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文档简介

1、基因工程实验设计题目:绿色荧光蛋白基因(gfp)的克隆及表达专业:生工1001姓名:刘会淼2013 年 3 月 13实验目的:研究绿色荧光蛋白( Greed Fluorescent Protein , GFB基因的基因克隆及在大 肠杆菌中的表达。实验方法;通过分别将 DH-5a (pEGFP-N3)和DH-5a (pET-28a)提取质粒、酶切并连接形成 重组质粒pET-28a-GFP,将重组质粒导入 DH-5 a感受态细胞中进行转化,通过限制性核酸内 切酶Not I与Bam H1和PCR寸所建质粒进行分析鉴定后,通过转化的方法把含绿色荧光蛋 白(GFB外源基因转入大肠杆菌体BL-21内进行表

2、达,再用IPTG诱导GFP基因表达,如果可以看到显现绿色,判断 GFP基因在大肠杆菌中成功表达。1 .材料与方法:1.1.1 实验材料克隆菌DH-5a、表达菌BL-21为本实验室收藏菌种,质粒pET-28a和pEGFP-N3,引物,限制性内切酶 Bam H1、 Not I1.1.2 仪器设备Eppendof离心机、电泳仪 、电子天平、台式离心机、控温磁力搅拌器、调温电热套pH计、冰箱、台式冷冻恒温振荡器、紫外灯、生物洁净工作台 、电热恒温水温箱、琼脂糖凝胶电泳电泳装置、凝胶成像分析系统、酒精灯、培养皿、移液枪、枪头、接种环、酒精棉球、灭菌枪头、平板封口膜、离心管1.1.3 试剂及溶液分装后于1

3、21c高压灭菌20 min。(LB固体培养基是在液体LB中加琼脂粉至1 %);溶液I 50 mL葡萄糖50mmol/LTris-Cl (pH25mmol/LEDTA (pH10mmol/L121c高压灭菌15 min后置于04c贮存;溶液n 100 mLmol/LNaOHSDS1% (W/V)用时由母液2 mol/L NaOH、10%(W/V) SDSW释现配;溶液出100 mLKOAc (5 mol/L)60 mL冰乙酸mLH2OmL121c高压灭菌15 min后置于04 C贮存;氯仿;琼脂糖;灭菌的去离子水;10X酶切缓冲液;TaqDN朦合酶;TaqDN麋合酶缓冲。灭菌的mol/L CaC

4、l 2,标准相对分子质量的 DNA澳乙锭(EB)储存液 wg/mL; LB/Kan (50 wg/mL)固体培养基;IPTG配成浓度为400 mM水溶?夜,-20 C保存备用;卡那霉素(Kan) 配成浓度为100 ug/mL水溶液,-20 C保存备用;70成醇:用新开装的乙醇和灭菌无离子 水配成,放在 04 C;无水乙醇 :放在 04 C; RNase母液:将RNase溶于10 mmol/LTris - Cl( pH、15 mmol/L NaCl 配成的试剂中,配成 10 mg/mL的溶液,在100 C加热15min,使可能溶有的DNas能活,然后缓慢冷却至室温,分装成小份保存于20 C ;方

5、法:1.2.1 大肠杆菌DH-5a (pEGFP-N3)染色体DNA的提取1.2.2 、实验目的:掌握酚氯仿法提取DN A的原理和操作。1.2.3 ,器材:,微量移液器、高速离心机、EP管、吸头、烘箱、水浴锅、管架、胶头 滴管、冰箱,消化缓冲液:CTAB/NaCl溶液:?NaCl溶解于80ml?H2?O,缓慢力口入 10g?CTAB加水至100ml;其它试剂:氯仿:异戊醇(24:1),酚:氯仿: 异戊醇(25:24:1),异丙醇,70%Z酉I, TE,10%?SDS蛋白酶?K?(20mg/ml 或粉齐1J ) , 5mol/L?NaCl。1.2.4 实验原理生物的大部分或几乎全部D N A都集

6、中在细胞核或类核中。DNAS体内通常都与蛋白质结合,蛋白质对DNA制品的污染常影响到以后的DNA操作过程,因此需把蛋白质除去,一般采用酚氯仿抽提法。苯酚、氯仿对蛋白质有极强的变性作用,而对DNA无影响。经苯酚、氯仿抽提后,蛋白质变性而被离心沉降到酚相与水相的界面,DNAW留在水相,少量的或与DNA紧密结合的蛋白质可用蛋白酶予以去除。DNA|iJ品中少量的RNA影响,必要时可加入不含DNase的RNase去除RNA污染。1.2.5 、实验步骤1.?100ml?细菌过夜培养液,?5000rpm离心10分钟,?去上清液。? ?2.?加?TE悬浮沉淀,?并力口?10%?SDS,?50 l?20mg/m

