乙型肝炎病毒核心区基因免疫小鼠细胞免疫应答研究.

1、乙型肝炎病毒核心区基因免疫小鼠细胞免疫应答研究【摘要】 目的 观察小鼠对 HBV 核心区基因疫苗的免疫应答。 方法 将经过基因修饰的乙型肝炎病毒核心区基因定向克隆于真核表达载体 (pcDNA3)，构建成 HBV 核心区基因疫苗(pcDNA-HBV)给 Balb/c 小鼠多点肌肉 注射，2 周后追加免疫一次，用竞争抑制酶联法及MTT 法检测小鼠血清抗-HBc及脾细胞对 HBcAg 的特异性增殖反应。 结果 免疫接种 2 周后小鼠血清抗-HBc 均阳性，持续 12 周以上，脾细胞对 HBcAg 的刺激指数明显高于对照组(Pv0.05)。结论pcDNA-HB 在 Balb/c 小鼠体内既可诱导体液免

2、疫应答，又可诱 导特异性的细胞免疫应答。【关键词】 肝炎病毒，乙型基因，免疫应答The immune response in Balb/c mice immunized with hepatitis B virus coreDNA-based vacci neDeng Tao,Wu Sha nsha n, Che ng Tian bao,et al.In stitute of Liver Diseases,PLA,Beiji ng 100700【Abstract 】 Objective To study immune response in mice against the HBVcore D

3、NA-based vaccine.Methods The modificated HBc gene withits stem and loopstructure was in serted into the eukaryotic expressi on vector(pcDNA-HBV).The Balb/c mice were immuni zed by multiple sites intramuscularinjection with pcDNA-HBV and pcDNA3 respectively.Each mouse was boosted after2 weeks.The an

4、ti-HBc Ab was detected by ELISA,mea nwhile,the stimulati on in dexof splee ncytes to HBcAg were measured by MTT method. Results The anti-HBc inmiceimmuni zed with pcDNA-HBV became and main tai ned to be positive for at least 12weeks.The stimulati on in dex of splee ncytes to HBcAg were sig nifica nt

5、ly higher than that of mice injected with pcDNA3Co nclusio n The in vestigation dem on stratedthat pcDNA-HBV could gen erated humoral and cellular immune resp onse in Balb/cmice.【Key words 】 Hepatitis B VirusGen e,im mune resp onse慢性乙型病毒性肝炎患者 HBV 难以清除的重要原因之一是机体细胞免疫功 能障碍，尤其是针对 HBV 主要靶抗原即核心抗原(HBcAg)的特

6、异性细胞毒 T 细胞 (CTL)功能低下：。基因免疫是近几年发展起来的新的生物技术，不仅可诱导 体液免疫应答，而且可诱导强烈而持久的细胞免疫应答。这种特异性的细胞免 疫应答不仅对预防不同株型的病毒感染具有重要意义，而且对慢性病毒感染具 有治疗作用：小-为了探求慢性乙型肝炎(乙肝)防治新策略，我们在原实验基 础上对 HBV 核心区基因疫苗的细胞免疫应答进行了实验研究材料和方法一、pcDNA-HBV 勺构建及鉴定从含 HBV（ayw 型）核心基因片断的原核表达质粒 pUC19 中国预防医学科学 院病毒研究所詹美云教授赠）经 BamHI 及 Hind 川双酶切，电泳回收其中 1kb 的 含有ATG

7、和 TAG 的核心基因片段，定向克隆于已预先用 Hind 川和 BamH 双酶消 化好的真核表达载体 pcDNA3 勺 CMV 启动子下游， 称之为 pcDNA-HBV 经 Hind 川 和 BamHI双酶切电泳分析鉴定，并通过 PCR 佥测构建的 pcDNA-HBV 中有无 HBV 核心区基因片断，PCR 式剂盒购自美国 Biogene 公司。二、pcDNA-HBV量制备pcDNA-HB 质粒转化工程菌 JM109 筛选阳性克隆，经 LB 培养基扩增，按 碱裂解方法提取质粒，通过紫外分光光度计测定其浓度，按1 卩 g/卩 l 溶于无菌PBS -20C储存备用。三、基因免疫接种选用 46 周龄

8、的 Balb/c 小鼠，用 1ml 的 0T 注射器（25 号针头）行双后肢 多点肌肉注射，每只总量 100 卩 g，2 周后追加免疫一次。实验中分别设实验组 （注射pcDNA-HBV n=5）及对照组（注射空载 pcDNA3 n=4）组。四、T 细胞抗原特异性增殖反应测定免疫 4 周后，制备小鼠脾细胞悬液，细胞浓度为1X106/ml，加入 96 孔板，每孔 100 卩 l，平行三孔，分别加入 HBcAg5i g/孔及 1 : 300 植物血凝素（PHA） ，37C、5%CO 温育 72 小时，加四甲基偶氮唑盐（MTT）10 卩 l，37C、6 小时，加盐酸异丙醇 100 卩 l，混匀，静置

9、15 分钟，测各孔 A570 值，计算增殖 指数。增殖指数=实验组 A 值/对照组 A 值。五、血清抗体检测采用竞争抑制酶联免疫试验动态观测小鼠血清抗 -HBc 变化，试剂盒购自珠 海亚利公司，按试剂盒说明检测，抑制率 50%为阳性，v50%为阴性。结果一、pcDNA-HBV 勺构建及鉴定真核表达载体 pcDNA3 带有巨细胞病毒启动子（PCMV 和 poly A 序列，可保 证插入基因用自身起始密码在多种哺乳动物细胞内高效表达。插入的HBc 基因已通过基因修饰，将位于核心基因起始信号上游障碍其表达的环茎状结构（约30bp）剪切掉，再化学合成一段包含起始信号的人工接头与其拼接，继而被定向 克隆

