通常也称之为含量测定。 定量分析的前提是必须先要明确和肯定是何种定量分析的前提是必须先要明确和肯定是何种药毒物，也就是先定性分析，然后才进行定量分析。药毒物，也就是先定性分析，然后才进行定量分析。并非所有的毒物分析都需含量测定。一般为了必须并非所有的毒物分析都需含量测定。一般为了必须验证是否为正常人体组分或药物是否超剂量、以及验证是否为正常人体组分或药物是否超剂量、以及用含量来区分事件的性质、当事人法律责任等时，用含量来区分事件的性质、当事人法律责任等时，才根据需要进行定量

25、分析。才根据需要进行定量分析。常用计量单位：常用计量单位： %； mg/100mL、mg/g、g/g、ng/g、pg/g；mg/mL、g/mL、ng/mL、pg/mL等。外标法：配置一系列已知浓度的标准物或对照品溶液， 制定响应值与浓度之间对应关系的工作曲线， 由样品中待测物的响应值反求出其浓度。内标法：由已知浓度内标物和标准物与其对应响应值之 间的比例关系，通过测定样品中已知浓度内标 物和未知浓度待测物的响应值，计算出待测物 浓度。定量结果的解释：定量结果的解释： 与正常值相比较 与治疗浓度相比较，结合临床症状与尸解特征 慎重使用相关数据库（仅供参考）定量分析方法：1.常见毒（药）物临床治疗

26、血液浓度、中毒例血液常见毒（药）物临床治疗血液浓度、中毒例血液浓度、中毒死亡血液浓度以及人体内半衰期浓度、中毒死亡血液浓度以及人体内半衰期毒（药）物中毒鉴定理论与实践典型案例分析毒（药）物中毒鉴定理论与实践典型案例分析 司法部司法鉴定科学技术研究所司法部司法鉴定科学技术研究所2.Drug and chemical blood-lever data 2001 Charles L. Winke,et al.Forensic Science International 122 (2001),107-123相关数据库第四节第四节 分析方法类别分析方法类别 一、形态学方法 主要是适用于体外检材的辨认，包

27、主要是适用于体外检材的辨认，包括形状、大小、色泽、气味、剂量、浓度、括形状、大小、色泽、气味、剂量、浓度、包装等方面的特征，有时尚需借助放大镜包装等方面的特征，有时尚需借助放大镜或显微镜来观察。或显微镜来观察。（1）急性毒性实验急性毒性实验将检验材料喂饲或灌注小动物，观察动物是将检验材料喂饲或灌注小动物，观察动物是否有明显的中毒反应或于短时间内死亡。适用于否有明显的中毒反应或于短时间内死亡。适用于方向不明，检材充足的情况。方向不明，检材充足的情况。（2）毒效实验）毒效实验利用某些药毒物具有易于观察的特殊毒性效利用某些药毒物具有易于观察的特殊毒性效应来进行实验的方法。应来进行实验的方法。二、动物

28、实验方法二、动物实验方法 利用毒物的毒性作用而采用动物进行的简利用毒物的毒性作用而采用动物进行的简易实验方法。易实验方法。三三.免疫法免疫法（一）基本概念1.1. 抗体：抗体：分子结构上具有能专一识别药物的特分子结构上具有能专一识别药物的特征性基团或结构的某种特殊蛋白质。征性基团或结构的某种特殊蛋白质。2.2. 标记毒药物：标记毒药物：指加有标记的被检测物对照品指加有标记的被检测物对照品或一定量性质与被测毒药物相同的加有标记或一定量性质与被测毒药物相同的加有标记的物质。的物质。3.3. 非标记毒药物：非标记毒药物：即为毒药物标准品或待检药即为毒药物标准品或待检药毒物。毒物。（二）基本原理（三）

