色谱柱相关知识

1、色谱柱相关知识1、色谱柱的使用说明：（1）色谱柱使用前注意事项： 色谱柱的储存液无特殊说明， 均为评价报告所示的流动相。 在使用前， 一定要注意色谱柱的 储存液与要分析样品的流动相是否互溶。 在反相色谱中， 如用高浓度的盐或缓冲液作洗脱剂， 应先用 10左右的低浓度的有机相洗脱剂过渡一下，否则缓冲液中的盐在高浓度的有机相 中很容易析出，堵塞色谱柱。（2）流动相：流动相中所使用的各种有机溶剂要尽可能使用色谱纯， 配流动相的水最好是超纯水或全玻璃 器皿的双蒸水。如果将所配得流动相再经过ym的滤膜过滤一次则更好，尤其是含盐的流动相。另外，装流动相的容器和色谱系统中的在线过滤器等装置应该定期清洗或更换

2、。以常规硅胶为基质的键合相填料通常的PH值适用范围是，BDS C18适合于碱性化合物，PH值适用范围为。 当必须要在 PH 值适用范围的边界条件下使用色谱柱时，每次使用结束后立 即用适合于色谱柱储存并与所使用的流动相互溶的溶剂清洗，并完全置换掉原来所使用的流动相。（3）样品：样品也要尽可能清洁，可选用样品过滤器或样品预处理柱（SPE）对样品进行预处理；若样品不便处理，要使用保护柱。在用正相色谱法分析样品时，所有的溶剂和样品应严格脱水。2、色谱柱的保存？（1 ）反相色谱柱每天实验后的保养：使用缓冲液或含盐的流动相， 实验完成后应用 10%的甲醇 /水冲洗 30 分钟， 洗掉色谱柱中的 盐，再用甲

3、醇冲洗 30 分钟。注意：不能用纯水冲洗柱子，应该在水中加入10%的甲醇，防止将填料冲塌陷。（ 2 ）长期保存色谱柱： 如色谱柱要长时间保存，必须存于合适的溶剂下。对于反相柱可以储存于纯甲醇或乙腈中， 正相柱可以储存于严格脱水后的纯正己烷中， 离子交换柱可以储存于水 （含防腐剂叠氮化钠 或柳硫汞）中，并将购买新色谱柱时附送的堵头堵上。储存的温度最好是室温。3、色谱柱的再生？因为色谱柱是消耗品， 随着使用时间或进样次数的增加， 会出现色谱峰高降低， 峰宽加大或 出现肩峰的现象，一般来说可能是柱效下降。1）反相柱的再生：依次采用 20-30倍的色谱柱体积的甲醇：水 =10：90 （V/V ） ，乙

4、腈， 异丙醇作为流动相冲洗色谱柱，完成后再以相反顺序冲洗色谱柱。（2）正相柱的再生：依次以 20-30 倍色谱柱的体积的正己烷、异丙醇、二氯甲烷、甲醇作 为流动相冲洗色谱柱，然后再以相反的顺序冲洗色谱柱。要注意上述溶剂必须严格脱水。4、色谱柱在使用过程中易出现的问题和解决办法？色谱柱在使用中最常见的问题就是柱压升高， 如果柱压是在长时间使用过程中缓慢增加， 属 于正常现象。但柱压在使用过程中突然升高（系统管路堵塞及压力传感器故障除外） ，可能 的原因有如下几点： （1）色谱柱头的过滤筛板堵塞或污染；（2）色谱柱头的填料被样品污染；（3）色谱柱内缓冲液中的盐遇到高浓度的甲醇或其他有机溶剂，形成结

5、晶析出；（4）流动相 PH 值过大或过小使固定相结构破坏或溶解。 解决办法如下：（1）如确定是色谱柱头的过滤筛板被污染，可以将色谱柱反方向用甲醇冲洗至正常压力， 或者卸下色谱柱头，将其放在 10的稀硝酸内超声清洗 10 分钟，后再用纯水超声 10 分钟， 重新装入色谱柱。（2）如确定色谱柱头的填料被污染，将柱头螺丝卸下，挖出柱内前段被污染的填料，用相 同的柱填料重新填入，仔细修复后，重新安装上柱头螺丝。（3）如确定定是盐结晶， 用 10% 的甲醇 /水冲洗色谱柱使柱内盐全部溶解， 再换高浓度甲醇。（4）如果因 PH 值使用不当，很难恢复。液相色谱的柱子通常分为正相柱和反相柱。正相 柱大多以硅胶