10、于 pcDNA3 CM 启动子的下游，称其为 pcDNA3 HBV 将 pcDNA HBVS Hind 川和BamHI 双酶切，可获得 5.4kb 及 1kb 两条带，而 pcDNA3 双酶切分析仅 见 5.4kb 的一条带，证明 1kb 的 HBc 基因已被插入。为进一步证明其特异性，将 pcDNA3 HBVS过 PCF 检测 HBV 核心区基因， 结果显示可获得一 510bp 的 HBc 条带， 而空载 pcDNA则无此条带，pcDNA HB结构及鉴定见文献：6S二、T 细胞抗原特异性增殖反应结果附表 小鼠脾细胞对 HBcAg 的增殖反应指数组别 只数 HBcAg HBcAg+PHApcD

11、NA-HBV51.5321.651pcDNA 寸照组50.9911.181P 值V0.05V0.05三、小鼠血清抗-HBc-IgG 检测结果追加免疫 1 周后基因免疫组(n=5)均出现了抗-HBc 抗体，其抑制率的动态 改变见 1,而空载质粒 pcDNA3 寸照组(n=5)及未经免疫的正常鼠(n=5)血清抗- HBc 抗体均阴性。No.1,No.2,No.3,No.4,No.5为免疫鼠编号，Normal 为对照组1 小鼠血清抗-HBc 抗体动态水平讨论许多实验证明慢性乙肝患者 HBV 难以清除的重要原因之一是机体细胞免疫 功能低下，尤其是针对 HBV 主要靶抗原(HBcAg)的特异性细胞毒性

12、T 细胞功能低 下。基因免疫既可诱导机体体液免疫应答，又可诱导机体细胞免疫应答，这种 特异性的细胞免疫应答不仅对预防不同株型的病毒感染具有重要作用，而且对 慢性病毒感染具有治疗作用。Tokushige、Wang 等：4，7：已分别进行了 HCV HIV 核心区基因免疫实验研究，并在小鼠体内获得了特异性的细胞及体液免疫应 答。为了探求慢性乙肝新的免疫治疗措施，此前作者已构建了HBV 核心区基因疫苗，并在 Balb/c 小鼠体内获得了体液免疫应答，本实验在此基础上进行了细 胞免疫应答研究。结果显示 pcDNA-HB免疫组小鼠脾细胞对 HBcAg 的增殖反应 指数明显高于对照组，提示 pcDNA-H

13、BV 在 Balb/c 小鼠体内既可诱导体液免疫应 答，又可诱导特异性的细胞免疫应答，与Ku*” 041 (855 bytes) src=/med/ca no/201003/2010031519593974413 18ber 研究结果类似。而且, Kuhber 等：印还研究发现单用 HBcAg 不能诱导细胞免疫应答，而用表达 HBcAg 的质粒免疫 小鼠则可获得 MHCI 限制的特异性的 CTL 应答，并认为这种特异性的 CTL 应答对 慢性病毒感染具有治疗作用，是一种新的有希望的免疫治疗策略。基因免疫的抗原加工及呈递过程可能存在以下三种途径：(1)肌纤维细胞被质粒 DNA 专染，表达的抗原蛋

14、白在肌纤维细胞内被加工后形成小分子抗原多 肽，继而与肌纤维细胞内的 MHC-I 分子结合，激活 T 淋巴细胞。肌纤维丰富而 独特的 T小管系统有助于质粒 DNA 的吸收；(2)肌肉组织中的抗原呈递细胞如 树突状细胞(dendritic cells)在免疫接种过程中可能被质粒 DNA 转染而进行抗原呈递；(3)抗原蛋白从肌细胞分泌出来后，被树突状细胞吞噬处理，然后与 MHCJ分子结合，激活 T 细胞、B 细胞，进而诱导机体细胞及体液免疫应答， 但 HBcAg 不能从细胞内分泌至细胞外，这可能是HBV 核心区基因免疫体液免疫应答较弱的原因之一：2 30本课题受国家自然科学基金资助(39770660

15、)作者单位：100700 北京军区总医院解放军肝病研究所参考文献1Lohr H,Weber W.Schlaak J,et al.Proliferative response of CD4+Tcells and hepatitis B virus clearance in chronic hepatitis with or without hepatitis Be-minus hepatitis B virus mutants.Hepatology,1995,22:61-68.2邓涛，陈乃玲，贾克明 . 病毒核酸疫苗的研究现状 . 国外医学病毒学分册， 1996，3：88-92.3Michel

16、ML,Davis H,Schleef M,et al.DNA-mediated immunization to the hepatitis Bsurface antigen in mice:Aspects of the humoral response mimic hepatitis B viralinfection in humans.Pro Natl Acad Sci USA,1995,92:5307-5311.4Tokushige K,Wakita T,Pachul C,et al.Expression and immune response tohepatitis C virus co

17、re DNA-based vaccine constructs.Hepatology,1996,24:14-20.5Davis HL,Schirmbeck R,Reimann J,et al.DNA-mediated immunization in miceinduces a potent MHC class I-restricted cytotoxic T lympho-cyte response to thehepatitis B envelope protein.Human Gene Therapy,1995,6:1447-1456.6邓涛，陈乃玲，陈天宝，等 . 乙肝病毒核心区基因免疫小鼠初步研究 . 中国公 共卫生学报， 1998，17： 13-14.7Wang B,Ugen KE,Srickantan V,et al.Gene inoculation generates im