Chapter 04 基因组序列的功能解析

1、第四章第四章 基因组序列的功能解析基因组序列的功能解析第一节第一节 在基因组中识别基因在基因组中识别基因一、识别候选基因一、识别候选基因1. 生物信息分析基因的序列特征生物信息分析基因的序列特征双链双链DNA有有6个个 ORFs阅读方式阅读方式（1） 开放阅读框架开放阅读框架 (ORF，open reading frame)从起始密码至终止密码从起始密码至终止密码（2）ORF的平均长度的平均长度大肠杆菌：大肠杆菌：317 个密码个密码, 酵母菌：酵母菌：483个密码个密码, 人：约人：约 450个密码个密码. 在原核生物中直接寻找在原核生物中直接寻找ORF有效。有效。在真核生物中不能直接寻找在

2、真核生物中不能直接寻找ORF。在真核生物中不能直接寻找在真核生物中不能直接寻找ORF的原因：的原因： 62% 的人类基因被间隔开的人类基因被间隔开有内含子，有内含子，断裂基因断裂基因 许多外显子短于许多外显子短于100 个密码，甚至有些个密码，甚至有些少于少于50个密码个密码 （3）对）对 ORF扫描软件的修正扫描软件的修正1）密码偏爱）密码偏爱在某种生物中并不是所有密码都被均等使用。在某种生物中并不是所有密码都被均等使用。2）外显子）外显子-内含子边界内含子边界 3）上游调控序列）上游调控序列: CpG 岛岛: 4050% 的人类基因和脊椎动物基因的人类基因和脊椎动物基因中，中，5上游的上游

3、的GC含量高含量高 4）寻找同源序列）寻找同源序列 到其他模式生物中寻找同源序列。到其他模式生物中寻找同源序列。如果模式生物的同源序列已经被鉴定为某个功如果模式生物的同源序列已经被鉴定为某个功能基因的话能基因的话.主要用途是对新序列进行功能分析主要用途是对新序列进行功能分析. 2. 通过实验技术识别基因通过实验技术识别基因 检测是否转录检测是否转录RNA分子分子 .起始密码上游的数起始密码上游的数10个碱基，终止密码个碱基，终止密码下游的上百个碱基下游的上百个碱基. 包括：包括：（1）核酸杂交实验）核酸杂交实验 1）Northern blotting选择性剪接或者多基选择性剪接或者多基因家族都

4、能产生多个因家族都能产生多个RNA转录物转录物mRNA 一般都是从一个一般都是从一个组织或器官中得到的组织或器官中得到的用用Southern blot 把一个物种的把一个物种的DNA片断与相关片断与相关的其他物种的的其他物种的编码编码基因基因DNA杂交杂交Probe sample（2） cDNA 测序测序（3）PCR技术技术从从cDNA文库（文库（cDNA library）中筛选。）中筛选。1）RT-PCR (reverse transcriptase PCR) 2） RACE (rapid amplification of cDNA ends )（3） 寻找外显子寻找外显子-内含子边界内含子

5、边界.1）mRNA-DNA杂交杂交2）外显子捕获）外显子捕获需要特殊的载体需要特殊的载体二、确定某个基因的功能二、确定某个基因的功能1. 生物信息学分析预测基因功能生物信息学分析预测基因功能通过生物信息学分析和实验研究通过生物信息学分析和实验研究 .同源性查询同源性查询: 原理：原理：功能相似的基因具有相似的序列功能相似的基因具有相似的序列（1）序列同源性反映了共同祖先的进化关系）序列同源性反映了共同祖先的进化关系直系同源体直系同源体 （Orthologous）: 来自不同的物种的同源基因来自不同的物种的同源基因 旁系同源体（旁系同源体（Paraloguos）: 来自同一个生物的同源基因来自同

