Arg9-人抗HBsAg单链抗体-EGFP融合蛋白基因的构建、表达及活性分析

1、Arg9/人抗HBsAg单链抗体/EGFP融合蛋白基因的构建、表达及活性 分析作者：薛茜，温伟红，孟艳玲，张勇，张巍，王涛，张瑞，杨安钢【关键词】 肝炎,乙型；肝炎表面抗原,乙型；ScFv; Arg9【Abstract 】AIM: To con struct R9/ScFv14/EGF P fusi on genes andto an alyze the binding activity of the fusi on p rote ins after they were exp ressed in BL21. METHODS: A series of olig onu cleotide p r

2、imers were desig ned and used to amplify the genes of ScFv14 and R9/ScFv14. The PCR p roducts were cloned into p MD18T vector, followed by DNA seque ncing. R9/ScFv14 gene and ScFv14 gene were ligated with EGF P gene res pectively before they were rebined into the expression vector pET32a. After indu

3、ced in BL21 by IPTG, the expressed fusion proteins namedR9/ScFv14/EGFPand ScFv14/EGFFwere detected by SDSPAGfind the binding activity of them were an alyzed by in direct ELISA.RESULTSRestrictio nendonu clease digesti onand DNA seque ncing pro ved that the two fusi on genes were correctly con structe

4、d. SDS PAGE an alysis showed that they were successfully expressed in BL21 and the percentages of them were 20%and 25%of total bacteria p rotei ns res pectively .In direct ELISA con firmed that the expressed products had antigen specific binding activity. CONCLUSIONhe two fusion genes were construct

5、ed successfully. And the products of them exp ressed in BL21 main tai ned the bi ndi ng activity to HBsAg.【Keywords! hepatitis B;hepatitis B surfacean tige ns;ScFv; Arg9【摘要】目的：构建带有转膜结构域Arg9编码序列的R9/ScFv14/EGFP融合基因，将其转化入大肠杆菌中进行表达，并分析表达产物 与HBsAg的结合活性.方法：设计引物，将Arg9的编码序列引入单链抗体基因的5'端，PCRT增后获得带有Arg9编码序

6、列的ScFv14基因，将PCR产物连 入PMD18T载体，进行序列测定.将测序正确的ScFv14基因和R9/ScFv14基因分 别与EGFPS因连接后转化入原核表达载体 pET32a获得ScFvM/EGFP和 R9/ScFv14/EGFP两种融合基因的表达载体，转化大肠杆菌BL21(DE3)LysS,以IPTG诱导表达，对表达产物进行 SDSPAG分析，并用间接ELISA方法检测其与 HBsAg的亲和活性.结果：经酶切鉴定及测序证实ScFv14/EGFP融合基因和R9/ScFv14/EGFF融合基因序列完全正确.SDSPAG分析表明两种融合基因在大肠 杆菌BL21中成功获得表达，表达量分别占菌

7、体总蛋白的20%和25%间接ELISA 检测证实所表达的ScFv14/EGFP融合蛋白和R9/ScFv14/EGFP融合蛋白均具有 HBsAg吉合活性.结论：成功构建了带有转膜结构域Arg9编码序列的 R9/ScFv14/EGFP融合基因，并在大肠杆菌 BL21中成功表达，表达产物 ScFv14/EGFF和R9/ScFv14/EGFP均具有与抗原HBsAg特异性结合的活性.【关键词】 肝炎，乙型；肝炎表面抗原，乙型；ScFv; Arg90引言单链抗体（ScFv）是抗体重链可变区（VH）与轻链可变区（VL）通过一段连 接肽（linker）连接而成的一种小分子抗体.其分子质量仅为完整抗体的1/6，

8、不 仅能较好地保持抗原结合能力，并且具有分子质量小、穿透力强、半衰期短、免 疫原性低、制备流程简单等特点，更有利于体内应用1-3 .绿色荧光蛋白（green fluoresce nt p rotei n,GFP）是从水母中分离出来的一种发光蛋白，可在A450nm-490 nm的蓝光激发下发出绿色荧光，使用普通荧光显微镜即可进行观察.是近年来细胞生物领域中应用最为广泛的标记性蛋白质之一.EGF P为一种突变型GFP所产生的荧光比野生型GFP增强，可作为标签用于检测目的蛋白及指示目的蛋白的定位.ScFv与效应分子组成的融合蛋 白能否高效地内化入细胞对于其生物学功能的发挥具有非常关键的作用.Arg9

9、是一个九聚精氨酸的短肽序列，是蛋白转膜结构域（Ptds的一种，它能够将与 之融合的蛋白携带入细胞内4.我们将抗HBsAg的单链抗体（ScFv14）基因5与EGFPS因融合，并将Arg9编码序列融合到ScFv14/EGFP基因的5'端， 构建带有转膜结构域Arg9的R9/ScFv14/EGFP融合蛋白基因，将它们在大肠杆菌 中进行诱导表达，并对表达产物的亲和活性进行了分析 .1材料和方法材料含有编码人抗HBsAg单链抗体ScFv14基因的载体pUC19ScFv14大肠杆菌a株和原核表达载体PET32a（第四军医大学生物化学与分子生物学教 研室构建5并保存）;EGFP融合蛋白表达载体PEG

