ARMS技术与ARMS-PCR

1、ARMS 技术与 ARMS-PCR一、ARMS技术的原理突变阻滞扩增系统(ARMS-PCR (amplification refractory mutation system ), 又名等位基因特异PCR (allele specific PCR, ASPCR)。基本原理：TaqDNA聚 合酶缺少3-5'外切酶活性。在一定条件下PCR引物3'末端的错配导致产物的急剧减 少，针对不同的已知突变，设计适当的引物可以通过PCR方法直接达到区分突变 型和野生型基因的目的。二、ARMS技术的特点由于ARMS所用的引物是从一段序列在3末端及其附近人为的加入错配的突 变位点的一套引物组合中，

2、通过筛选出来的能够区分单个位点等位基因的引物， 所以说ARMS技术具有高特异性。三、ARMS-PCR简介ARMS-PCR:扩增阻滞突变系统 PCR (Amplification Refractory Mutation System PCR ARMS-PCR),又称为等位基因特异性 PCR (Allele-Specific PCR, AS-PCR)。ARMS-PCR技术建立在等位基因特异性延伸反应基础上，只有当某个等位基 因特异性引物的3'末端碱基与突变位点处碱基互补时，才能进行延伸反应。常 规PCRT增DNA所用的上、下游引物与靶序列完全匹配，而等位基因PCR采用等 位基因特异的两条上

3、游引物，两者在3'端核甘酸不同，一个对野生型等位基因 特异，另一个对突变型等位基因特异，在Taq DNA聚合酶作用下，与模板不完全 匹配的上游引物将不能退火，不能生成PCR产物，而与模板匹配的引物体系则可 扩增出产物，通过凝胶电泳或者qPCRB能很容易地分辨出扩增产物的有无，从 而确定SNP基因型，目前市场主流为ARMS+qPCR技术，采用TaqMan探针进行检 测。(比如月中瘤靶向用药EGFR基因检测，CFDA批准的检测试齐1J盒，90%以上都 是ARMS检测方法)简而言之：引物3'端错配的碱基会导致PCR引物延伸速度变慢，当错配达 到一定程度时，引物延伸将终止，得不到特异长

4、度的 PCR扩增产物，从而提示模 板DNA没有与引物3'端配对的碱基，反之则有。Wild-type AS Primer(WP)VN小type Allele Template(WfT)o5f .hACTATG AG;*3 TG网 T AGGG TCC AA WMutant Allege TemplateM)0G5h . ACTATG * Xa1 ,.tgatag gt|gtccaa,&'0QMutant AS Primer(MP)EJkCTATG AA>3 T GAT AG < 著里口:5-ctatgX3T.TGATAG GG TC C A A.,5'

5、图 1.ARMS-PCR (AS-PCR)检测原理横向为针对W和M的两条上游引物，纵向为 W和M的DNA Template,可以看 出W引物只能特异性扩增W模板，M引物只能特异性扩增M模板。（在此基础上 又延伸出四引物ARMS-PCR技术（Tetra-Primer ARMS-PCR）:同时使用4条PCR 引物，两条3'末端位于SNP位点上的分属不同基因型的方向相反的内引物（innerPrimer）,两条位于SNP外侧并与SNP距离不等的外引物（outer Primei） , 4条引 物理论上如果都匹配的话，两两组合可扩增出 3条DNA产物（位于同一位点的两 内引物无法产生长片段扩增产物

6、，多为引物二聚体）。但若其中一条针对SNP的内引物不匹配，则只能扩增出另外两条DNA片段。由于外引物到达SNP距离不同， 扩增产物大小也就不同，通过电影根据局扩增产物的大小即可判断基因型，同时由外侧引物扩增的长片段产物可作为体系的阳性质控） 四、ARMS+TaqMan 探针+qPCR技术我们都清楚ARMS的简单原理，即理论上Taq DNA聚合酶必须在引物3'末 端碱基与模板完全互补情况下才能进行有效的聚合反应，但由于Taq DNA严谨性 受多因素影响，某些情况下，即使引物的 3'末端碱基与模板不互补，延伸仍然 可以进行（如果3'末端只有一个碱基的错配，那么是引物是可以错

7、配结合的并 可以进行延伸的，只是延伸的效率低于那些 3'末端正好配对的引物），而且不 同的3'末端错位（mismatch）有不同的延伸效率（如果在3'末端引入了其他的 错配碱基，那么错配的数目太多或达到一定程度， 那么3'末端无法进行延伸）， 因而仅靠引物3'末端一个碱基的错配不能充分而可靠地区分两个等位基因，进 而造成假阳性结果。为了提高引物延伸的特异性，可在3'端傕J数第2位或第3位碱基处引入一个 错配碱基，该错配碱基与3'末端的错配碱基共同作用，使引物在与其3'末端不 互补的模板中扩增产物率显著降低，而引物在与其 3'

8、;末端互补的模板中正常扩 增，引物的错配碱基类型取决于3'末端碱基错配类型。注意：当3'末端是“强”错配（A/G或G/T）时，可以在引物中引入一个“弱” 错配（C/A或C/T）;当3'末端是“弱”错配时，则需要在引物中引入一个“强 错配"；当3'末端是出“中度”错配（A/A、C/C、G/G、T/T）时，可以在引物 中再引入一个“中度”错配。一般在3'末端引入突变（倒数第3个碱基），可以 显著提高特异性。图2.提高引物特异性，引入错配碱基ARMS的特异性引物设计完成后，还需要一对等位基因特异性荧光共振能量 转移的TaqMan探针，TaqMan探针