7、 l(或1mg干粉)蛋白酶?K,?混匀,?37 c保温1小时。??3.?力口?5mol/L?NaCl,?混匀。?4.?加?CTAB/NaCl溶液,?混匀,?65 c保温20分钟。??5.?用等体积酚:氯仿:异戊醇(25:24:1)抽提,?5000rpm离心10分钟,?将上清液移 干净离心管。6.? 用等体积氯仿: 异戊醇 (24:1) 抽提 ,?取上清液移至干净管中。 ?7、加?1/10?体积3mol/L?NaAc,及2 . 5 ?倍体积预冷(2 0 C) 无水乙醇,混匀。 2 0c 沉淀 3 0 min。12000rpm15min,弃上清8、力口 70%酉1 1ml,轻轻混匀,12000rp

8、m15min ,弃上清。9、EP管放置于烘箱中烘干。10、力口 3 0 ul TE 或 ddH2OB解DNA。11、琼脂糖凝胶电泳检测注意,实验室中一般用的的 EP管,可根据自己需要按比例调节加样量。DH-5a (pET-28a)的载体质粒也可根据同样方法提取。1.3.1 PCR扩增1.3.2 实验目的1、学习P C R扩增的基本原理。2、掌握P C R技术的常规操作。3、了解P CR扩增的参数设计。1.3.3 实验原理1、聚合酶链反应 (Polymerase chain reaction , PCR):利用核酸变、复性的性质,以待扩增的D N A为模板,在体外由引物介导的酶促合成特异D N

9、A片段的过程。2、P CR反应体系引物、dNTP Mg 2 +、模板、Taq DNA 聚合酶,Buffer 。3、P CR循环参数 9 5c 5min 9 5c 30s 5 2c 30s 72 30s goto 2 9 times 72 10min1.3.4 器材1,微量移液取样器,移液器吸头,pcr微量离心管,pcf<,台式离心机,琼脂糖凝胶电泳系统,紫外凝胶成像系统2, Taq DN咪合酶,PCR冲液,MgCl2 , dNTP,引物,模板,ddH2Q TBE电泳缓冲液,EB,加样缓冲液3,引物: 1.3.5 实验步骤1、在PCR微量离心管中配制 30ul反应体系。dd water10

10、 XPCR buffer (不含 MgCl2)3ul25mM MgCl22ul10mmol/L dNTP1ul10 mol/L 引物 11ul10 科 mol/L 引物 21ul模板1ulTaq 酶总体积20ul2、在离心机中混匀。3、£管放入(2 11仪中,按照原理中的条件设置程序,进行PC R反应。4、PCR吉束后,取3ul PCR产物进行琼脂糖凝胶电泳检测凝胶电泳法回收目的DNA及其体外连接1.4.1 、实验目的1 .学习和掌握从琼脂糖凝胶中回收DNA片段的方法。2 .掌握DNA体外连接的方法。1.4.2 ,实验原理1, DN肪子在琼脂糖凝胶中的电泳速率与以下因素有关:DNA子

11、大小DNA子构象琼脂糖凝胶浓度电泳所用电压电泳缓冲液2 .利用硅胶膜在高盐浓度时能特异性吸附DNA而在低盐浓度时可使DNAt洗脱的原理纯化DNA。3 . Taq酶参与PC或应中,产物双链核酸中的3'端各多连接一个脱氧腺甘酸A与商业开发的pMD18-T载体可在DNA连接酶作用下,按照碱基配对形成环状的完整质粒。1.4.3 ,仪器1,凝胶电泳系统,刀片,紫外仪,酒精灯, EP 管, EP 管架, 65 水浴锅2, PCRT物,1XTBE,加样缓冲液,TakaRa胶回收试剂盒,TA克隆试剂盒,DL2000 marker 1.4.4 ,实验步骤1 , 2%琼脂糖凝胶电泳2,在紫外灯下用干净的手

12、术刀割下含有目的DNA琼脂糖块装在的EP管中称量减1克即为凝胶块重量3,加入5个凝胶体积量的 DR-I Buffer4 ,混匀65 加热融化凝胶块5,加入DR-1 Buffer量的1/2体积的DR-n Buffer,当目的片段小于 400bp再加入终浓度为 20% 的异丙醇6 ,将上述溶液short 后转移至 spin coloumn 中 12000rpm, 1min 弃滤液7,加入500ul RinseA 12000rpm 30s弃滤液8,加入700ul RinseB 12000rpm 30s弃滤液9 ,同 810, 将 spin coloumn 安置于新的 EP 管中 在 spin col

