丁苯酞通过抑制PGAM5介导的坏死性凋亡对试验性自身免疫性脑脊髓炎小鼠发挥保护作用

1、丁苯配通过抑制PGAM介导的坏死性凋亡对实验性自身免疫性脑脊髓炎小鼠发挥保护作用多发性硬化MS是中枢神经系统持久性的自身免疫性炎性、脱髓鞘疾病.多 发性硬化的病理特点是白质脱髓鞘、炎症、轴索损伤及血脑屏障的破坏.多发性硬化的病因至今未明,发病机制复杂,可能和病毒感染、遗传背景、环境 因素有关.因此,多发性硬化可能不仅单纯是一种疾病,而是综合征,表现为炎性脱髓 鞘及多种发病机制.由于多发性硬化的发病机制复杂,近年来,有研究认为,坏死性凋亡参与了多发性硬 化的发病机制.调节细胞死亡在机体的生长发育及维持组织动态平衡方面 起到重要作 用.坏死性凋亡是一种新型的调节坏死的通路,它是一种程序性的细胞死亡

2、.一直以 来,人们认为,凋亡是唯一的调节细胞死亡的方式,而坏死是不可调控的,是偶然的死亡 方式.近年来大量的证据说明,坏死性凋亡是调节坏死最好的方式之一.我们许多对坏死性凋亡通路的了解源于 TNF-a通路,TNF- a和TNFR1结合,然后激活下游 的坏 死小体RIPK1-RIPK3-MLKL最后由与线粒体相关的 PGAM5-DRP轴完成坏死性凋亡.丁苯酰是一种人工合成的复合物,源于芹菜籽的提取物.丁苯酰可以保护缺血引起的的脑组织损伤,对神经细胞的死亡起到保护作用,提升脑血流量,保护血 脑屏障, 除此之外,丁苯酰还有抗炎,抗血栓,抗凋亡,保护线粒体的作用,基于它 对线粒体 的保护作用,我们认为

3、丁苯儆可能对EAE对治疗有益.多发性硬化的模型不止一种,针对该疾病的研究方向不同,选择不同的疾病 模型. 实验性自身性免疫性脑脊髓炎 EAE 是多发性硬化最常应用的模型.我们的实验采用MOG35-5免疫C57BL/6小鼠制备EAE模型,观察丁苯醐干预 后, 是否对EAE小鼠起到了神经保护作用,沉默坏死性凋亡通路中的 PGAM基因,观察是 否保护了 EAE小鼠的神经功能.体外实验,培养BV2小胶质细胞,探讨丁苯 配对EAE 小鼠发挥神经保护作用的机制,找到该药的潜在治疗靶点.第一局部丁苯醐对实验性自身免疫性脑脊髓炎保护作用及对坏死性凋亡的影响目的：建立最经典的多发性硬化的小鼠模型,利用丁苯儆干预

4、,观察实验小鼠 发病后,对药物的反响,应用HE染色、电镜、Western Blot的方法,检测丁苯醐 是否对EAE小鼠 有神经保护作用及对坏死性凋亡通路中蛋白的影响.方法：1.实验小鼠的选用,建立动物模型.应用C57BL/6雌性小鼠,为8-10周龄,约为18-20g的体重,应用MOG35-55作为免 疫原,然后参加等体积的完全弗氏佐剂 CFA及一定含量的结核菌素相互 混,使结核 杆菌H37Ra的终浓度为4mg/ml,给予小鼠背部皮下注射,并分别于免疫 的当天及第2天, 分别分两次腹腔注射0.5ml百日咳毒素PTX,建立EAE小鼠模 型.2.将实验小鼠随 机分为正常对照组、EAE组及丁苯醐治疗组

5、.自发病后的第一天起,丁苯醐组小鼠每日腹腔注射丁苯醐 80mg/kg,正常对 照组小 鼠及EAE模型组小鼠自发病后的第1天起,每日给予等量的DMS及生理盐 水溶液腹 腔注射.3.自免疫后的第1天起,分别由两名实验员分两个时间段采用 双盲法于每天 早晚8： 00和16： 00两次对小鼠进行神经功能评分并称重.神经功能评分使用的是评分更为详细的Weave' s 15分法.4.组织病理学 观察用HE染色观察实验小鼠脊髓腰膨大处炎性细胞浸润情况.5.用透射电镜观察,实验小鼠线粒体的变化及髓鞘的变化.6.用WesternBlot的方法,检测各组实验小鼠坏死性凋亡通路上蛋白及炎症相关蛋白的表达变化

