方法学验证方案

1、*药业股份有限公司企业标准*含量测定方法学确认第1页共14页*含量测定方法学确认方案日期：2016年1月*药业股份有限公司企业标准*含量测定方法学确认第2页共14页验证方案审查与批准您下面的签字表明您已审阅此份验证方案并同意实施。姓名职务签名日期起草人姓名职务签名日期审核人审核人姓名职务签名日期批准人*药业股份有限公司企业标准*含量测定方法学确认第3页共14页目 录1. 目的42. 范围43. 验证机构与职责44. 定义55. 参考文件56. 风险因素分析57. 验证准备68. 检测方法的描述69. 验证实施810. 偏差与变更 1311. 确认结果评定与结论 1412. 确认周期1413.

2、附录目录 14*药业股份有限公司企业标准*含量测定方法学确认第4页共14页1目的对苦参膜中的含量测定检测方法进行确认，确保方法的可行性，以便为有效控制苦参 膜的含量提供依据。2范围本方案适用于*药业股份有限公司齐墩果酸片含量测定方法的确认。3验证机构与职责3.1验证小组成员姓名所在部门在验证中担任职务签名日期组长组员组员3.2职责321验证小组组长职责3.2.1.1 保证确认方案及各种检查表的起草。3.2.1.2 保证在执行前完成对确认方案及各种检查表的审核和批准。3.2.1.3 负责对确认小组成员进行本方案的培训。3.2.1.4 保证完全按照确认方案实施。3.2.1.5 确保能及时发现偏差，

3、并按照已经达成一致的偏差处理方法对其进行记录、纠 正、调查和最终确认。3.2.1.6 确保确认报告的生成、审核和批准。3.2.2 QA职责3.2.2.1 执行前完成对确认方案及各种检查表的审核。3.2.2.2 负责确认过程的监控和检查，保证确认方案的实施，参与确认结果评价。3.2.2.3 参与确认偏差的调查、处理、和评估。3.2.2.4 确认过程中，如有变更，保证按变更处理程序执行。*药业股份有限公司企业标准*含量测定方法学确认第5页共14页323其它成员职责323.1 执行前确认确认方案已批准，并经过培训。323.2 按确认方案实施确认，收集、整理确认数据，完成确认记录和报告3.2.3.3

4、参与确认偏差的调查和处理，确认通过偏差修订和解决方案。3.2.3.4 确认确认过程中的变更在实施前已经批准。4定义4.1线性：指在设计的范围内，测试结果与试样中被测物浓度直接呈正比关系的程度。4.2准确度：指用该方法测定的结果与真实值或参考值接近的程度，一般用回收率（%表示。4.3重复性：再规定范围内，取同一浓度的供试品，用6个测定结果进行评价。4.4中间精密度：在同一个实验室，不同时间由不同分析人员或用不同设备测定结果之间 的精密度，称为中间精密度。5参考文件5.1 药品生产质量管理规范（2010年修订版）5.2 药品生产验证指南5.3 中国药典（2015年版）二部5.4国家药品监督管理局国

5、家药品标准5.5 公司相关文件：5.5.1 苦参膜质量标准及检验规程（）5.5.2 验证管理（）5.5.3 变更控制操作规程（）5.5.4 偏差处理操作程序（）5.5.5 纠正措施与预防措施操作规程（）5.5.6 2016年度验证总计划6风险因素分析*药业股份有限公司企业标准*含量测定方法学确认第6页共14页风险评估将采用失效模式及影响（FMEA的工具来评估和衡量方法参数失效后对产品分 析结果的影响。评估过程将参照公司质量风险管理的要求，风险等级为低、中、高级别的必须给出合理的建议措施，之后再次对建议的风险控制措施进行评估以确保风险的降低， 分析、 评估结果见附录1风险评估表。7 验证准备7.