6、为柱，或是在硅胶表面键合 -CN,-NH3 等官能团的键合相硅胶柱；反相柱填料 主要以硅胶为基质，在其表面键合非极性的十八烷基官能团（ODS ）称为 C18 柱，其它常用的反相柱还有 C8,C4,C2 和苯基柱等。另外还有离子交换柱， GPC 柱，聚合物填料柱等。 本文重点介绍反相色谱柱的选择和使用： 一、反相色谱柱的选择 1柱子的 PH 值使用范围反相柱优点是固定相稳定，应用广泛，可使用多种溶剂。但硅胶为基质的填料，使用时一 定要注意流动相的 PH 范围。一般的 C18 柱 PH 值范围都在 2-8，流动相的 PH 值小于 2 时， 会导致键合相的水解；当 PH 值大于 7 时硅胶易溶解；经

7、常使用缓冲液固定相要降解。一旦 发生上述情况， 色谱柱人口处会塌陷。 同样填料各种不同牌号的色谱柱不尽相同。 如果流动 相 PH 较高或经常使用缓冲液时，建议选择 PH 范围大的柱子，例如戴安公司的 Acclaim 柱 PH 2-9 或 Zorbax 的 PH 2-11. 5 的柱子。2填料的端基封尾（或称封口）把填料的残余硅羟基采用圭寸口技术进行端基圭寸尾，可改善对极性化合物的吸附或拖尾；含 碳量增高了，有利于不易保留化合物的分离；填料稳定性好了，组分的保留时间重现性就好。如果待分析的样品属酸性或碱性的化合物，最好选用填料经端基封尾的色谱柱。1、进样量柱子的最大载样量取决于：柱子的型号，使用

8、的条件和样品的类型， 很难给出一个一般的指示。对于进样体积的建议则比较容易（见表中的典型值）。注射了太大体积或太浓的样品会使色谱柱过载，导致峰展宽，变形或者峰融合。柱尺寸內経）最大释品侬穆* 10pl±応迅±50ul250 X 10., Oimii兰 250pl2、流量和压力柱内径（毫栄）聽速(jil/jim )最僅2.00.21.0玄00,-42.01413. C4.7注意最高压力：不锈钢柱 <4500psi;玻璃柱<3000psi增加流速或者降低流速要采取小的间隔变化以防止填充床的扰动。如果你想更换柱子，要降低流量至0，等待洗脱液完全流出柱子为止（2分钟）。

9、拆除柱子而没有等待压力的降低会损坏柱子。高柱压的产生一般是由于不正确地使用柱子的结果。使用保护柱会防止污染物沉积在分析柱上。HPLC使用注意事项1流动相必须用 HPLC级的试剂，使用前过滤除去其中的颗粒性杂质和其他物质（使用或更细的膜过滤）。？2流动相过滤后要用超声波脱气，脱气后应该恢复到室温后使用。3不能用纯乙腈作为流动相，这样会使单向阀粘住而导致泵不进液。4使用缓冲溶液时，做完样品后应立即用去离子水冲洗管路及柱子一小时，然后用甲醇（或甲醇水溶液）冲 洗40分钟以上，以充分洗去离子。对于柱塞杆外部，做完样品后也必须用去离子水冲洗20ml以上。5长时间不用仪器，应该将柱子取下用堵头封好保存，注

