实时荧光定量原理taqman探针简介

1、实时荧光定量原理taqman探针简介实时荧光定量PCR技术原理与应用聚合酶链式反响PCR可对特定核昔酸片断进行指数级的扩增.在扩增反 应结束之后,我们可以通过凝胶电泳的方法对扩增产物进行定性的分析,也可以通 过放射性核素掺入标记后的光密度扫描来进行定量的分析.无论定性还是定量分 析,分析的都是PCR终产物.但是在许多情况下,我们所感兴趣的是未经PCR信 号放大之前的起始模板量.例如我们想知道某一转基因动植物转基因的拷贝数或者 某一特定基因在特定组织中的表达量.在这种需求下荧光定量PCR技术应运而 生.所谓的实时荧光定量PCR就是通过对PCR扩增反响中每一个循环产物荧光 信号的实时检测从而实现对

2、起始模板定量及定性的分析.在实时荧光定量PCR反 应中,引入了一种荧光化学物质,随着PCR反响的进行,PCR反响产物不断累 计,荧光信号强度也等比例增加.每经过一个循环,收集一个荧光强度信号,这样 我们就可以通过荧光强度变化监测产物量的变化,从而得到一条荧光扩增曲线图图1实时荧光扩增曲线图"1:MWWW.bioontom,一般而言,荧光扩增曲线扩增曲线可以分成三个阶段:荧光背景信号阶段,荧 光信号指数扩增阶段和平台期.在荧光背景信号阶段,扩增的荧光信号被荧光背景 信号所掩盖,我们无法判断产物量的变化.而在平台期,扩增产物已不再呈指数级的增加.PCR的终产物量与起始模板量之间没有线性关

3、系,所以根 据最终的PCR产物量不能计算出起始DNA拷贝数.只有在荧光信号指数扩增阶 段,PCR产物量的对数值与起始模板量之间存在线性关系,我们可以选择在这个 阶段进行定量分析.为了定量和比拟的方便,在实时荧光定量PCR技术中引入了 两个非常重要的概念:荧光阈值和CT值.荧光阈值是在荧光扩增曲线上人为设定 的一个值,它可以设定在荧光信号指数扩增阶段任意位置上,但一般我们将荧光域 值的缺省设置是3-15个循环的荧光信号的标准偏差的10倍.每个反响管内的荧 光信号到达设定的域值时所经历的循环数被称为CT值threshold value 如图 2所示.图2.荧光定量标准曲线CT值与起始模板的关系研兖

4、说明,每个模板的CT值与该模板的起始拷贝数 的对数存在线性关系,起始拷贝数越多,CT值越小.利用起始拷贝数的标准 品可作出标准曲线,其中横坐标代表起始拷贝数的对数,纵坐标代表Ct值如图 3所示.因此,只要获得未知样品的Ct值,即可从标准曲线上计算出该样品的 起始拷贝数.图3阈值线和CT值荧光探针和荧光染料实时荧光定量PCR的化学原理包括探针类和非探针类两种,探针类是利用与靶序列特异杂交的探针来指示扩增产物的增加,非探针类那么是利用荧光染料或者特殊设计的引物来指示扩增的增加.前者由于增加了探针的识别步骤,特异性更高,但后者那么简便易行.TaqMan探针Pplymr Nation CoEplogds 心.聘纣:TaqMan探针是多人拥有的专利技术.TaqMan探针是一种寡核甘酸探针,它 的荧光与目的序列的扩增相关.它设计为与目标序列上游引物和下游引物之间的序 列配对.荧光基团连接在探针的5'末端,而淬灭剂那么在3'末端.当完整的探 针与目标序列配对时,荧光基团发射的荧光因与3'端的淬灭剂接近而被淬灭.但在进行延伸反响时,聚合酶的5'外切酶活性将探针进行酶切,使得荧光基团 与淬灭剂别离.TaqMan探针适合于各种耐热的聚合酶,如DyNAzyme