菘蓝指纹图实验设计方案

1、菘蓝指纹图实验设计方案水溶性成分的分析用高效液相色谱法2.1实验材料：菘蓝的实生苗（根、茎、叶），组培苗（愈伤组织、不定芽） 2.2实验方法：2.2.1 取新鲜的实验材料用蒸馏水洗干净放入烘干机里烘干，研成粉末。2.2.2 粉末过40目筛，用电子分析天平精密称取样品1.0g，置50mL锥形瓶中， 加（甲醇、50%甲醇、75%甲醇、水），超声提取1h。2.2.3 离心取上清液，0.22 µm微孔滤膜滤过，取续滤液，用旋转蒸发仪浓缩后 用20ml甲醇溶解。2.2.4 于高效液相色谱仪中分析，进样前将样液用0.22µm的微孔滤膜过滤液相色谱条件：1、 流速：0.3 ml/min、

2、0.6ml/min、1.0 ml/min2、进样量：5µl、10µl3、用DAD进行全波长扫描（210400nm） 4、柱温：255、流动相：甲醇（A）：水（B）梯度洗脱t/min甲醇水0590%10%52080%20%204575%25%456510%90% 流动相: pH6 .4，0.1mol/l的醋酸钠缓冲液( A )-乙腈 ( B ) , 梯度洗脱t/min0.1mol/l醋酸钠缓冲液乙腈0597%3%54595%5%455570%30%556560%40%氨基酸成分的分析用高效液相色谱法2.1实验材料：菘蓝的实生苗（根、茎、叶），组培苗（愈伤组织、不定芽） 2.2

3、实验方法：2.2.1 取新鲜的实验材料用蒸馏水洗干净放入烘干机里烘干，研成粉末。2.2.2 粉末过40目筛，用电子分析天平精密称取样品1.0g，置50mL锥形瓶中， 加（甲醇、50%甲醇、75%甲醇、水），超声提取1h。2.2.3 离心取上清液，0.22 µm微孔滤膜滤过，取续滤液，用旋转蒸发仪浓缩后 用20ml甲醇溶解。2.2.4 取上述样品2mL于10mL离心管中，加入衍生化试剂1mL，干燥试剂1mL， 旋涡混合1min，放置1h，加入正己烷4mL，旋涡混合1min，静置10min， 吸取下层溶液过0.22µm微孔滤膜，于高效液相色谱仪中分析。2.3溶液的制备2.3.1

4、 样品溶液制备 配制0.1mol /L异硫氰酸苯酯( PITC) -乙腈溶液( 12:988) 适 量于棕色瓶中摇匀，作为衍生化试剂，需每日更换配制1.0mol /L三乙胺- 乙腈溶液( 139:861) 作为干燥试剂。2.3.2 对照品衍生化溶液:分别精密称取Arg、Pro、Glu、Tyr各适量，根据各样 品含量，用（50%、100%）甲醇配制适宜的混合对照品溶液备用。精密吸 取混合对照品2mL于10mL离心管中，加入衍生化试剂1mL，干燥试剂 1mL，旋涡混合1min，放置1h，加入正己烷4mL，旋涡混合1min，静置 10min，吸取下层溶液过0.22µm微孔滤膜。2.3.3

5、空白样品对照:精密吸取（50%、100%）甲醇2mL于10mL离心管中，加 入衍生化试剂1mL，干燥试剂1mL，旋涡混合1min，放置1h，加入正己 烷4mL，旋涡混合1min，静置10min，吸取下层溶液过0.22µm微孔滤膜。液相色谱条件：1、流速：0.3 ml/min、0.6ml/min、1.0 ml/min2、进样量：5µl、10µl3、用DAD进行全波长扫描（210400nm） 4、柱温：255、流动相: pH6 .4，0.1mol/l的醋酸钠缓冲液( A )-乙腈 ( B ) , 梯度洗脱t/min0.1mol/l醋酸钠缓冲液乙腈0597%3%5459