29、方法类别毒物分析常用胶体免疫金法检测试剂盒：原理：原理：采用高度特异性的抗原抗体反应及免疫层采用高度特异性的抗原抗体反应及免疫层析技术，使单克隆抗体竞争结合被检药物偶联物和析技术，使单克隆抗体竞争结合被检药物偶联物和样品中可能含有药物。适于尿、血清。样品中可能含有药物。适于尿、血清。操作示意图操作示意图（四）交叉免疫反应 与待测毒物结构相近的类似毒物或化与待测毒物结构相近的类似毒物或化合物，在毒物同抗体的结合反应中常会引合物，在毒物同抗体的结合反应中常会引起干扰而产生的非专一性结合反应，称为起干扰而产生的非专一性结合反应，称为交叉免疫反应。交叉免疫反应。 试剂盒在应用前必须先作交叉免疫实试剂盒

30、在应用前必须先作交叉免疫实验，评价其特异性。验，评价其特异性。（一）物理常数的测定 测熔点、沸点、折光率等，但测定物理常数测熔点、沸点、折光率等，但测定物理常数只对纯物质的定性具有意义。只对纯物质的定性具有意义。四.理化分析法（二）微量化学方法（二）微量化学方法 利用化学反应的微量检验方法。 1.微量显色反应微量显色反应加入试剂观察颜色变化，判断是否存在被检物或根据颜色的深加入试剂观察颜色变化，判断是否存在被检物或根据颜色的深浅程度，大致测量被检物的量。浅程度，大致测量被检物的量。2.微量沉淀反应与显微结晶实验微量沉淀反应与显微结晶实验沉淀反应即加入沉淀剂生成难溶性化合物从溶液中析出的化学沉淀

31、反应即加入沉淀剂生成难溶性化合物从溶液中析出的化学反应。有些沉淀及其他方法得到的结晶物质，可在显微镜下观察到反应。有些沉淀及其他方法得到的结晶物质，可在显微镜下观察到结晶的形状和色泽，称为显微结晶实验。结晶的形状和色泽，称为显微结晶实验。五五.仪器分析方法仪器分析方法目前仪器分析已被广泛应用于各领域中的研目前仪器分析已被广泛应用于各领域中的研究工作和实践工作。法医毒物分析应用较多的仪究工作和实践工作。法医毒物分析应用较多的仪器分析法是光谱分析和色谱分析、色质联用分析器分析法是光谱分析和色谱分析、色质联用分析等。等。 使用仪器分析方法多数情况下，须检材处理使用仪器分析方法多数情况下，须检材处理除

32、去杂质，制备成检液后才能进行仪器检测。除去杂质，制备成检液后才能进行仪器检测。目前也有直接用检材进行分析的药物分析仪，目前也有直接用检材进行分析的药物分析仪，BIO-RADBIO-RAD公司的公司的REMEDYREMEDY系统，分析检材仅适合于系统，分析检材仅适合于尿液、血清等。尿液、血清等。第五节第五节 各类分析方法的效用各类分析方法的效用 一、分类效用 根据实验结果判别被检测物的类别的试根据实验结果判别被检测物的类别的试验效应，所用方法亦称类别实验。毒物分析验效应，所用方法亦称类别实验。毒物分析中所应用的实验方法绝大多数是具有分类效中所应用的实验方法绝大多数是具有分类效用的。检材根据分类效

33、用经过处理后的检液，用的。检材根据分类效用经过处理后的检液，进行检验时还需用类别实验，根据其使用的进行检验时还需用类别实验，根据其使用的场合或目的不同又可分为预实验和筛选实验。场合或目的不同又可分为预实验和筛选实验。（一）预实验：（一）预实验： 当检验方向不明时，用一些简单的试验当检验方向不明时，用一些简单的试验来探索是否具有某些类别的药毒物存在的可来探索是否具有某些类别的药毒物存在的可能性。能性。（二）筛选实验（二）筛选实验筛选实验是在有比较方向的情况下应用筛选实验是在有比较方向的情况下应用的类别实验，通过阴性结果排除而进一步缩的类别实验，通过阴性结果排除而进一步缩小检测范围。小检测范围。