6、一个生物的同源基因 同源性分析揭示基因或片断的功能同源性分析揭示基因或片断的功能可以分析可以分析DNA序列，但一般需要把序列，但一般需要把DNA转化成转化成氨基酸序列氨基酸序列进行分析。进行分析。核酸序列核酸序列 76% 相同相同 (偶然事件偶然事件 ) 氨基酸序列只有氨基酸序列只有 28%相同！相同！ 1）完整序列比对）完整序列比对2）部分序列分析）部分序列分析寻找共同拥有的寻找共同拥有的结构域结构域（ domain）.如如 tudor domain 结构域是序列功能的核心。结构域是序列功能的核心。 （3）同源性分析在酵母基因组计划中的应用）同源性分析在酵母基因组计划中的应用 30% 是通过

7、同源性是通过同源性分析预测的分析预测的 酵母基因组含有约酵母基因组含有约 6000 个基因个基因, 其中其中30% 是是通过常规的遗传实验确定的通过常规的遗传实验确定的. 2. 用实验确定基因功能用实验确定基因功能（1） 通过基因失活分析基因功能通过基因失活分析基因功能将基因突变，观察由此引起的表型变化。将基因突变，观察由此引起的表型变化。1）同源重组失活）同源重组失活“Loss of function” 酵母的删除盒酵母的删除盒用抗生素抗性基用抗生素抗性基因替换酵母的某因替换酵母的某一处基因组序列一处基因组序列基因敲除（基因敲除（knock out）小鼠）小鼠胚胎干细胞（胚胎干细胞（ ES

8、cells） 注射到小鼠胚胎注射到小鼠胚胎 嵌合体嵌合体互相交配互相交配 纯合体敲除小鼠纯合体敲除小鼠 有些基因是至死基因，只有些基因是至死基因，只能得到杂合体能得到杂合体 2）非同源重组的基因失活）非同源重组的基因失活1）转座子标签：）转座子标签：把转座序列插入到基因中，使基因失活。把转座序列插入到基因中，使基因失活。 让转座子带上应答元件，在外界的诱导下让转座子带上应答元件，在外界的诱导下转座。转座。缺点：缺点：不能准确失活一个基因，因为转座是个随不能准确失活一个基因，因为转座是个随机事件。机事件。人工诱导转座：人工诱导转座：给给Ty1 的上游加上半乳糖诱导的启动子的上游加上半乳糖诱导的启

9、动子2）RNA干涉（干涉（RNA interference）与目标基因序列互补的短双链与目标基因序列互补的短双链RNA能降解目标基能降解目标基因的因的mRNA. 在线虫在线虫1号染色体上，号染色体上， 2769 个预测的基因个预测的基因中的中的2500 分别被进分别被进行了行了RNA干涉干涉缺点：在哺乳动物中只能对单细胞进行处理，因缺点：在哺乳动物中只能对单细胞进行处理，因为为RNA在体内的存在时间有限。在体内的存在时间有限。 （2） 通过基因超表达分析基因功能通过基因超表达分析基因功能 “Gain of function” 3. 未知基因编码的蛋白质功能的精细研究未知基因编码的蛋白质功能的精

10、细研究（1）定向突变）定向突变删除或改变基因序列中的一部分删除或改变基因序列中的一部分Site-directed mutagenesis(体外定点突变体外定点突变):删除一段删除一段插入一段插入一段突变个别碱基突变个别碱基 1 1）寡核苷酸定点突变）寡核苷酸定点突变2）同源重组导入突变基因）同源重组导入突变基因 两步取代：两步取代： 第一步第一步: 用标记用标记基因取代原基因基因取代原基因第二步第二步:用突变基用突变基因取代标记基因因取代标记基因 失去标记失去标记 获得标记获得标记 （2）报告基因（）报告基因（Reporter genes）和免疫组织化学）和免疫组织化学reporter gen

11、es 举例举例确定基因表达的部位和时空特征确定基因表达的部位和时空特征 .基因基因基因产物基因产物方法方法lacZ -半乳糖苷酶半乳糖苷酶组织化学组织化学 testuidA -葡糖苷酸酶葡糖苷酸酶组织化学组织化学 testlux 荧光素酶荧光素酶生物发光生物发光GFP绿色荧光蛋白绿色荧光蛋白荧光荧光2）免疫组织化学）免疫组织化学 测定待测基因的启动子测定待测基因的启动子确定基因产物在细确定基因产物在细胞内的位置胞内的位置研究不同组织的不同发育阶段、不同疾病的转研究不同组织的不同发育阶段、不同疾病的转录物和翻译产物录物和翻译产物三、三、 研究基因组的整体活性研究基因组的整体活性1. 研究转录物组

