多糖结构分析

1、多糖结构研究方法多糖及其复合物是来自于高等动、植物细胞膜和微生物细胞壁中的天然大分 子物质之一,自然界含量丰富,与人类生活紧密相关,对维持生命活动起至关重 要的作用.多糖和核酸、蛋白质、脂类构成了最根本的 4类生命物质.由于多糖 的生物活性与多糖的结构关系密切,因此活楚熟悉多糖的结构是进行多糖研究和 利用的根底.多糖结构比蛋白质和核酸的结构更加复杂, 可以说是自然界中最复 杂的生物大分子.从化学观点来看,多糖结构解析最大的难点就在于其结构的复 杂性.糖的结构分类可沿用蛋白质和核酸的分类方法,即多糖的结构也可分为一 级、二级、三级和四级结构.与蛋白质或核酸大分子相比,糖链的一级结构“含 义要十分

2、丰富.测定糖链的一级结构,要解决以下几个问题：1相对分子质量；2糖链的糖基组成,各种单糖组成的摩尔比；3有无糖醛酸及具体的糖醛 酸类型和比例；4各单糖残基的D-或L.构型,毗喃环或味喃环形式；5各个 单糖残基之间的连接顺序；6每个糖苜键所取的a-或B.异头异构形式；7 每个糖残基上羟基被取代情况：8糖链和非糖局部连接情况；9主链和支链连 接位点：10糖残基可能连接硫酸酯基、乙酰基、磷酸基、甲基的类型等.多糖 的二级结构是指多糖主链问以氢键为主要次级键而形成的有规那么的构象,与分子主链的构象有关,不涉及侧链的空间排布；多糖的三级结构和四级结构是指以二 级结构为根底,由于糖单位之间的非共价相互作用

3、,导致二级结构在有序的空间 里产生的有规那么的构象四.多糖结构的分析手段很多.不仅有仪器分析法,如红 外、核磁共振、质谱等,还有化学方法,如完全酸水解、局部酸水解、高碘酸氧 化、Smith降解、甲基化反响等,以及生物学方法,如特异性糖苜酶酶切、免疫 学方法等.1质谱MS由于MSt在糖链结构分析中具有快速灵敏,样品用量少、结构信息直观的 特点而得到越来越广泛的应用.近年来各种软电离技术的诞生,如快原子轰击质 谱FAB MS,电喷雾质谱ESI MS,基质辅助激光解析离子化质谱MALDI-MS 等,使得糖结构分析的研究取得了日新月异的开展.快原子轰击质谱FAB MSFAB-M混上世纪80年代初开展起

4、来的一种新的软电离质谱技术.其显着区 别于传统质谱之处在于样品受加速原子或离子的轰击,可直接在基质溶液中电 离.FAB-MS的引入使传统质谱技术难以分析的极性强,难挥发以及热不稳定的 化合物不经衍生化就可以直接进行质谱分析, 而且对生物大分子的研究取得了重 大突破.FAB-MS已被证实是分析糖结构最为有力的方法之一,它不仅可以测定 寡糖及其衍生物的分子量,而且可以测定聚合度高于30的糖的分子量.同时,FAB-M涎可以确定糖链中糖残基的连接位点和序列,已广泛用于糖类的分析. 电喷雾质谱ESI-MSESI-MS是将溶液中分子转变成气相离子非常有效的手段,是目前最软的一 种电离方式.这种电离方式所产

5、生的分子离子往往带有多电荷.因此ESI-MS可以测定的分子量范围大大扩展.对多糖而言, ESI-MS可以分析nh25个甚至更多 单糖残基组成的含有毯基或硫酸根等官能团的多糖.近年来,ESI-MS已在多糖的结构分析中显示了强大的生命力.它能用于衍生化和非衍生化多糖的测定.ESI-MS易与HPLC CE等技术联用,大大提升了工作效率以及灵敏度和精确度, 如ESI-MS与I-IPLC联用分析寡糖及其衍生物.基质辅助激光解析离子化质谱(MALDI-MS)MALDI-M笋上世纪80年代末问世.由于技术的特点,这种离子化方式电离 出的离子常用飞行时间(TOF)检测器检测,因此MALDI-MS与TOF一起称