10、FPN3Clontech公司）;DNAMarker, T4 DNALigase, pMD18T/ector 和限制性内切酶 BamH , EcoRI , Not I（TaKaRa公司）；质粒提取试剂盒、胶回收试剂盒（上海华舜公司）；Werstern blot 显影液（Pierce公司）.方法引物的设计与合成根据ScFv14基因序列，设计引物扩增ScFv14基因， 并设计引物将Arg9的编码序列引入ScFv14基因的5'端，引物序列如下：14F5'TTTGAATTCATGGAGGTGCAGCTGGTGQAG4R9F 5'TTTGAATTCATGAGACGCAGGAGACG

11、CAGGCGGAGACGGGAGGTGCAGCTGGTGGAGTC 3 tttggatcctcgattgatttccaccttgGT中划线部分为九聚精氨酸的编码序 列.重组质粒的构建与鉴定以PUC19ScFvl4模板，分别以14F, L3和14R9F, L3为引物扩增ScFv14基因和R9/ScFv14基因.反应条件：95E 35 s ,55E 45s, 72E 1 min ,共进行25个循环.产物进行10 g/L琼脂糖凝胶电泳,胶回收试 剂盒回收.回收产物分别连入PMD18T载体,转化a宿主菌，挑取单克隆,提取质 粒进行酶切鉴定，阳性克隆命名为 PMD18TScFv1和PMD18TR9/Sc

12、Fv14送北京 三博远志生物技术公司测序.将测序正确的PMD18TScFv1和PMD18TR9/ScFv14 用限制性内切酶EcoRI和BamH进行酶切，得到ScFv14和R9/ScFv14基因片段， 将pEGFPN用BamH和Not I酶切，得到EGFPS因片段.分别将ScFv14和 R9/ScFv14基因与EGFPS因在16E条件下连接4 h后，再连入经EcoRI和Not I 酶切的表达载体pET32a中，转化a后，筛选阳性克隆酶切鉴定.鉴定正确的质 粒分别命名为 PET32aScFv14/EGF和 pET32aR9/ScFv14/EGFP.融合基因的诱导表达及鉴定将 P ET32aScF

13、v14/EGF和 pET32aR9/ScFv14/EGF质粒分别转化入E .，挑取单克隆菌落接种于含有氨苄青 霉素的LB培养基中，220 r/min，37E培养过夜，次日以1 : 100转接，在220 r/min, 37E条件下振荡培养至 A600 nmA，加入IPTG至终浓度为1 mmol/L, 诱导培养3 h,取1 mL诱导菌液离心，收集菌体，进行 SDSPAG分析.另取5 mL 诱导菌液离心，收集菌体，以 mol/L的TrisHCl(pH=)重悬，超声裂解后，离心 取上清，沉淀用 mol/L TrisHCl(pH=) 重悬，取上清和沉淀进行 SDSPAG分析.重组融合蛋白的Western

14、 blot分析将诱导菌进行SDSPAG分离蛋白质， 用半干式电转仪将凝胶中的蛋白质转移到硝酸纤维素膜(NC上，经50 g/L的脱脂奶粉封闭1 h，用鼠抗EGFP mAlb1 : 1000稀释)，4E孵育过夜，用TBST 洗膜6次，每次5 min,再加入辣根过氧化酶HRP标记的山羊抗小鼠IgG，室温孵 育1 h,用TBST洗膜6次，每次5 min,按显影液说明加入显影液，用化学发光 法进行检测.融合蛋白亲和活性的ELISA检测用5 mg/L HBsAg包被ELISA板，每孔 100卩L, 4 E过夜.加入不同稀释度的细菌裂解上清，每孔100卩L, 37 E孵育1 h.设空白和阴性对照.洗涤后，加

15、入鼠抗EGFP mAlb 1 ： 1000稀释)，37 E孵育 1 h.洗涤后再加入辣根过氧化酶 HRP标记的山羊抗小鼠IgG, 37E孵育1 h.最后各孔加入新鲜配制的ABTS显色液100卩L, 37C孵育30 min,终止反应.以 酶标仪测定各孔A410 nm值.2结果目的基因扩增和酶切鉴定PCR产物经10 g/L琼脂糖凝胶电泳证实分别扩增出大小约为750 bp和780 bp的条带（图1A）.测序结果证实扩增的ScFv14 和R9/ScFv14基因完全正确.用EcoRI和BamH双酶切鉴定，得到大小约为750 bp和780 bp的条带，与预期长度相符（图1B）.原核表达载体的酶切鉴定重组载

16、体 P ET32aScFv14/EGF 和PET32aR9/ScFv14/EGF用限制性内切酶 EcoRI和BamH双酶切ScFv14和 R9/ScFv14基因，分别得到大小约为 750 bp和780 bp的条带；用EcoRI和Not I 双酶切融合蛋白基因，分别得到大小约为1490 bp和1520 bp的条带，与预期长度相符（图2）.重组融合蛋白表达的鉴定和分析 SDS PAG分析显示，与未诱导菌相比， 两种诱导菌在Mr约为73 ku处均有一特异性蛋白条带，同预期的大小相符.经凝 胶成像系统扫描显示，它们的表达量分别约占菌体总蛋白的 20%和25%（图3）. 取IPTG诱导后的菌液进行超声裂