6、1 确保所有方法SOP是最新版本且经过批准，将检查结果记录在附录2文件检查内。7.2 确认参与验证的人员都经过此方案和相关SOP的培训，和识别所有签字和草签本方案任何数据表的人员。将检查结果记录在附录3培训检查和签名确认内。7.3确认验证过程中用到设备、计量仪器都是经过校验，并在有效期内，将检查结果记录 在附录4确认用仪器/仪表校准检查内。8检测方法的描述8.1 药品与试剂的准备*对照品（中国药品生物制品检定院提供），* （为*药业股份有限公司生产）； 硅钨酸试液、碘化汞钾试液、苦味酸、氯仿、甲醇、浓氨、稀碘化铋钾试液、盐酸液（0.2mol/L ）、氢氧化钠液（1mol/L ）、氢氧化钠滴定液

7、（0.1mol/L ）、硫酸滴定液（0.05mol/L ）、 甲基红示液、磷酸、乙腈、无水乙醇。8.2 仪器分析条件电子天平（FA2014、超声池（KQ-300DE、电热恒温水浴锅（DK-98-1）、高效液相（LC-10ATVP）8.3 检测方法显色鉴别、色谱鉴别、酸碱滴定法、高效液相色谱法8.4 检测操作鉴别显色鉴别：样品连续三批，A、B两位组员各取样品1号、样品2号约0.15g，分置 三支试管中，加水2ml使溶解，分别加硅钨酸试液、碘化汞钾试液及苦味酸试液12滴，分别生成白色、淡黄色及黄色沉淀。*含量测定方法学确认药业股份有限公司企业标准第7页共14页841.2薄层鉴别：样品连续三批，A、

8、B两位组员分别取本品0.1g，加甲醇10ml使溶解， 超声提取15分钟，静置，取上清液作为供试品溶液；另取苦参碱及氧化苦参碱对照品适 量，加甲醇制成每1ml中各含5mg的溶液作为对照品溶液，照薄层色谱法（附录W B）试验， 取上述三种溶液各23卩l，分别点于同一以0.5%羧甲基纤维素钠为黏合剂的硅胶 G薄层板 上，以三氯甲烷-甲醇-浓氨试液（5:060.3 ）为展开剂，展开，取出，晾干，喷以稀碘化 铋钾试液。供试品色谱中，在与对照品色谱相应的位置上，显相同颜色的两个斑点。酸碱滴定法：连续三批样品，两位组员分别取样品1、样品2,各10片，剪碎，取 一片重两份，各精密称定，加氯仿 25ml回流3次

9、，每次1小时，合并提取液，置水浴上挥 干，残渣用0.2mol/L盐酸液5ml使溶解，滤过，滤液置入分液漏斗中，用水10ml分次洗涤容器，洗液并入分液漏斗中，加氯化钠约6g与1mol/L氢氧化钠液5ml,摇匀，用三氯甲烷振摇提取5次（25、20、10、10、10ml）,每次三氯甲烷提取液均用同一饱和氯化钠液 5ml 振摇洗涤，再依次分别通过同一装有无水硫酸钠1g的脱脂棉层滤过。合并三氯甲烷液，精密加硫酸滴定液（0.05mol/L ） 10ml及新沸过的冷水20ml，振摇提取后，分取酸层，氯仿层 再用新沸过的冷水洗涤3次，每次10ml，合并酸液与洗涤液，置水浴上加热，除去残留的 三氯甲烷，放冷至室

10、温，加甲基红指示液2滴，用氢氧化钠滴定液（0.1mol/L ）滴定。每1ml 的硫酸液（0.05mol/L ）相当于 26.44mg 的 GsHHQ。本品每片含总生物碱以*80.0%110.0%。相对偏差（dr%）不得超过0.6%计算公式：V1 C1 V2 C3 T mC002Ci100 00M 100C1 :硫酸滴定液的实际浓度（mol/L）;C2:硫酸滴定液的理论浓度（mol/L）;C3 :氢氧化钠滴定液的实际浓度（mol/L）;C4 :氢氧化钠滴定液的理论浓度（mol/L）;V1:加入硫酸滴定液的体积（ml）;V2 :消耗氢氧化钠滴定液的体积（ml）;T :标示量（26.44mg）;m

11、:该批20片苦参膜的平均重量（g）;*药业股份有限公司企业标准*含量测定方法学确认第8页共14页M :使用苦参膜的量（g）。842 .4 高效液相色谱法-无水乙醇-3%84241色谱条件与系统适用性试验：用氨基键合硅胶为填充剂：以乙腈酸溶液（85:7.5:7.5 ）为流动相；柱温30C，检测波长为220nm流速1.0ml /min,理论塔板数按氧化苦参碱峰计算，应不低于5000。对照品溶液的制备：取*对照品适量，精密称定，置同一量瓶中，加乙腈 -无水乙醇（85:15）制成每1ml含苦参碱0.32mg和氧化苦参碱35卩g的溶液，摇匀，即得。 供试品溶液的制备：取已剪碎的样品约0.6g，精密称定，