6、5%5%455570%30%556560%40%挥发油的分析采用GC-MS联用技术主要成分：十四酸（肉豆范酸)、十六酸（棕棕榈酸)2.1实验材料：菘蓝的实生苗（根、茎、叶），组培苗（愈伤组织、不定芽） 2.2实验方法：2.2.1 挥发油的提取：2.2.1.1 水蒸气蒸馏法，1g板蓝根粉末约得2.5mg挥发油。 称取过40目筛的60 g的实验实生苗、组培苗粉末于圆底烧瓶中，加入180 mL 80的蒸馏水搅拌均匀，装好蒸馏装置，加热提取6 h，馏出物为水提取液。水提液用石油醚萃取，石油醚层用无水硫酸钠干燥（V/g=10:1），过滤得板蓝根挥发油-石油醚溶液，再用旋转蒸发仪旋干溶剂石油醚，挥发油。粉

7、末g水ml加热温度提取时间h2010080630100806601008062015080630150806601508062018080630180806601808062010010063010010066010010062015010063015010066015010062018010063018010066018010062.2.1.2 乙醇溶剂连续回流法（索式提取法） 1g板蓝根粉末约得8.33mg挥发油。 称取过40目筛的60 g粉末，用干净的纱布包紧后塞进提取器中，每次加入200 mL的80%乙醇作为溶剂，80 恒温水浴锅中回流6 h，提取两次，合并提取液，过滤产物，得乙醇提取

8、液，用石油醚萃取，石油醚层用无水硫酸钠干燥（V/g=10:1），过滤得板蓝根挥发油-石油醚溶液，再用旋转蒸发仪旋干溶剂石油醚，制得挥发油。粉末g乙醇75%ml加热温度提取时间h201008063010080660100806201508063015080660150806202008063020080660200806粉末g乙醇80%ml加热温度提取时间h201008063010080660100806201508063015080660150806202008063020080660200806色谱条件:色谱柱载气:氦气;进样口温度:250;检测器温度:280;进样体 积:1.0µ

9、L;流速:1.0ml/min;分流比:20:l、40:1;炉温:a.60(保持10min)-240(保持5min)(4/min); b.60(保持15min)-240(保持5min)(5o/min); c.60(保持10min)-80(保持3min);80一160(保持3min);160-240(保持5min)(4/min)质谱条件:电离方式:EI源;电子能量:（70ev、90ev）;离子源温度:200;质量范围 (m/z):30-450amu、30-500amu;扫描间隔:0.5s/scan。2.4精密度试验 精密吸取同一供试品溶液10 L，按以上色谱条件连续进样6次， 记录色谱图，计算其各

10、共有峰的相对保留时间及相对峰面积的RSD，如果小 于5%，则表明仪器精密度良好。 2.5重复性试验 取粉末6份，分别按上述方法制备供试品溶液，进样，记录色 谱图，计算其各共有峰的相对保留时间及相对峰面积的RSD均小于5%，则 表明该方法重复性良好。2.6稳定性试验 精密吸取同一供试液10 L，分别在0，6，12，24h进样，记 录色谱图，计算其各共有峰的相对保留时间及相对峰面积的RSD均小于5%， 则表明供试品溶液在24h内稳定。 2.7建立指纹图谱 采用中国药典委员会出版的中药色谱指纹图谱相似度评价 软件( 2.0版) 进行相似度计算。设置第2批样品图谱为参照物图谱，对照图 谱生成方法采用中

11、位数法，多点校正后自动匹配，生成对照指纹图谱。2.8指纹图谱的聚类分析 应用软件SPSS17.0系统聚类法，对板蓝根的HPLC 图谱中各特征峰的相对峰面积进行分析，以欧氏平方距离为测度的聚类图。讨论3.1 提取方法及溶剂的选择3.1.1水溶性成分: 对不同浓度的提取溶剂( 甲醇50%甲醇水)进行了考察，提取 峰分离较好，达到基线分离，效果最好。因此，选择提取。3.1.2氨基酸成分: 对不同浓度的提取溶剂( 甲醇50%甲醇水)进行了考察，提取 峰分离较好，达到基线分离，效果最好。因此，选择提取。3.1.3挥发油成分：对不同提取方法（水蒸气蒸馏法、索氏提取法）对不同浓度的提取溶剂( 75%、80%乙醇) 提取样品质量（20g、30g、60g） 进行了考察，最终提取峰分离较好，达到基线分离，效果最好。因此，选择提取。3.2 内参照峰的选定3.2.1 水溶性成分 菘蓝药材中含有腺苷、表告依春、靛蓝、靛玉红等化学成分， 在本实验条件下，采用作为内参照峰，所得相似度结果均大于，各特征色 谱峰均能很好地对齐。3.2.2