紫外分光光度法蛋白酶酶活

1、紫外分光光度法蛋白酶酶活作者:日期:紫外分光光度法测蛋白酶酶活2013/1、原理蛋白酶在一定的温度与 pH条件下，水解酪素底物，然后加入三氯乙酸终止酶反应，并使未水解的酪素沉淀除去，滤液对紫外光有吸收， 可用紫外分光光度法测定。根据吸光度计算其酶活力。酶活单位的定义：每1mL粗酶液，在一定温度和pH值条件下，1min水解酪素产生1ug酪氨酸为一个酶活力单位，以（u/mL）表示。2、试剂和溶液三氯乙酸、氢氧化钠、盐酸、磷酸氢二钠、磷酸二氢钠、乳酸、乳酸钠、硼酸钠（硼砂）均 为分析纯，酪素、酪氨酸为生化试剂。1.1 三氯乙酸 c （CCL3 - COOH =0.4mol/L称取三氯乙酸65.4g

2、,用水溶解并定容至 1000 mLo1.2 氢氧化钠溶液 c （NaOH =0.5mol/L按GB601配制。1.3 盐酸溶液 c （HCD = 1 mol/L 及 0.1 mol/L1 mol/L H C L :取90mL浓盐酸溶解于去离子水中，定容至 1000mL0.1 mol/L H CL:取9mL浓盐酸溶解于去离子水中，定容至1000mL1.4 缓冲溶液a、磷酸缓冲液（pH= 7.5）适用于中性蛋白酶称取磷酸氢二钠（NaHPO- 12H2O） 6.02g和磷酸二氢钠（NaHPQ 12H2O） 0.5g ,加水溶解 并定容至1000mL3b、乳酸缓冲液（pH= 3.0）适用于酸性蛋白酶甲

3、液称取乳酸（80%90%） 10.6g,加水溶解并定容至 1000 mLo乙液称取乳酸钠（70%） 16g,加水溶解并定容至1000 mLo使用溶液取甲液8 mL,加乙液1 mL,混匀，稀释一倍，即成 0.05moi/L乳酸缓冲溶液。c、硼酸缓冲溶液（pH= 10.5）适用于碱性蛋白酶甲液称取硼酸钠（硼砂）19.08g ,加水溶解并定容至 1000 mLo乙液 称取氢氧化钠4.0g ,加水溶解并定容至 1000 mLo使用溶液取甲液500 mL、乙液400 mL混匀，用水稀释至 1000mL上述各种缓冲溶液，均须用pH计校正。1.5 10g/L酪素溶液称取酪素1.000g ,精确至0.001g

4、 ,用少量0.5mol/L氢氧化钠溶液（若酸性蛋白酶则用浓乳酸23滴）湿润后，加入适量的各种适宜pH的缓冲溶液约80 mL在沸水浴中边加热边搅拌，直到完全溶解，冷却后，转入100 mL容量瓶中，用适宜的pH缓冲溶液稀释至刻度。此溶液在冰箱内贮存，有效期为三天。1.6 100ug/mL L酪氨酸标准溶液a、称取预先于 105c干燥至值重的 L酪氨酸0.1000g ,精确至0.0002g ,用1mol/L盐酸60 mL溶解后定容至100 mL,即为1mg/mL酪氨酸标准溶液。b、吸取1mg/ mL酪氨酸标准溶液 10.00 mL,用0.1mol/L盐酸定容至100 mL,即得到100ug/ mL

5、L-酪氨酸标准溶液。此溶液在冰箱内贮存或立即使用。3 仪器和设备3.1 恒温水浴40±0.2C。3.2 紫外分光光度计应符合GB 9721的规定。4 分析步骤4.1 求K值按下表配制不同浓度的L-酪氨酸标准溶液，然后，直接用紫外分光光度计于275nm测定其吸光度（A）,以吸光度 A为纵坐标，酪氨酸的浓度 c为横坐标，绘制标准曲线（此线应通过零点），根据作图或用回归方程，计算出当吸光度为1时的酪氨酸的量（科g）,即为吸光常数K值；（其K值应在（130135）范围内）。管 号酪氨酸标准溶液的浓 度（g g/mL）取100ug/mL酪氨酸标准溶液的体积mL取水的体积mL吸光值Abs.000

6、1011019220283303744046550554.2 测定吸取适量稀释的酶?夜2.00mL、酪素2.00mL、三氯乙酸4.00 mL ,其它操作条件同福林法测定中的反应、静止沉淀，直到过滤。滤液用紫外分光光度计，在275nm波长下，用10mm比色皿，测定其吸光度（A）。a、先将酷素溶液放入 40±0.2 C恒温水浴中，预热 5min；b、按下列程序操作：试管A （空白）试管B （酶试样，需作三个平行试样）加酶液2.00 mL加酶液2.00 mL40±0.2C, 2min加三氯乙酸4.00 mL （摇匀）40±0.2 C, 10min （精确计时）加酪素2.

7、00mL（已预热）（摇匀）继续加热10min,过滤或离心于275nm波长，测上清液吸光值40±0.2C, 2min加酪素2.00mL（已预热）（摇匀）40±0.2 C, 10min （精确计时）加三氯乙酸4.00mL （摇匀）继续加热10min ,过滤或离心于275nm波长，测上清液吸光值c、1.398和166蛋白酶，除反应与显色温度为30±0.2C外，其它操作同 4.2 。标准曲线 作同样处理。5 计算在40 c下每毫升酶液每分钟水解酪蛋白产生1科g酪氨酸，定义为1个蛋白酶活力单位。X= AX KX 8/2 X 1/10 XnXE= 2/5 X AX KX nXE式中：X样品的酶活力，（u/mL）;A试样溶液的平均吸光度；K 吸光常数；8 反应试剂的总体积，mL2 吸取酶液 2.