10、意不能用纯水保存柱子，而应该用 有机相（如甲醇等），因为纯水易长霉。6每次做完样品后应该用溶解样品的溶剂清洗进样器。柱绝对不能进蛋白样品，血样、生物样品。8堵塞导致压力太大，按预柱 t混合器中的过滤器 t管路过滤器t单向阀检查 并清洗。清 洗方法；以异 丙醇作溶剂冲洗：放在异丙醇中间用超声波清洗；用10%稀硝酸清洗。9气泡会致使压力不稳，重现性差，所以在使用过程中要尽量避免产生气泡。10如果进液管内不进液体时，要使用注射器吸液：通常在输液前要进行流动相的清洗。11. 要注意柱子的PH值范围，不得注射强酸强碱的样品，特别是碱性样品。12. 更换流动相时应该先将吸滤头部分放入烧杯中边振动边靖洗，然

11、后插入新的流动相中。更换无互溶性的流动相时要用异丙醇过渡一下。高效液相色谱常见故障的断定及解决诊状可能的原因 解决 方法？（一）保留时间变化？1柱温变化 柱恒温，必要时需配置恒温箱2等度与梯度间未能充分平衡至少用10倍柱体积的流动相平衡柱3缓冲液容量不够 用25mmol/L的缓冲液4柱污染每天冲洗柱5柱内条件变化稳定进样条件，调节流动相6.柱快达到寿命 采用保护柱（二）保留时间缩短？1. 流速增加检查泵，重新设定流速2. 样品超载降低样品量3. 键合相流失流动相PH值保持在3"检查柱的方向4. 流动相组成变化防止流动相蒸发或沉淀5. 温度增加柱恒温（三）保留时间延长？1. 流速下降

12、管路泄漏，更换泵密封圈，排除泵内气泡2. 硅胶柱上活性点变化 用流动相改性剂，如加三乙胺，或采用碱至钝化3. 键合相流失同前（二）34. 流动相组成变化同前（二）45. 温度降低同前（二）5（四）出现肩峰或分* ？1. 样品体积过大 用流动相配样，总的样品体积小于第一峰的15%2. 样品溶剂过强采用较弱的样品溶剂3. 柱塌陷或形成短路通道更换色谱柱，采用较弱腐蚀性条件4. 柱内烧结不锈钢失效 更换烧结不锈钢，加在线过滤器，过滤样品5. 进样器损坏更换进样器转子（五）鬼峰1. 进样阀残余峰 每次用后用强溶剂清洗阀，改进阀和样品的清洗2. 样品中未知物处理样品3. 柱未平衡重新平衡柱，用流动相作样

13、品溶剂（尤其是离子对色谱）4. 三氟乙酸（TFA）氧化（肽谱）每天新配，用抗氧化剂5. 水污染（反相）通过变化平衡时间检查水质量，用HPLC级的水（六）基线噪声？1. 气泡（尖锐峰）流动相脱气，加柱后背压2. 污染（随机噪声）清洗柱，净化样品，用 HPLC级试剂3. 检测器灯连续噪声 更换氘灯4. 电干扰（偶然噪声）采用稳压电源，检查干扰的来源（如水浴等）5. 检测器中有气泡流动相脱气，加柱后背压（七）峰拖尾？1. 柱超载降低样品量，增加柱直径采用较高容量的固定相2. 峰干扰清洁样品，调整流动相3硅羟基作用加三乙胺，用碱致钝化柱增加缓冲液或盐的浓度降低流动相PH值，钝化样品4同前（四）4同前（

14、四）45同前（四 ）3 5同前（四 ）36死体积或柱外体积过大连接点降至最低，对所有连接点作合适调整，尽可能采用细内径的连接管7柱效下降 用较低腐蚀条件，更换柱，采用保护柱（八）峰展宽？1进样体积过大 同（四）12在进样阀中造成峰扩展 进样前后排出气泡以降低扩散3数据系统采样速率太慢 设定速率应是每峰大于 10点4检测器时间常数过大 设定时间常数为感兴趣第一峰半宽的10%5流动相粘度过高增加柱温，采用低粘度流动相6检测池体积过大用小体积池，卸下热交换器7保留时间过长等度洗脱时增加溶剂含量也可用梯度洗脱8柱外体积过大将连接管径和连接管长度降至最小9样品过载 进小浓度小体积样品液相色谱柱使用经验谈

