乳腺癌雌激素受体α基因启动子甲基化与其蛋白表达的关系

1、乳腺癌雌激素受体基因启动子甲基化与其蛋白表达的关系         11-04-03 11:05:00     编辑：studa20              作者：布立敬，苏世振，李红智，林蓓蓓，张英俊【摘要】  目的：检测乳腺癌雌激素受体(estrogen receptor， ER)基因启动子区CpG岛甲基化状态，探讨乳腺癌ER启动子

2、甲基化与其蛋白表达及临床病理的关系。方法 ：采用免疫组化EnVisionTM二步法检测20例正常乳腺组织、44例乳腺癌组织ER基因的表达，同时运用甲基化特异性PCR(Methylation-Specific PCR，MSP)及测序法分别检测ER基因启动子A区和B区CpG岛的甲基化状态。结果：32例ER阳性乳腺癌组织中，ER启动子A区、B区甲基化率分别为28.2%和18.8%。12例ER阴性乳腺癌组织中，ER启动子A区、B区甲基化率分别为66.7%和58.3%。ER阳性乳腺癌组、ER阴性乳腺癌组、乳腺癌组的ER启动子A、B区甲基化率均较正常组显著增高(P <0.05)；ER阴性乳腺癌组的E

3、R启动子A、B区甲基化率较ER阳性乳腺癌组均显著增高(P <0.05)。乳腺癌组织ER表达与启动子区甲基化之间呈显著负相关。结论：乳腺癌组织ER基因表达沉默与其启动子A区、B区CpG岛甲基化相关，后者有可能成为乳腺癌预后不良的分子检测指标。 【关键词】  乳腺肿瘤；雌激素受体；DNA甲基化；CpG岛；甲基化特异性PCR    Abstract:  Objective: To detect the methylation of CpG island in estrogen receptor alpha (ER) gene promotor

4、in breast cancer， and study the relationship among ER gene promotor methylation，ER expression，and the clinicopathological characteristics in breast cancer. Methods: The EnVisionTM two-step immunohistochemistry method was used to detect ER gene expression in 20 cases of normal breast tissues and 44 c

5、ases of breast cancer tissues. The methylation of CpG island in ER gene promotor region A and B was respectively detected using methylation-specific PCR (MSP) and sequencing. Results: In 32 cases of ER positive breast cancer tissues， the methylation rates of ER promotor region A and B were 28.2% and

6、 18.8%，respectively; while in 12 cases of ER negative breast cancer tissues， the methylation rates of ER promotor region A and B were 66.7% and 58.3%，respectively. The methylation rates of ER promotor region A and B in ER negative breast cancer tissues， ER positive breast cancer tissues and breast c

7、ancer tissues were significantly higher than that in normal breast tissues (P <0.05). The methylation rates of ER negative breast cancer tissues were significantly higher than that of ER positive cases (P <0.05). A negative relationship was indicated between ER expression and the promotor meth

8、ylation in breast cancer. Conclusion: The silencing of ER gene expression is suggested to be significantly related with the methylation of CpG island in the ER promotor region in breast cancer. The methylation of CpG island may become the molecular marker indicating bad prognosis of breast cancer.&#

9、160;   Key words:  breast tumor；estrogen receptor；DNA methylation；CpG island；MSP    雌激素活体（estroqen receptor，ER）是抗雌激素类药物内分泌治疗的靶点，也是预后的重要指标1-4。ER阴性或表达下调是内分泌治疗失败及预后不良的因素。约1/4乳腺癌组织无ER表达，并且原先ER阳性的乳腺癌患者在肿瘤进程中有1/3转为ER阴性5。有文献报道，ER阴性与基因的变异（如插入、缺失、重组或点突变等）未发现有明确的联系，而DNA甲基化是其表达失活的

10、主要原因之一6。研究显示，启动子异常甲基化在许多肿瘤的发生过程中是一个频发的早期事件，因此肿瘤相关基因的甲基化状态是肿瘤发生的一个早期敏感指标，可以作为一种有前景的肿瘤分子标志物。本研究运用甲基化特异性PCR(Methylation-Specific PCR，MSP)分别检测正常乳腺组织、乳腺癌组织ER基因启动子区CpG岛的甲基化状态，分析乳腺癌ER启动子甲基化与其蛋白表达及临床病理的关系，进一步探讨ER启动子甲基化作为乳腺癌临床诊断和治疗的分子标志物的可能性，为肿瘤去甲基化治疗提供理论依据。    1  材料和方法   