34、二、确证效用 根据实验结果可以准确无误地判断是否含有某药毒物的试验效果称确证效用，具有确证效用的试验称为确证实验。（一）专属实验：是被检物特有的属性而可确定决不可能是另一种物质的检验方法。（二）鉴别实验：鉴别试验是指从形状很相似的物品或性质相近的物质中区分是哪一种的试验。第六节第六节 毒物分析可靠性控制毒物分析可靠性控制 采取措施保证分析工作的可靠性对毒物分析是非常重要的，尤其是在采取措施保证分析工作的可靠性对毒物分析是非常重要的，尤其是在建立新方法时，更应注重对方法效能的验证。建立新方法时，更应注重对方法效能的验证。 一、验证分析方法效能的主要项目一、验证分析方法效能的主要项目（一）纯度和回

35、收率（收得率）（一）纯度和回收率（收得率） 纯度表明经分离净化后检液中杂质的纯度表明经分离净化后检液中杂质的含量多少，杂质含量越低，则纯度越高。纯含量多少，杂质含量越低，则纯度越高。纯度越高，对检测有利，但会损失回收率。法度越高，对检测有利，但会损失回收率。法医毒物分析中，不宜过分追求高纯度。医毒物分析中，不宜过分追求高纯度。 回收率是指经分离净化后所测得含量与检回收率是指经分离净化后所测得含量与检材中原有的实际含量之间的比值。材中原有的实际含量之间的比值。1. 认证准确性：检材中确实存在，证实不是别的物质，而且必须是检材中原本存在的。2. 测值准确性：包括精密度和准确度。准确度是多次测得值与

36、真实值之间相互接近的程度。精密度是多次测得值之间相互接近的程度，精密度常以多次测量的相对标准偏差（RSD）表示，其值越小，精密度越高，重现性也越好。1n)XX(SD2iXSDRSD （二）方法的准确性评价指标：灵敏度与检测限 灵敏度灵敏度是响应值随被测物含量变化而变是响应值随被测物含量变化而变化，二者变量之间比值。其值越大，分析化，二者变量之间比值。其值越大，分析方法越灵敏。方法越灵敏。检测限检测限是达到一定信噪比是达到一定信噪比（S/NS/N）时，能检出物质的最小量或最低时，能检出物质的最小量或最低浓度。浓度。一般为一般为S/N=3S/N=3。（三）分析方法的灵敏性（四）线性与检测范围（四）

37、线性与检测范围 定性检测和定量分析有其适宜的浓度检定性检测和定量分析有其适宜的浓度检测范围，在定量检测时也常称之为线性范围。测范围，在定量检测时也常称之为线性范围。当浓度超出范围时，定性检测的认定不能明当浓度超出范围时，定性检测的认定不能明确；定量测定时，则线性关系受影响而使测确；定量测定时，则线性关系受影响而使测定结果不准确。定结果不准确。一般要求回归线包括一般要求回归线包括5 57 7个个浓度，线性相关系数浓度，线性相关系数不低于不低于0.990.99。（五）专属性（五）专属性 专属性和方法的准确性是分析方法专属性和方法的准确性是分析方法可靠性的主要指标。可靠性的主要指标。（六）再现性（六

38、）再现性 相同分析方法在不同实验室操作，相同分析方法在不同实验室操作，分析结果的稳定性。分析结果的稳定性。 二、可靠性论证的实施方法二、可靠性论证的实施方法（一）模拟实验（一）模拟实验1.动物模拟试验动物模拟试验 选用合适的动物，以适量药毒物使之中毒，选用合适的动物，以适量药毒物使之中毒，研究其在体内的吸收分布和代谢等情况，对研究其在体内的吸收分布和代谢等情况，对检验方法予以研究与验证。检验方法予以研究与验证。2.检材模拟试验检材模拟试验 选用与实际检材相同或基本相近的材料选用与实际检材相同或基本相近的材料为模拟检材，对检验方法进行验证的试验为模拟检材，对检验方法进行验证的试验。不加入已知欲检