13、oumn 膜中央加 25ulElution Buffer 放入烘箱 1min 12000rpm 1min 保存 EP 管 1%胶检测11,链接反应(冰上操作)在一支 ml EP 管中加入以下试剂:纯化的目的DNA片段Vector连接液5ulDH-5a和BL-21感受态细胞的制备1) 将04 C保存的DH-5a和BL-21菌种分别接种在LB液体培养基中37 C下250 r/min 过夜培养 16 h 。2)将分别接种过夜菌:LB® 1:50的比例接种于2 mLLB液体培养基中,37 c活化培养2 3 h 至 ODa 。3) 取mL菌液转入EP#中,置于冰上 10 min,然后于4 C下

14、5000 r/min离心5 min。弃上 清液,沉淀加入 mL预冷的mol/L CaCl2缓和悬菌。冰上放置15-30 min后,4 C下5000r/min 离心 10 min 。4)弃上清液,沉淀用 mL预冷的mol/L CaCl 2 (含15%甘油)缓和悬菌,放在 20 c冰箱 内保存。感受态细胞的转化1) 取制备好的感受态细胞100 “,冰上解冻,均匀悬浮。2) 加入2酶连产物,轻轻混匀,冰上静置10-30 min 。3) 42 水浴中热击70 sec 后,冰上放置2 min 。4) 加入200科l LB液体培养基,37 C, 50-100 rpm振荡培养1 h。5)取200 “悬浮细胞

15、涂布在含合适抗生素的LB固体培养基上,用涂布器均匀涂布,平皿正放静置 1-2 h 后,封口膜封好平皿, 37 培养倒置12-16 h 。碱法提质粒1)用灭菌吸头挑取单菌落,浸没于 2 m备有抗生素的LB液体培养基中,37 C, 180 r/min振荡培养过夜。2) 取 ml 培养物倒入微量离心管中,用微量离心机于 4 、 11000 r/min 离心 1 分钟,吸弃上清。3)向离心管中加入150 ?l用冰预冷的溶液I,用微量移液器吹打重悬沉淀。4) 加入200 ?l新配制的溶液n,盖紧管口,快速颠倒离心管5次,冰上放置5分钟。5) 加入150 ?l用冰预冷的溶液m,轻轻混匀,冰上放置35分钟。

16、6) 用微量离心机于 4 、 11000 r/min 离心 5 分钟,吸取上清转移到另一离心管。7) 加等体积氯仿400 ?l 抽提,振荡混匀,用微量离心机于 4 、 11000 rpm 离心 2 分钟,将上清转移到另一离心管中。8) 吸取上清液300 ?l ,向上清中加入 2 倍体积的无水乙醇,混匀后,于室温放置2 分钟;用微量离心机于 4 C、11000 rpm离心5分钟,弃上清。9) 用70叱醇洗涤2次,再次4 C、11000 rpm离心5分钟,沉淀于空气中干燥。向已干燥的离心管内加 20 ?1超纯水溶解质粒 DNA加入2 ?1 10 mg/ml RNA 酶,37 C处理1小时后于-20

17、 C贮存。酶切鉴定1) 取提取的质粒8 ?1于另一微量离心管中,加入2 ?l Bam H I和Not I的酶切混合液,轻弹管外混匀反应物。2)离心,使溶液聚集在管底部。3) 37 C,酶切反应。琼脂糖凝胶电泳1)称取0.8 g琼脂糖,放入到锥形瓶中,加入 100 mL1XTAE缓冲液,置微波炉或水浴加热至完全融化,冷却至 60 C左右。2) 轻缓倒入封好两端和加上梳子的电泳胶板中,静置冷却30分钟以上。3)将胶板除去封胶带,加电泳缓冲液至电泳槽中,加液量要使液面没过胶面毫米,轻轻拔除梳子。4)吸取10 ?l的质粒与2 ?l的上样液混匀,吸取混合液将加入加样孔。5) 接通电泳槽与电泳仪的电源,设

18、置电泳数据U=100 V, I=30 mA 。6)当澳酚蓝染料移动到距凝胶前沿1-2 cm处,停止电泳。7)在凝胶成像分析系统中观察结果。PCR-聚合酶链式反应1)将PCRT放置在冰盒上,按如下表格加入pc反应体系各成分PCR应体系各成分的量模板DNA0.1 ?lR(20 mM)0.2 ?lP2(20 mM)0.2 ?ldNTPs(10 mM)0.4 ?lTaq 酶(5 U/?l)0.2 ?l10XPCR buffer2 ?l20 ?lTotal2) 将PC嘴放入PCR4中,设定PCR4的循环参数。预变性 95 C 3 min ,变性95 C 30 s , 退火60-55 C 30 s ,延伸72 C 1 min 10个循环,每个循环降 0.5 C。变性95 C 30 s , 退火55 C 30 s ,延伸72 C 1 min

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