6、为基质 辅助激光解析离子化飞行时间质谱(MALDI-TOF-MS)它也是一种软电离方式,产 生的分子离子十分稳定,不易裂解,所以适用于检测大分子质量的生物样品.2红外光谱(IR)红外光谱(infrared spectroscopy, IR)是一种吸收光谱.由于红外光只能激发分子内原子核之间的振动和转动能级的跃迁,所以红外吸收光谱是通过测定 振动和转动能级跃迁的信息来研究分子结构的.在红外光谱图中,纵坐标一般用线性透光率作标度,称为透射光谱图；也有采用非线性吸光度为标度的, 称为吸 收光谱图.谱图中的横坐标是以红外辐射光的波数 (锄d)为标度.较少采用波长 (pm)为标度.波长和波数的关系依照式

7、为：v(cml) x u岬)=104.红外辐射光的 波数可分为近红外区 (10000-4000cm-1)、中红外区(4000-400cm-1)和远红外区 (400-10 cnl ").其中最常用的是中红外区,大多数化合物的化学键振动能级的 跃迁发生在这一区域,因此主要研究中红外区域的吸收光谱即分子的振动光谱, 可以对各种高分子材料进行分析、 测定.那么对应这些基团的一些谱带在这个化合 物的取光谱中往往是最强的,明显地显示这个基团的结构特征.因此,对应这些 基团的谱带在其聚合物的谱图中,常常是处于最显着的地位,能够很特征地反映 该类聚合物的结构和预示其存在. 对于各种聚合物分子来说,含

8、有的主要极性基 团是酸、酯、酰胺、酰业胺、苯酰、脂肪酰和醇等.除此之外,含有硅、硫、磷、 氯和氟等杂原子的化合物也常具有较强的极性.红外光谱作为“分子的指纹广泛用于分子结构和物质化学组成的研究.根据分子对红外光吸收后得到谱带频率 的位置、强度、形状以及吸收谱带和温度、聚集状态等的关系便可确定分子的空 问构型,求出化学键的力常数、键长和键角.从光谱分析的角度看主要是利用特 征吸收谱带的频率推断分子中存在某一基团或键,由特征吸收谱带频率的变化推 测临近的基团或键,进而确定分子的化学结构,当然也可由特征吸收谱带强度的 改变对混合物及化合物进行定量分析.3拉曼光谱拉曼散射乂称拉曼效应,是由印度物理学家

9、拉曼于 1928年首先发现并因此 获得1930年诺贝尔物-理奖.拉曼效应是能量为hvo的光子同分子碰撞所产生的 光散射效应,也就是说,拉曼光谱是一种散射光谱.单色光束的入射光光子与分 子相互作用时可发生弹性碰撞和非弹性碰撞, 在非弹性碰撞过程中,光子与分子 之间发生能量交换,光子不仅仅改变运动方向,同时光子的一局部能量传递给分子,或者分子的振动和转动能量传递给光子, 从而改变了光子的频率.简单来说, 散射分子的转动能级和振动能级发生了变化是产生拉曼散射的原因,此时散射光子频率不同于入射光子.因此,每种物质的拉曼光谱也就是拉曼散射光谱都只与 其自身的分子结构有关,而与入射光的频率无关.拉曼效应普