39、测物，其他所用检验材料、试不加入已知欲检测物，其他所用检验材料、试剂、器皿、分析方法等与被检物的检验完全相同，剂、器皿、分析方法等与被检物的检验完全相同，也称空白对照试验。也称空白对照试验。（1）单纯空白实验）单纯空白实验 ：指不用检材的空白试验。指不用检材的空白试验。单纯验证试剂和操作的可靠性。单纯验证试剂和操作的可靠性。（2）模拟空白实验）模拟空白实验 ：用模拟材料作检材的空用模拟材料作检材的空白试验。主要用于验证是否有来自检材的干扰因素白试验。主要用于验证是否有来自检材的干扰因素或存在可设法排除的干扰。或存在可设法排除的干扰。（3）干扰物空白实验）干扰物空白实验 ：在上述两种空白试验在上

40、述两种空白试验中预先加入性质与欲检测物相似或可能产生干扰的中预先加入性质与欲检测物相似或可能产生干扰的物质，以验证检验方法能否区分添加物与欲检测物。物质，以验证检验方法能否区分添加物与欲检测物。 （二）空白试验 （三）已知对照实验 在上述空白试验中预先加入一定量欲检测物在上述空白试验中预先加入一定量欲检测物的已知品后再实行验证的试验。的已知品后再实行验证的试验。单纯已知品实验单纯已知品实验已知品模拟检材实验已知品模拟检材实验干扰物存在的已知品模拟检材实验干扰物存在的已知品模拟检材实验 1.定性验证定性验证 加入已知品观察试验结果出现应有的加入已知品观察试验结果出现应有的特征性现象以验证检验的可

41、靠性，逐步减少特征性现象以验证检验的可靠性，逐步减少量直至不出现识别特征以测知检验的检测限。量直至不出现识别特征以测知检验的检测限。 2.定量验证定量验证 以空白溶剂为零，再将已知品溶液制以空白溶剂为零，再将已知品溶液制备成系列溶液进行测定，考察测得值与已知备成系列溶液进行测定，考察测得值与已知量之间的函数关系是否适于测定，及确定适量之间的函数关系是否适于测定，及确定适用的检测范围和检测限。用的检测范围和检测限。 3.回收实验 在模拟材料中按适当比例加入一定量在模拟材料中按适当比例加入一定量欲检测物的已知品，按预定的方法进行处理欲检测物的已知品，按预定的方法进行处理并测定，测得值与加入量的比值

42、即为回收率。并测定，测得值与加入量的比值即为回收率。 对于毒物分析，体内检材中药毒物的对于毒物分析，体内检材中药毒物的含量较低，不易得到很高的精密度和回收率，含量较低，不易得到很高的精密度和回收率，一般而言，回收率应不低于一般而言，回收率应不低于60%60%，相对标准，相对标准偏差不超过偏差不超过10%10%。（四）随行标准参比法（四）随行标准参比法 选择一种适合的纯化合物，添加于实际检材中，选择一种适合的纯化合物，添加于实际检材中，与被检物一起经过整个处理过程及检验，同被分别与被检物一起经过整个处理过程及检验，同被分别检出的方法称为随行参比法。检出的方法称为随行参比法。 根据参比物的回收情况

43、可观测实际检测方法的根据参比物的回收情况可观测实际检测方法的回收率。如参比物的测得值可用作被测物测定值的回收率。如参比物的测得值可用作被测物测定值的参比依据时，参比物具有检材内部标准的作用，称参比依据时，参比物具有检材内部标准的作用，称为内标。为内标。 我国法医毒物分析实验室的现状：我国法医毒物分析实验室的现状： 操作程序尚未规范化。操作程序尚未规范化。 技术方法尚未标准化。技术方法尚未标准化。 鉴定质量控制体系尚未建立，不同实验鉴定质量控制体系尚未建立，不同实验 室及不同操作人员之间操作随意性大室及不同操作人员之间操作随意性大。三、毒物分析实验室规范管理和质量控制1.1.专家、技术人员资格认证专家、技术人员资格认证2.2.实验室认证实验室认证毒物分析实验室规范管理和质量控制人员人员1设施与环境设施与环境2仪器与设备仪器与设备3标准操作步骤标准操作步骤41. 管理人员管理人员2.鉴定人员鉴定人员3.技术员技术员1.监测、控制和记录环境条件监测、控制和记录环境条件2.不相容活动区域隔离不相容活动区域隔离3.检测区域进入和使用控制检测区域进入