12、研究转录物组（1）基因表达系列分析（）基因表达系列分析（SAGE）鉴定细胞中的全部鉴定细胞中的全部mRNA 的相对丰度。的相对丰度。 把把cDNA序列与基因组序列比较序列与基因组序列比较 把把 mRNA 转为转为 cDNA 把把 cDNA 文库中的每个克隆都测序文库中的每个克隆都测序转录物组学转录物组学(transcriptomics )：是一门在整体水平上研究细胞中基因转录的情是一门在整体水平上研究细胞中基因转录的情况及转录调控规律的学科况及转录调控规律的学科. 12-bp 短序列足够特异短序列足够特异 412 = 16 777 216 bp Bsm FI切割切割 1014 bp的下游的下游

13、. 5-AGCT-3 从每个从每个cDNA末端释放平均长末端释放平均长度度 12 bp（2 2） 基因芯片基因芯片cDNADNA2. 研究蛋白质组研究蛋白质组研究一个细胞中全部蛋白质的技术。研究一个细胞中全部蛋白质的技术。（1）蛋白质组学）蛋白质组学 蛋白质电泳蛋白质电泳第一向第一向: 区分分子量的标准电泳区分分子量的标准电泳第二向第二向: 区分电荷的标准电泳区分电荷的标准电泳 双向凝胶电泳双向凝胶电泳: 质谱质谱 鉴定蛋白质点的性质鉴定蛋白质点的性质. 基质辅助激光解吸飞行时间质谱基质辅助激光解吸飞行时间质谱 (MALDI-TOF):质荷比质荷比 （Mass-to-charge ratio）

14、分析分子量，）分析分子量，然后推导氨基酸组成然后推导氨基酸组成（2）鉴定蛋白质的相互作用）鉴定蛋白质的相互作用如果知道位置蛋白与某个已知蛋白相互作用的话，如果知道位置蛋白与某个已知蛋白相互作用的话，就能推测其功能。就能推测其功能。 噬菌体展示噬菌体展示噬菌体展示文库噬菌体展示文库:将未知基因与噬菌体表面蛋白融合，表将未知基因与噬菌体表面蛋白融合，表达到噬菌体表面达到噬菌体表面 酵母双杂交系统酵母双杂交系统（3）蛋白质相互作用图）蛋白质相互作用图画出蛋白质组中所有组分的相互作用图。画出蛋白质组中所有组分的相互作用图。细菌细菌 Helicobacter pylori:画出了画出了1200 个相互作

15、用个相互作用 (占蛋白质组的一半）占蛋白质组的一半） 酵母酵母 1870 个蛋白之间的个蛋白之间的2240个相互作用个相互作用 Red dots are essential proteins orange lead to slow growth yellow dots are not knowngreen dots are non-lethal四、比较基因组学四、比较基因组学1. 通过比较基因组学作图通过比较基因组学作图 对一个物种的基因组的了解，可以帮助了解其对一个物种的基因组的了解，可以帮助了解其他物种的基因组他物种的基因组. 亲缘关系近的生物的基因组相似亲缘关系近的生物的基因组相似.同线型同线型 （Synteny）不同生物的基因顺序的部分或者完全保守不同生物的基因顺序的部分或者完全保守小麦小麦: 16 000 Mb 水稻水稻: 430 Mb 禾本科基因组禾本科基因组河豚鱼河豚鱼 : 400Mb基因数目相同基因数目相同人人 : 3500Mb可以根据小基因组中的基因顺序来寻找和可以根据小基因组中的基因顺序来寻找和发现大基因组的基因发现大基因组的基因2. 比较基因组学研究人类疾病比较基因组学研究人类疾病人疾病基因人疾病基因酵母同酵母同源物源物酵母基因的功能酵母基因的功能肌萎缩性脊髓侧索