9、分别连有两种不同的荧光染料，5'端为荧光基 团，3'端连有通用的荧光淬灭基团。一个完整的探针，淬灭基团和荧光基团在 空间上特别靠近而产生荧光淬灭。正常情况下检测不到5'端荧光基团发出的荧光，只能检测到3'端淬灭基团的背景荧光。在靶基因扩增过程中，PCR引物和荧 光标记探针在退火时均会与目标序列互补结合 （Probe Tm比较高，需在Primer之 前与DNA Template结合）。Taq酶在延伸模板链延伸时遇到与模板稳定结合的 探针，Taq酶的5' -3'外切核酸酶会将与模板结合的特异性探针降解，从而使探 针上的荧光基团因为物理空间分离， 淬灭

10、效应消失，发出荧光。如果荧光探针与 目标序列存在错配，就会大大减少荧光的释放量。后续通过软件分析处理荧光数 据而确定基因型。上褊引物3,图3.ARMS-TaqMan检测原理TaqMan-MGB探针技术是在TaqMan法基础上优化而成的一个SNP检测方法 (由普通TaqmanR车+和MGB基团两部分组成)，该探针的3'端结合了小沟结合 物(minor groove binder, MGB) , MGB与DNA螺旋的小沟(minor groove)契 合，通过稳定DNA双螺旋结构来提高杂交的准确性和稳定性。这使得探针长度进一步缩短，TM值较高，增加了探针的杂交稳定性，使结果更准确。该探针结

11、合 的为非荧光淬灭基因，这可大大降低荧光本底，提高反应灵敏度。MGB探针设计 应使SNP位点处于探针中间1/3范围内，尽量缩短MGB探针长度，但不少于13个3&oIHMChTAMRATm-65MGB5的所*h0=59(ATm = 6'C)Tm=49(ATm= 17*C图4.TaqMan-MGB检测原理比较项目ARMS*Tfltiiin:inT叫tnwMGB雷要的引物探针一则驯物,一普通Hqman探力一对川物,一对t蚪manMGR庆针SNP位点位丁上游引构M位点鼠卷位点在探针序列中前期优化成本及时长优化上游引物.序列固定.或本较低, 优化时间较短优化探针序列厅列小国足.成本 较岛

12、*优化忖间较长结果判法甩第CT龙皮或CT值TTh未物证应注等位点分型变阵.根据力:降分 布判读特异性来源手条上游引物筛选山最优引物探野组合1 圣士保证等型位中间的差异通过等位位点序则坦火温度TmfS第 异保吐耳星消除了非特异扩增灵地性来源前期优化时.资过独制模板量（1W- IQOOepicG保证桎需的F限取用XFQ作为淬天车溯.消除首曷 信号.增强氯敏度成县试剂息横索只需条探补，11探钟价格较低,成品 试刊片而成本低需要两条探针,不国修睢埠埼乳 成林试剂盍的成本1k拿印朝裔图5.ARMS方法与MGB方法对比ARMS方法灵敏度高，需要在qPCR±ffl过CT值进行判断，MGB方法灵敏度

13、 较高，PCR包完之后一般直接用qPCR扫版即可，会出现Cluster®现象，一般会有 三个簇，一簇野生，一簇杂合，一簇纯合突变。TaqMan系统有提供它自己的引物 /探针设计软件，即来自于 ABI的Primer Express 2.0这一款软件是实时荧光PCR实验中应用最广发的Oligo设计程序，其 可用于以TaqMan为探针标准的DNA PCR、RE-PCR、巢式PCR、等位基因特异的 PCR、多重PCR的寡核甘酸设计。该软件有一个引物校验文件，可根据其Tm值、 二级结构和形成引物二聚体的可能性， 来评价预先设计的引物。该软件除了适用 于TaqMan针外，也适用于TaqMan-M

14、GB探针，可为单个及多个（至48）序列设 计探针。五、ARMS-PCR法应用实例介绍比如现在有两名女性肺腺癌患者，检测 EGFR L858R突变后使用吉非替尼半 年，现在想看看是否耐药，需针对 EGFR T790M突变进行检测。我们采用ARMS-PCR方法进行检测，首先设计一对针对T790M突变位点的特 异性引物，外加一条TaqMan探针，然后加上mix混匀上qPCR佥测即可。qPCR检 测结果参考内参基因进行解读，通过baselin戌U线之后，确定产物ct值与内参基因 ct值的大小，如果ct值比内参ct值小，即是没有T790M突变，则为野生型，对吉非 替尼还是敏感的（见下图左侧）：如果 ct

15、值比内参ct值大，即是T790M突变，则（见下图右侧）。Amplrficaha Plat内参基因*、T790MD J皿口 -电ET790M内等基因、野生型,敏感 一,-7L-：|突变型;耐药图7. EGFR T790M突变检测市场上有些上市的 ARMS-PCR产品会添加Block （block其实就像普通的Taqman-MGB里面的MGB探针，一段Oligo序列，目的是封闭野生型提高检测的灵敏度），Block添不添加主要的决定因素是引物的特异性如何，如果特异性不好可以考虑添加Block提高检测灵敏度，其实引物足够好的话，block是不需要的。block的序列要有一定的特异性，也不一定要非常好，只要能影响PCR效率,就可以和引物一起去筛了，这个是完全从实验结果来说的，理论上的很多对block设计行不通，因为它是部分竞争。Block封闭一点突变没有关系，只要对突变的扩增效率影响比对野生的影响小，然后整体扩增效率能达到你要求就可以。block还是好筛的，关键还是引物，假阳性假阴性的关键都在前引物。野生型基因为突变型，对吉非替尼耐药，可使用 AZD9291Ampfefbcat