6、.7.采用SPSS19.0统计软件进行统计分析.计量资料以“均数土标准差x±s 表示.对数据进行正态性检验和方差齐性检验.多组计量资料均数的比拟应用Kruskal-Wallis检验,组间两两比拟用LSD检验.以P<0.05为差异具有统计学意义.结果:1. 丁苯醐干预EAE小鼠,可以缓解EAE/ 小鼠的临床病症,降低EAE/小鼠神经功能学评分；2. 丁苯醐药物干预EAE小鼠,可以减 少中枢神经系统的炎性细胞的浸润；3. 丁苯醐药物干预EAE/小鼠,通过透射电镜观察, 发现丁苯酰可以保护线粒体,减轻脱髓鞘的程度.4. 丁苯醐下调了坏死性凋亡通路上蛋白及炎性蛋白的表达：TNF

7、a和TNFR1表达较模型组下调RIPK1、RIPK3 MLKL表达较模型组下调PGAM5 DRP俵达较 模型 组下调,IL-1 B的表达较模型组下调.第二局部沉默 PGAM基因表达对实验 性自身免疫 性脑脊髓炎小鼠的影响目的：建立EAE的小鼠动物模型,沉默PGAM5基因,观察PGAM 基因沉默组和EAE小鼠模型组,脊髓炎性细胞浸润情况的变化,脊髓中 PGAM5,DRP1,p-DRP 蛋白表达的变化,PGAM5,TN a ,IL-1 B转录水平的变 化,并观察 线粒体及髓鞘在这个过程的变化.为沉默PGAM基因是否能保护EAE小鼠的神经功能提供理论依据.方法：1.实验 动物的选用,动物模型的建立.

8、选用清洁级的雌性C57BL/6小鼠作为实验动物,周龄大约为8-10周,体重大 约为 18-20g,应用MOG35-5作为免疫原,然后参加等体积的完全弗氏佐剂CFA及一定含量的结核菌素相互混,使结核杆菌H37Ra的终浓度为4mg/ml,给予小鼠 背部皮下注射, 并分别于免疫的当天及第 2天,分别分两次腹腔注射0.5ml百日咳 毒素PTX,建立EAE 小鼠模型.2.病理组织学的观察沉默的PGAM基因,干预EAE小鼠,在疾病的顶峰期,取 实验小鼠的脊髓腰膨大,用HE染色的方法,观察实验小 鼠脊髓腰膨大炎细胞浸润的情 况.3. Western Blot检测沉默的PGAM基因,干预EAE小鼠,取疾病顶峰

9、期实验 小鼠 的脊髓检测PGAM、DRP1 p-DRP1蛋白的表达水平的变化.4.qRT-PCR 方法检测 沉默的PGAM基因,干预EAE小鼠,取疾病顶峰期实验小鼠的脊髓,检测各 组PGAM、 TNFa、IL-1 B mRNA勺转录水平的变化.5.透射电镜观察沉默PGAM基因,在疾病的顶峰期取各组实验小数的脊髓,用透射电 镜观察实验小鼠线粒体及髓鞘的变化.6.采用SPSS19.0统计软件进行 统计分析.计量资料以“均数土标准差 x«表示.对数据进行正态性检验和方差齐 性检验.多组计量资料均数的比拟应用 Kruskal-Wallis检验,组问两两比拟用LSD检验.以 P<

10、0.05为差异具有统计学意义.结果:1.EAE模型组实验小鼠病理组织切片呈现出弥漫性的炎性细胞,EAE+PGAMShRNA fi炎性细胞明显减少.2.沉默PGAM基因,用Western blot在脊 髓组织中检测到,PGAM5勺表达,EAE组较正常对照组表达升高,在沉默组,表达明显低 于EAE组,在EAE组小鼠较正常对照组小鼠 DRP俵达上调,在沉默组,表达下调.P-DRP的表达,在EAE组较正常对照组降低,在PGAM沉默组较EAE组升高.3. 用qPCF检测PGAM5TNF a、IL-1 B在转录水平的表达变化,在EAE组中,PGAM5表 达较正常组升高,在PGAM沉默组,PGAM5勺表达水

11、平较EAE组降低TNFa的表达水平在EAE组较正常组上调,在PGAM沉默组较EAE组表达下调.IL-1 B mRN的转录水平在EAE组较正常组表达升高,在基因沉默组较EAE组表达 下调.4.沉默PGAM基因,EAE小鼠的脱髓鞘程度减轻,线粒体的结构相对完整.第 三 局部丁苯醐通过调制PGAM抑制小胶质细胞的坏死性凋亡目的：利用BV2小胶质细胞, 制造坏死性凋亡的模型,研究丁苯醐对坏死性凋亡通路中 PGAM5-DRFP由的作用,进一 步探讨丁苯醐治疗EAE小鼠的作用机制.方法:1.选取BV2小胶质细胞,将细胞培养于高糖DME培养基中,其中含有10%勺 胎牛血清、100 P g/ml的链霉素、10