11、1.1  标本来源  由温州医学院附属第一医院病理科提供新鲜组织标本。包括20例正常乳腺组织和44例乳腺癌组织。病理组织学分型(WHO标准)：浸润性癌33例，浸润性小叶癌伴浸润性导管癌1例，黏液腺癌3例，导管内癌5例，髓样癌2例。患者均为女性。年龄2778岁，平均(48.7±8.9)岁。    1.2  免疫组化EnVisionTM二步法  抗ER抗体和通用型二步法检测试剂盒均为北京中杉金桥生物技术有限公司产品。染色操作按照试剂盒说明书进行。以PBS代替一抗为空白对照。以试剂盒中提供的已知阳性片为阳性对照。ER阳性

12、物质(棕黄色)位于胞核。每张切片随机选择10个高倍视野，每个视野随机观察100个细胞，计算其中阳性细胞比例(阳性细胞按染色棕褐、棕黄、浅黄分别乘以系数1、2/3、1/3来计算数目)。ER阳性细胞比例10%计作阳性。    1.3  DNA提取  新鲜组织标本，经蛋白酶K消化，酚、氯仿、异戊醇法提取DNA，并测定DNA浓度和含量。    1.4  DNA亚硫酸氢盐修饰  加热变性，NaHSO3修饰，透析除盐，沉淀，溶解等操作方法参见文献7。DNA经亚硫酸氢盐修饰后，CpG岛中的非甲基化胞嘧啶(C)

13、转变为尿嘧啶(U)，经PCR 扩增后转变为胸腺嘧啶(T)；而CpG岛中的甲基化胞嘧啶(mC)仍保留为胞嘧啶。CpG岛以外序列中的胞嘧啶(C)均转变为尿嘧啶(U)，经PCR扩增后均为胸腺嘧啶(T)。    1.5  PCR扩增ER基因    1.5.1  引物、主要试剂和仪器：ER基因序列号为NM_000125。各个引物序列详见参考文献8。均由上海生物工程公司合成。野生型引物W扩增未修饰的启动子区。非甲基化引物U、甲基化引物M分别扩增经修饰后的非甲基化和甲基化启动子区。Taq DNA聚合酶购自大连宝生物公司，PxZ型

14、PCR扩增仪为Thermo Hybaid公司产品，BioSens SC 620型紫外凝胶分析系统为上海山富科学仪器有限公司产品。    1.5.2  PCR反应体系、反应程序及结果观察：50L的反应体系含MgCl2 2.0 mmol/L、正向引物和反向引物0.8mol/L、四种dNTP每种终浓度0.4 mmol/L、TaqDNA聚合酶0.5 U、DNA模板1g。反应条件：预变性95 5 min；变性95 30 s，退火(温度、时间详见参考文献8)，72 1 min，40个循环；72 8 min延伸。PCR产物经琼脂糖凝胶电泳，紫外凝胶分析系统观察拍照。&

15、#160;   1.6  PCR产物直接测序  提供启动子A、B区非甲基化引物和甲基化引物的PCR产物，由大连宝生物技术有限公司纯化和直接测序。    1.7  统计学处理方法  率的比较采用x2检验，根据x2值计算Pearson列联系数。    2  结果    2.1  ER蛋白表达情况  正常乳腺组织ER阳性表达率为100.0%(20例/20例)。乳腺癌ER表达的免疫组化结果见图1，ER阳性表达率为72.7%(

16、32例/44例)。乳腺癌较正常乳腺组织的ER蛋白表达显著降低(P <0.05)（见表1）。    2.2  ER基因启动子区甲基化情况  野生型引物(W)、非甲基化引物(U)和甲基化引物(M)的PCR扩增结果见图2。未修饰DNA的野生型引物(W)的PCR扩增结果，20例正常乳腺组织和44例乳腺癌组织均有扩增产物出现。正常组织、乳腺癌组织ER启动子A、B区甲基化率(%)见表1。    随机各挑选一个修饰后DNA的A区和B区甲基化引物扩增产物，进行正向和反向直接测序。正向测序结果的后段和反向测序结果的后段（实际前

17、段）除个别位点外均和预期序列一致，如A区甲基化引物扩增产物正向测序结果49、63位与预期序列不一致，但这两个位点的反向测序结果与预期序列一致。综合正反双向测序结果与预期甲基化序列完全一致。正向测序结果中，CpG岛处所有胞嘧啶C保留不变，CpG岛以外的所有胞嘧啶C均已转变为胸腺嘧啶T。反向测序结果中，CpG岛处对应的鸟嘌呤G保留不变，CpG岛以外的所有鸟嘌呤G均已转变为腺嘌呤A。    2.3  乳腺癌ER基因启动子A、B区甲基化与ER蛋白表达的关系  ER阳性乳腺癌组、ER阴性乳腺癌组、乳腺癌组的ER启动子A、B区甲基化率均较正常组的显著增加(P <0.01，见表1)；ER阴性乳腺癌组的ER启动子A、B区甲基化率较ER阳性乳腺癌组均显著增加(P <0.05，见表1)，乳腺癌组织ER表达与启动子甲基化之间呈显著负相关（A区