12、置具塞锥形瓶中，加浓氨水0.5ml，精密加入三氯甲烷25ml，称定重量，超声处理30分钟，放冷，加三氯甲烷补 足损失重量，滤过，精密吸取续滤液 5ml，水浴上挥干，用乙腈-无水乙醇（85:15）定溶至 25ml量瓶中，摇匀，用0.45卩m滤膜滤过，即得。测定法：分别精密吸取对照品溶液5卩l与供试品溶液510卩l，注入高效液相 色谱仪，测定，即得。本品每片含*不得少于22.0 mg。相对标准偏差不得过2%计算公式: C mg/g样品峰面积对照品浓度对照品平均峰面积样品称量样品平均片重A:对照品进两针的平均峰面积;A1：对照品第一针峰面积;A2：对照品第二针峰面积9验证实施9.1线性实验目的：在设

13、计的范围内，测试结果与试样中被测物浓度直接呈正比关系的程度应符合规定滴定法*药业股份有限公司企业标准*含量测定方法学确认第9页共14页实验过程同一人同时取同一批样品，各10片，剪碎，取一片重样品1、样品2、样品3、样品4、样 品5,各精密称定，加氯仿25ml回流3次，每次1小时，合并提取液，置水浴上挥干，残 渣用0.2mol/L盐酸液5ml使溶解，滤过，滤液置入分液漏斗中，用水10ml分次洗涤容器，洗液并入分液漏斗中，加氯化钠约6g与1mol/L氢氧化钠液5ml,摇匀，用三氯甲烷振摇提取5次（25、20、10、10、10ml）,每次三氯甲烷提取液均用同一饱和氯化钠液5ml振摇洗涤，再依次分别通

14、过同一装有无水硫酸钠1g的脱脂棉层滤过。合并三氯甲烷液，精密加硫酸滴定液（0.05mol/L）10ml及新沸过的冷水20ml，振摇提取后，分取酸层，氯仿层再用新 沸过的冷水洗涤3次，每次10ml，合并酸液与洗涤液，置水浴上加热，除去残留的三氯甲 烷，放冷至室温，加甲基红指示液 2滴，用氢氧化钠滴定液（0.1mol/L）滴定。每1ml的硫 酸液（0.05mol/L ）相当于 26.44mg 的 CsHHQ。本品每片含总生物碱以氧化苦参碱（C15HmNM计，应为标示量的80.0%110.0%。相对 偏差（dr%）不得超过0.6%。9.1.1.2 以样品滴定过程中消耗氢氧化钠的体积为横坐标，以样品含

15、量为纵坐标，绘制回归方程。可接受标准（相关系数dr0.6%）。9.1.1.4 记录：将实验结果记录在*滴定含量测定线性实验记录内，见附录。高效液相9.1.2.1 对照品配制：取* 一瓶精密称取置25ml容量瓶中、*对照品两瓶精密称取置50ml 量瓶中，加乙腈：无水乙醇（85:15）溶解至刻度。分别精密量取氧化苦参碱 0.5ml、苦参 碱5ml;氧化苦参碱1ml、苦参碱10ml;氧化苦参碱2ml、苦参碱20ml，分别置25ml容量 瓶中，加乙腈：无水乙醇（85:15 ）至刻度。既得。样品制备：取已剪碎的样品约0.6g，精密称定，置具塞锥形瓶中，加浓氨水0.5ml，精密加入三氯甲烷25ml，称定重

16、量，超声处理30分钟，放冷，加三氯甲烷补足损 失重量，滤过，精密吸取续滤液 5ml，水浴上挥干，用乙腈-无水乙醇（85:15 ）定溶至25ml 量瓶中，摇匀，用0.45卩m滤膜滤过，即得。测定法：分别精密吸取对照品溶液5卩l与供试品溶液510卩l，注入高效液相色 谱仪，测定，即得。本品每片*，不得少于22.0 mg。9.1.2.4 以对照品的吸取量（峰面积）为横坐标，以样品含量（峰面积）为纵坐标，绘制*药业股份有限公司企业标准*含量测定方法学确认第10页共14页回归方程9.125可接受标准（相关系数RSD2% 。9.126 记录：将实验结果记录在*高效含量测定线性实验记录内，见附录5。9.2重