12、0U/ml的青霉素.在恒定湿度的培养箱(温度37C , 含5%CO2中培养.2,坏死性凋亡的模型建立以及药物、病毒干预.把 BV2小胶质细胞分为7组,待细胞长到50%-60%寸,在第4组中参加腺病毒携带的沉默的 PGAM基因,第5组 中参加第4组的空病毒对照,第6组中参加腺病毒携带的过表达 PGAM基因,第7组 中参加过表达空病毒对照,21h,分别于第3、6、7组参加丁苯醐(10uM),24h,同时参加 造模药物TNF-a(50ng/ml)及Z-VAD-FMK(50umol/L),建立坏死性凋亡 模型,48h,收集7 组细胞,进行各项指标的检测.3,用qRT-PCR勺方法,检测不同组BV2细胞

13、中,IL-1 a和IL-1 B mRN的表达.4. Western Blot检测不同组 BV2细胞中)PGAM5 DRP1 p-DRP1 的蛋白表达5.采用 SPSS19.0统计软件进行统计分析.计量资料以“均数土标准差 (x太)表示.对数据进行正态性检验和方差齐性检验.多组计量资料均数的比拟应用 Kruskal-Wallis检验,组问两两比拟用LSD检验.以 P&lt；0.05为差异具有统计学意义.结果：1.在模型组中,IL-1 a mRN的转录水平较正常对照组表达上调.模型 +shPGAM组IL-1 a mRN的转录水平较模型组表达下调.模型+shPGAM空病毒对照组IL-1 a

14、mRN的转录水平较模型组未见明显差异.模型+ 丁苯醐组IL-1 amRNA勺转录水平较模型组明显下调.模型+NBP过表达PGAM腺病毒组IL-1 amRN的转录水平较模型组表达无明 显差 异.模型+NBP过表达空病毒对照组IL-1 amRNA勺转录水平较模型组表达下 调.2.应用PCR方法,检测IL-1 B在mRNA勺转录水平的变化.在模型组中,IL-1 B mRN 转录水平较正常对照组表达上调.模型+shPGAM组IL-1 B mRN的转录水平较模型组表达下调. 模型+shPGAM5空 病毒对照组IL-1 B mRNA勺转录水平较模型组未见明显差异.模型+ 丁苯醐组的IL-1 B mRNA勺

15、转录水平较模型组表达下调.模型 +NBP过 表 达PGAM腺病毒组IL-1 B mRNA勺转录水平较模型组表达无明显差异.模型+NBP过表达空病毒对照组IL-1 B mRNA勺转录水平较模型组表达下调.3.用Western Blot的方法检测7组细胞PGAM蛋白表达情况：在模型组中,PGAM5勺 蛋白表达水平较正常对照组上调.模型+shPGAM组PGAM的蛋白表达水平较模型组下调.模型 +shPGAM空病毒 对照组较模型组PGAM的蛋白表达水平较模型组未见明显差异.模型+ 丁苯醐组PGAM的蛋白表达水平较模型组下调.模型 +NBP过表达PGAM腺病毒组PGAM的蛋白表达水平较模型组表达无明显差

16、异.模型+NBP过表达空病毒对照组PGA M的蛋白表达水平较模型组表达下调4,用Western Blot的方法检测7组细胞DRP1蛋白表达情况：在模型组中DRP1的 蛋白表达水平较正常对照组明显上调.模型+shPGAM组DRP1的蛋白表达水平较模型组下调.模型 +shPGAM空病毒 对 照组较模型组DRP1的蛋白表达水平较模型组未见明显差异.模型+ 丁苯醐组DRP1的蛋白表达水平较模型组下调.模型+NBP过表达PGAM5腺 病毒组DRP1的蛋白表达水平较模型组表达无明显差异.模型+NBP过表达空病毒对照组DRP1的蛋白表达水平较模型组表达下调.5.用Western Blot的方法检测7组细胞p-DRP1蛋白表达情况：在模型组中,p-DRP1的蛋 白表达水平较正常对照组下调.模型+shPGAM组p-DRP1的蛋白表达水平较模型组上调.模型 +shPGAM空病 毒 对照组较模型组p-DRP1的蛋白表达水平较模型组未见明显差异.模型+ 丁苯醐组P-DRP1的蛋白表达水平较模型组上调. 模型+NBP过表达PGAM 腺病毒组p-DRP1的蛋白表达水平较模型组表达无明显差异.模型+NBP过表达空病毒对照组D