15、色谱柱在使用前，最好进行柱的性能测试，并将结果保存起来， 作为今后评价柱性能变化的参考。但要注意：柱性能可能由于所使用的样品、流动相、柱温等条件的差异而有所不同； 另外，在做柱性能测试时是按照色谱柱出厂报告中的条件进行（出厂测试所使用的条件是最佳条件），只有这样，测得的结果才有可比性。？1、样品的前处理：？a、最好使用流动相溶解样品。？b、使用予处理柱除去样品中的强极性或与柱填料产生不可逆吸附的杂质。？c、使用祄的过滤膜过滤除去微粒杂质。？2、流动相的配制：液相色谱是样品组分在柱填料与流动相之间质量交换而达到分离的目的， 因此要求流？动相具备以下的特点：？a、 流动相对样品具有一定的溶解能力，

16、保证样品组分不会沉淀在柱中（或长时间保留在柱中）。？b、 流动相具有一定惰性，与样品不产生化学反应（特殊情况除外）。？c、流动相的黏度要尽量小，以便在使用较长的分析柱时能得到好的分离效果；同时降低柱压降，延长液体泵的使用寿命 （可运用提高温度的方法降低流动相的黏度）。？d、 流动相的物化性质要与使用的检测器相适应。如使用UV检测器，最好使用对紫外吸收 较低的溶剂配制。？e、流动相沸点不要太低，否则容易产生气泡，导致实验无法进行。？f、在流动相配制好后，一定要进行脱气。除去溶解在流动相中的微量气体既有利于检测， 还可以防止流动相中的微量氧与样品发生作用。2、流动相流速的选择：因柱效是柱中流动相线

17、性流速的函数，使用不同的流速可得到不同的柱效。对于一根特定的色谱柱，要追求最佳柱效，最好使用最佳流速。对内径为4.6mm的色谱柱，流速一般选择 1ml/min，对于内径为4.0mm柱，流速/ min为佳。当选用最佳 流速时，分析时间可能延长。可采用改变流动相的洗涤强度的方法以缩短分析时间（如使用反相柱时，可适当增加甲醇或乙腈的含量）。？注意：？a. 由于甲醇廉价，对于反相柱推荐使用甲醇体系（必须使用乙腈的场合除外）。？b. 对于正相柱推荐使用沸程为30-60 C的石油醚或提纯后的己烷作流动相，没有提纯的己烷不得使用。用水最好使用超纯水（电阻率大于18兆欧），去离子水及双蒸水中含有酚类杂质，有可

18、能影响分析结果。？c. 含水流动相最*在实验前配制，尤其是夏天使用缓冲溶液作为流动相不要过夜。最好加入 叠氮化钠，防止细菌生长。？d. 流动相要求使用祄滤膜过滤，除去微粒杂质。？e. 使用HPLC级溶剂配制流动相，使用合适的流动相可延长色谱柱的使用寿命，提高柱性 能HPLC的常用术语第一部分色谱曲线？1、romatogram ）:色谱柱流出物通过检测器系统时所产生的响应信号对时间或流动相流出体积的曲线图，或者通色谱图（ch过适当的方法观察到的纸色谱或薄层色谱斑点、谱带的分布图。2、（色谱）峰（chromatographic peak）：色谱柱流出组分通过检测器系统时所产生的响应信号的微分曲线。

19、此主题相关图片如下：此主题相关图片如下：3、峰底（peak base）：峰的起点与终点之间的连接的直线（图 1中的CD ）。4、峰高（h , peak height）：色谱峰最大值点到峰底的距离（图 1中的BE）。5、峰宽（W , peak width）:在峰两侧拐点（图 1中的F , G）处所作切线与峰底相交两 点的距离（图 1中的KL ）。6、半高峰宽（W h/2 , peak withd at half height）:通过峰高的中点作平行于峰底的直线， 此直 线与峰两侧相交两点之间的距离（图 1中的HJ）。7、峰面积（A , peak area）：峰与峰底之间的面积（图 1中的CHEJ