17、复性实验目的：在规定范围内，取同一批次的样品品，用5个测定结果进行评价，得到的结果 RSD应符合要求。滴定法：921.1 实验过程取同一批样品，10片，剪碎，取一片重样品1、样品2、样品3、样品4、样品5各精密称 定，加氯仿25ml回流3次，每次1小时，合并提取液，置水浴上挥干，残渣用 0.2mol/L 盐酸液5ml使溶解，滤过，滤液置入分液漏斗中，用水10ml分次洗涤容器，洗液并入分液漏斗中，加氯化钠约6g与1mol/L氢氧化钠液5ml,摇匀，用三氯甲烷振摇提取 5次（25、 20、10、10、10ml）,每次三氯甲烷提取液均用同一饱和氯化钠液5ml振摇洗涤，再依次分别通过同一装有无水硫酸钠

18、1g的脱脂棉层滤过。合并三氯甲烷液，精密加硫酸滴定液（0.05mol/L）10ml及新沸过的冷水20ml，振摇提取后，分取酸层，氯仿层再用新沸过的冷 水洗涤3次，每次10ml，合并酸液与洗涤液，置水浴上加热，除去残留的三氯甲烷，放冷 至室温，加甲基红指示液2滴，用氢氧化钠滴定液（0.1mol/L ）滴定。每1ml的硫酸液（0.05mol/L ）相当于 26.44mg 的 CsHmNQ。本品每片含总生物碱以*80.0%110.0%。相对偏差（dr%）不得超过0.6%。可接受标准（相关系数dr0.6%）。9.1.1.3 记录：将实验结果记录在*滴定含量测定重复性实验记录内，见附录5。咼效9.2.2

19、 实验过程9.1.2.1 对照品配制：对照品溶液的制备：取苦参碱、氧化苦参碱对照品母液适量，置同一量瓶中，加乙腈-无水乙醇（85:15 ）制成每1ml含苦参碱0.32mg和氧化苦参碱35卩g的 溶液，摇匀，即得。样品制备：取同一批样品10片，剪碎并分别取样品1、样品2、样品3、样品4、 样品5约0.6g，精密称定，置具塞锥形瓶中，加浓氨水 0.5ml，精密加入三氯甲烷25ml，*药业股份有限公司企业标准*含量测定方法学确认第11页共14页称定重量，超声处理30分钟，放冷，加三氯甲烷补足损失重量，滤过，精密吸取续滤液5ml，水浴上挥干，用乙腈-无水乙醇（85:15）定溶至25ml量瓶中，摇匀，用

20、0.45卩m滤膜 滤过，即得。测定法：分别精密吸取对照品溶液5卩l与供试品溶液510卩l，注入高效液相色 谱仪，测定，即得。本品每片含苦参总碱以苦参碱 （SHmNIO）与氧化苦参碱（Ci5HmNQ）的总 量计，不得少于22.0 mg。可接受标准（相关系数RSD2%。9.1.2.5 记录：将实验结果记录在*高效含量测定重复性实验记录内，见附录59.3 中间精密度实验9.3.1 目的：含量测定中，一个实验室内不同的人、在不同时间（通常是不同天）测定得 到的结果RSD应符合要求。滴定含量931.1 实验过程9.3.1.2 两名实验人员分别在不同时间（通常是不同天）各取同一批号苦参膜10片，精密称定，

21、剪碎，各精密称取本品3份（每份约0.6g ），加氯仿25ml回流3次，每次1小时， 合并提取液，置水浴上挥干，残渣用 0.2mol/L盐酸液5ml使溶解，滤过，滤液置入分液漏 斗中，用水10ml分次洗涤容器，洗液并入分液漏斗中，加氯化钠约6g与1mol/L氢氧化钠液5ml,摇匀，用三氯甲烷振摇提取 5次（25、20、10、10、10ml）,每次三氯甲烷提取液均 用同一饱和氯化钠液5ml振摇洗涤，再依次分别通过同一装有无水硫酸钠1g的脱脂棉层滤过。合并三氯甲烷液，精密加硫酸滴定液（0.05mol/L ） 10ml及新沸过的冷水20ml，振摇提取后，分取酸层，氯仿层再用新沸过的冷水洗涤3次，每次1