17、解，分别取其裂解上清和沉淀进行SDSPAG分析，电泳结果显示两种目的蛋白均主要存在于诱导菌的裂解上清中（图4）.重组融合蛋白的 Western blot分析在Mr约为73 ku处有一特异性蛋白 条带（图5），与 SDSPAG分析结果相符，说明该诱导蛋白为目的蛋白.融合蛋白亲和活性的ELISA检测间接ELISA检测结果显示表达的两种ScFv14/EGFF融合蛋白均能与HBsAg抗原特异性结合（图6）,二者相比， R9/ScFv14/EGFP与HBsAg的亲和力稍大于 ScFv14/EGFP与 HBsAg但不具有统 计学意义（P）.5:2，4:未诱导的pET32a和pET32aR9/ScFv14/

18、EGF啲全菌蛋白质；3，IPTG 诱导的 PET32a和 pET32aR9/ScFv14/EGFPl勺全菌蛋白质.B1:marker ; 2 ,4:未诱导的 pET32a和 pET32aScFv14/EGF的全菌蛋白质；3, 5:IPTG 诱导的 pET32a和 pET32aScFv14/EGF的全菌蛋白质.3讨论天然Fv片段中VH和VL为非共价性结合，是抗体分子中保留抗原结合 部位的最小功能片段.将VH和 VL用一个小肽（linker）连接起来，即单链抗体.单 链抗体易与效应分子相连，与其他蛋白融合，可得到具有多种生物学功能的融合 蛋白.近年来，以单链抗体为导向物的免疫融合蛋白在抗肿瘤、抗病

19、毒等的治疗和诊断方面展现了广阔的前景，引起了人们的广泛关注.由单链抗体与毒素、酶、 细胞因子等的基因相连的免疫融合蛋白， 可以结合到特定的靶部位，高效的发挥 生物学功能6-7 :.蛋白转膜结构域（PTDS是一类能够介导与之融合的蛋白内化入细胞的 短肽.它们作为内化的工具被广泛应用，它不仅可以使多肽、多聚核苷酸、极小 微粒进入细胞，甚至可以在体内介导蛋白质的内化8 . Futaki等9发现 多种富含精氨酸的肽都具有转膜作用.在比较了不同长度的多聚精氨酸对内化效 率的影响之后，他们发现八聚精氨酸（Arg8）的内化效果最好.Wender等: 10发现Arg9具有更高效的内化作用.我们采用转膜结构域A

20、rg9来增强融合蛋白的 转膜功能，以期使产物具有更高的内化效率.我们构建了带有转膜结构域Arg9的R9/ScFv14/EGFF融合基因表达载体， 并将该表达载体在E .中进行诱导表达，SDSPAG分析表明融合蛋白在大肠杆菌 中成功表达，并且主要在大肠杆菌的上清中表达，这就避免了变性复性的复杂过程，直接就可以获得具有生物学功能的活性蛋白.间接ELISA检测也证实融合有 Arg9的ScFv14/EGFF融合蛋白与不带有 Arg9的ScFv14/EGFF融合蛋白对 HBsAg 具有相近的亲和活性.这为进一步研究Arg9对免疫融合蛋白内化的促进作用以 及为乙型病毒性肝炎的靶向治疗研究提供了实验基础.【

21、参考文献】1 Kasuya K, Boyer JL, Tan Y, et al.Passive immunotherapyfor an thrax tox in mediated by an ade no virus exp ress ing an an ti protective antigen singlechain antibodyJ . Mol Ther, 20XX,11(2):237-244.2 Neve RM, Nielsen UB, Kirpotin DB, et al. Biological effects of antiErbB2 single chain antibodie

22、s selected for internalizingfunctionJ . Biochem Biophys Res Commun, 20XX,280(1):274-279.3 Rosana B, Michel M, accumulation of the antiCD20 antibody Cancer Res, 20XX,8(8):2701-2713.4 Hea D,&In tracellularJules Mattes.1F5 in BlymphomacellsJ . ClinArg9 pep tide facilitates thenbsp; Yangb H, Lina Q,

23、 et al.in ternalizatio n of an an tiCEA immun otoxin and poten tiates its sp ecific cytotoxicity to target cellsJ . Int J Biochem Cell Biol,20XX,37(1):192-205.5 Wen WH, Zhao J, Yu CJ, et al. Construction of singlechainFv Geneof AntiHBsAg and its expression in COSTCellsJ . Chin J CellMol Immunol, 20XX,19(2) :163-167.hain6 Sch nell R, Vitetta E, Schi ndler J, et al. Treatme nt of refractory Hodgkin ' s lymphoma patients with an antiCD25 ricin Ac immunotoxin J . Leukemia, 20XX,14