20、DC ）。8、拖尾峰（tailing peak）:后沿较前沿平缓的不对称的峰。9、 前伸峰（leadi ng peak）：前沿较后沿平缓的不对称的峰。（又叫伸舌峰、前延峰）10、假峰（ghost peak）:除组分正常产生的色谱峰外，由于仪器条件的变化等原因而在谱图上出现的色谱峰，即并非由试样所产生的峰。这种色谱峰并不代表具体某一组分，容易给定性、定量带来误差。（又叫鬼峰）11、 畸峰（distrorted peak）：形状不对称的色谱峰，前伸峰、拖尾峰都属于这类。？12、反峰（n egative peak）：也称倒峰、负峰，即出峰的方向与通常的方向相反的色谱峰。柱的使用和维护注意事项（推荐）

21、色谱柱的正确使用和维护十分重要，稍有不慎就会降低柱效、缩短使用寿命甚至损坏。在色谱操作过程中，需要注意下列问题，以维护色谱柱。 避免压力和温度的急剧变化及任何机械震动。温度的突然变化或者使色谱柱从高处掉下都会影响柱内的填充状况；柱压的突然升高或降低也会冲动柱内填料，因此在调节流速时应该缓慢进行，在阀进样时阀的转动不能过缓（如前所述）。2应逐渐改变溶剂的组成，特别是反相色谱中，不应直接从有机溶剂改变为全部是水，反之 亦然一般说来色谱柱不能反冲，只有生产者指明该柱可以反冲时， 才可以反冲除去留在柱头的杂质。否则反冲会迅速降低柱效。 选择使用适宜的流动相（尤其是pH），以避免固定相被破坏。有时可以在

22、进样器前面连接一预柱，分析柱是键合硅胶时， 预柱为硅胶，可使流动相在进入分析柱之前预先被硅胶"饱和"，避免分析柱中的硅胶基质被溶解。 经常用强溶剂冲洗色谱柱， 清除保留在柱内的杂质。 在进行清洗时，对流路系统中流动相的置换应以相混溶的溶剂逐渐过渡，每种流动相的体积应是柱体积的20倍左右，即常规分析需要50"75ml。下面列举一些色谱柱的清洗溶剂及顺序，作为参考：硅胶柱以正已烷（或庚烷）、二氯甲烷 和甲醇依次冲洗，然后再以相反顺序依次冲洗，所有溶剂都必须严格脱水。甲醇能洗去残留的强极性杂质，已烷使硅胶表面重新活化。反相柱以水、甲醇、乙腈、一氯甲烷（或氯仿） 依次冲洗

23、，再以相反顺序依次冲洗。如果下一步分析用的流动相不含缓冲液，那么可以省略最后用水冲洗这一步。一氯甲烷能洗去残留的非极性杂质，在甲醇（乙腈）冲洗时重复注射100"200祃四氢呋喃数次有助于除去强疏水性杂质。四氢呋喃与乙腈或甲醇的混合溶液能除 去类脂。有时也注射二甲亚砜数次。此外，用乙腈、丙酮和三氟醋酸（% ）梯度洗脱能除去蛋白质污染。阳离子交换柱可用稀酸缓冲液冲洗，阴离子交换柱可用稀碱缓冲液冲洗，除去交换性能强的盐，然后用水、甲醇、二氯甲烷（除去吸附在固定相表面的有机物）、甲醇、 水依次冲洗。 保存色谱柱时应将柱内充满乙腈或甲醇，柱接头要拧紧，防止溶剂挥发干燥。绝对禁止将缓冲溶液留在柱内静置过夜或更长时间。 色谱柱使用过程中， 如果压力升高，一种可能是烧结滤片被堵塞， 这时应更换滤片或将 其取出进行清洗；另一种可能是大分子进入柱内， 使柱头被污染；如果柱效降低或色谱峰变 形，则可能柱头出现塌陷，死体积增大。在后两种情况发生时，小心拧开柱接头，用洁净小钢将柱头填料取出1"2mm高度（注意把被污染填料取净）再把柱内填料整平。然后用适当 溶剂湿润的固定相（与柱内相同）填满色谱柱，压平，再拧紧柱接头。这样处理后柱效能得 到改善，但是很难恢复到新柱的水平。柱子失效通常是柱端部分，在分析柱前装一根与分析 柱相同固定相的短柱（5"30mm ）