22、0ml，合并酸液与洗涤液，置水浴上加热，除去残留的三氯甲烷，放冷至室温，加甲基红指示液2滴，用氢氧化钠滴定液（0.1mol/L ）滴定。每 1ml 的硫酸液（0.05mol/L ）相当于 26.44mg 的 SHmNQ9.3.1.3 可接受标准（同一人实验结果 RSD%2.0%;两人间的RSD%2.0%）记录：将实验结果记录在*滴定含量测定中间精密实验记录内， 见附录5。咼效*药业股份有限公司企业标准*含量测定方法学确认第12页共14页9.321两名实验人员用同一批对照品分别在不同时间（通常是不同天）各取同一批号苦参膜10片，精密称定，剪碎，各精密称取本品3份（每份约0.6g），置具塞锥形瓶中

23、，加浓氨水0.5ml，精密加入三氯甲烷25ml，称定重量，超声处理30分钟，放冷，加三氯甲烷补 足损失重量，滤过，精密吸取续滤液 5ml，水浴上挥干，用乙腈-无水乙醇（85:15）定溶至 25ml量瓶中，摇匀，用0.45卩m滤膜滤过，即得。9.322测定法：分别精密吸取对照品溶液5卩l与供试品溶液510卩l，注入高效液相色 谱仪，测定，即得。本品每片含苦参总碱以苦参碱 （SHmNO）与氧化苦参碱（CsHmMQ）的总 量计，不得少于22.0 mg。9.3.2.3 可接受标准（同一人实验结果 RSD%2.0%;两人间的RSD%2.0%）。记录：将实验结果记录在*高效含量测定中间精密度实验记录内，见

24、附5。9.4 含量测定准确度实验9.4.1 目的：含量测定中，用已确定的方法测定的结果与真实值或参考值接近的程度，一 般用回收率（%表示，得到的结果RSD应符合要求。9.4.2 实验过程精密称取同一已知含量的供试品9份（每份约0.6g ），分别置于圆底烧瓶中，分成三组， 分别向第一组的每一份供试品中加入浓度为（35卩g/ml）的氧化苦参碱对照品2 ml ;向第 二组的每一份供试品中加入浓度为（35卩g/ml ）的氧化苦参碱对照品5ml;向第三组的每一 份供试品中加入浓度为（35卩g/ml）的氧化苦参碱对照品7 ml。加氯仿25ml回流3次，每 次1小时，合并提取液，置水浴上挥干，残渣用 0.2

25、mol/L盐酸液5ml使溶解，滤过，滤液 置入分液漏斗中，用水10ml分次洗涤容器，洗液并入分液漏斗中，加氯化钠约6g与1mol/L氢氧化钠液5ml,摇匀，用三氯甲烷振摇提取 5次（25、20、10、10、10ml）,每次三 氯甲烷提取液均用同一饱和氯化钠液 5ml振摇洗涤，再依次分别通过同一装有无水硫酸钠1g的脱脂棉层滤过。合并三氯甲烷液，精密加硫酸滴定液 （0.05mol/L ） 10ml及新沸过的冷 水20ml，振摇提取后，分取酸层，氯仿层再用新沸过的冷水洗涤 3次，每次10ml，合并酸 液与洗涤液，置水浴上加热，除去残留的三氯甲烷，放冷至室温，加甲基红指示液2滴，用氢氧化钠滴定液（0.

26、1mol/L ）滴定。每1ml的硫酸液（0.05mol/L ）相当于26.44mg的CsHNbQ。*药业股份有限公司企业标准*含量测定方法学确认第13页共14页9.421 测定法将测得的总含量减去供试品中已知含量，计算每组的回收率。9.422 可接受标准（实验结果回收率 98.0%102.0%）。942.3 记录：将实验结果记录在*滴定含量测定准确度实验记录内，见附录 &咼效9.4.3.1 对照品制备：对照品溶液的制备： 取苦参碱、氧化苦参碱对照品母液适量，置同 一量瓶中，加乙腈-无水乙醇（85:15）制成每1ml含苦参碱0.32mg和35卩g的溶液，摇匀， 即得。9.4.3.2 供试品制备：精密称取同一已知含量的供试品 9份（每份约0.6g ），置具塞锥形瓶中，加浓氨水 0.5ml， 精密加入三氯甲烷25ml，称定重量，超声处理30分钟，放冷，加三氯甲烷补足损失重量， 滤过，精密吸取续滤液5ml，水浴上挥干，用乙腈-无水