10、遍存在于一切分子 中,无论是气态,液态和固态.拉曼散射光谱对于样品制备没有特殊要求；对于 样品数量要求比拟少.拉曼散射最突出的优点是采用光子探针, 对于样品无损伤 探测,尤其适合对稀有或珍贵的样品进行分析, 甚至可以用拉曼光谱检测活体中 的生物物质.拉曼光谱与红外光谱是相互补充的. 在各种分子振动方式中,强力 吸收红外光的振动能产生高强度的红外吸收峰,但只能产生强度较弱的拉曼谱 峰；反之,能产生强的拉曼谱峰的分子振动却产生较弱的红外吸收峰.将两者结合起来才能得到分子振动光谱的完整数据,更好地解决分子结构的分析问题.常 用的拉曼光谱技术主要有：显微共焦拉曼光谱技术、傅里叶变换拉曼光谱技术、 共振

11、增强拉曼光谱技术和外表增强拉曼光谱技术.(1) 显微共焦拉曼光谱技术显微共焦拉曼光谱技术是将拉曼光谱分析技术与显微分析技术结合起来的 一种应用技术.通过两根光导纤维将显微镜与拉曼光谱仪组合起来,实验时通过 显微镜观察,选择有关分析所感兴趣的待测样品的部位, 一根光导纤维将被激发 的激光光束从光谱仪传递到显微镜待测样品部位,入射激光通过显微镜聚焦后, 照射到被测样品上,另一根光导纤维将拉曼散射光辐射传递回光谱仪的有关部 位,传递回来的拉曼散射光信号被相十仪所调整,形成光谱信号.显微共焦拉曼光谱技术可在不受周围成分十扰的情况下, 精确获取微区内的化学信息,如化学 成分、晶体结构、分子取向及分子间相

12、互作用等.(2) 傅里叶变换拉曼光谱技术傅里叶变换拉曼光谱一般采用波长 1064nm的近红外激光作为激发光源,分 子的荧光不被激发,防止了许多样品拉曼光谱中的荧光十扰,近90%的化合物可获得拉曼光谱.(3) 共振增强拉曼光谱技术当激发光的频率接近或等于被测分子的电子吸收频率 (紫外.可见光)时,某 一条或几条特定的拉曼线强度会急剧增加,甚至可以出现正常拉曼效应中观察不 到的泛频及组合振动频率的谱峰. 共振拉曼光谱灵敏度高,可检测低浓度和微量 样品,可研究大分子聚集体的局部结构,已成为研究有机分子、离子、生物大分 子甚至活体组织的有利工具.(4) 外表增强拉曼光谱技术外表增强拉曼光谱技术是一种新

13、的外表测试技术,它可以在分子水平上研究 材料分子的结构信息,具有极高的灵敏度和选择性等独特的优点.4 X射线衍射(XRD)1912年德国物理学家劳厄(Laue)等人根据理论预见,并用实验证实了 X射 线具有波动性,它与晶体相遇时能产生衍射现象,并证实了 X射线的波动性和晶体内部结构的周期性,开创了 x射线晶体学这一新领域.当一束单色x射线入射 到晶体时,由于这些规那么排列的原子间距离与入射 X射线波长有相同数量级,故 能相互十涉,在某些特殊方向上产生X射线衍射,衍射线在空间分布的方位和强 度,与晶体结构相关.衍射线空问方位与晶体结构的关系可用布拉格Bragg方程表示：2dsin 0=n入,式中

14、d为晶面间距,9为掠射角,n为反射级数,入为 x射线波长.5核磁共振NMR核磁基振缩写为NMR是指核磁矩不为零的核,在外磁场的作用振能提供 有关化学结构及分子动力学的信息,成为分子结构解析的一个有力工具.核磁共 振技术于1946年美国哈佛大学的波赛尔和斯坦福大学的布洛赫发现的,经过60多年的理论和技术上的开展,取得了非常惊人的成就,该领域已先后有6位科学 家获得4次诺贝尔奖.现在核磁共振技术己经广泛应用于物理,化学,医学,生 物等多个领域.尤其是现在用多核,多维核磁共振方法进行的生物大分子蛋白质、核酸等的三维空间构象和动力学研究更加引人注目.近些年来,人们通过 核磁共振或X射线晶体衍射技术解析

15、了越来越多的蛋白质及其复合物的结构.通过对这些结构的分析,人们对生物大分子架构,酶作用的活性位点,蛋白质与蛋 白质相互作用的界面等有了更深入的了解.但是,随着了解的加深,人们同时认识到仅仅对静态结构的了解并缺乏以解释蛋白质在生理过程中的作用机理.由于三维空间的结构仅仅是基态的结构,而在生理过程中蛋白质分子更多的处于激发 态,并同蛋白质分子的运动特性密切相关.我们必须了解蛋白质分子结构随时间 的变化,从而在分子的静态结构和动态结构问架起一座桥梁,这样才能最终揭示 蛋白质分子结构与功能的关系.6扫描电子显微镜扫描电子显微镜简称为扫描电镜,英文缩写为SEMScanningElectronMicros

16、cope.SEM巨电子探针EPMA勺功能和结构根本相同,但 SEM一股不带 波谱仪WDS它是用细聚焦的电子束轰击样品外表,通过电子与样品相互作用 产生的二次电子、背散射电子等对样品外表或断口形貌进行观察和分析.现在 SEMO与能谱EDS组合,可以进行成分分析.所以,SEM&是显微结构分析的主 要仪器,已广泛用于材料、冶金、矿物、生物学等领域.扫描电镜主要包括电子 光学系统、扫描系统、信号检测放大系统、图象显示和记录系统、电源和真空系统等.其工作原理图1.1:在高电压作用下,从电子枪射出来 的电子束往聚光镜和物镜聚焦成很细的高能电子束,在扫描线圈的作用下,在试样的外表进行帧扫描.电子束与

17、试样外表物质相互作用产生背散射电子,二次电子等各种信息,探测器将这些信号接受,经放大器放大去调节显像管的栅极, 并 在荧光屏上显示出衬度.扫描电镜的主要性能与特点：放大倍率高,从几十放大到几十万倍,连续可 调.分辨率高、景深大、景深大,图像立体感强,样品通常不需要作任何处理即 可以直接进行观察,所以不会由于制样原因而产生假象. 这对断口的失效分析特别重要.样品制备简单,可以是自然面、断口、块状、粉体、反光及透光光片, 对不导电的样品只需蒸镀一层 20nm的导电膜.另外,现在许多 SEMft有图像处 理和图像分析功能.有的SEMfc入附件后,能进行加热、冷却、拉伸及弯曲等动 态过程的观察.但扫描

18、电镜只能观察物质外表的微观形貌,无法获得物质内部的信息.7透射电子显微镜透射电子显微镜是以波长很短的电子束做照明源,用电磁透镜聚焦成像的一种具有高分辨本领,高放大倍数的电子光学仪器.测试的样品要求厚度极薄(几十纳米),以便使电子束透过样品.在真空条件下,电子束经高压加速后,穿透 样品时形成散射电子和透射电子,它们在电磁透镜的作用下在荧光屏上成像.投射电子显微镜结构如图1. 2所示91.透射电子显微术在高分子研究中有着重要 的应用.它可用来观察高分子晶体的形貌和结晶结构, 高分子多相体系的微观相 别离结构,高分子材料的网络,测定高分子的分子量分布和多孔高分子薄膜的微 孔大小与分布,高分子材料的外表、界面和断口、粘合剂的粘结效果以及聚合物 涂料的成膜特性,还可用来使高分子晶体的晶格至高分子本身直接成像.透射电 镜由于入射电子透射试样后,将与试样内部原子发生相互作用,从而改变其能量 及运动方向.显然,不同结构有不同的相互作用.这样,就可以根据透射电子图 象所获得的信息来了解试样内部的结构.由于试样结构和相互作用的复杂性,因 此所获得的图象也很复杂.它不象外表形貌那样直观、易懂.8差示扫描量热法(DSC)DSO在程序限制温度条件下,测量输入给样品与参比物的功率差与温度关 系的一种热分析方